医学检验实验课ppt课件
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• 定量加样器 • 微量吸头 • 滤纸 • 37℃恒温水浴箱 • 洗板机 • 酶标仪
ppt课件.
19
实验准备：
• 取出试剂盒，室温平衡30分钟 • 配制洗涤液（1：25倍稀释） • 样本血清制备：用真空采血管
抽取空腹静脉血5mL，静置15分 钟后，以3500转/分, 离心5分钟, 分离血清备用。
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16
实验材料：
• 乙型肝炎病毒检测试剂盒
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17
试剂盒:
• 微孔反应板（48人份） • 酶结合物（6.2 mL *1瓶） • 阳性对照（1.0 mL *1瓶） • 阴性对照（1.0 mL *1瓶） • 洗涤液（40 mL *1瓶） • 显色剂A（8.0 mL *1瓶） • 显色剂B（8.0 mL *1瓶） • 终止液（7.0 mL *1瓶） • 封片（2张） • 说明书（1份）
2.是检测抗原最常用的方法。
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10
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11
二）间接法
• 标本中的待检抗体与固相抗原结合后，利
用酶标记抗抗体（抗人Ig）进行检测。
• 是检测抗体的最常用方法
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12
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13
三）竞争法
• 将待检抗原和酶标抗原与相应固相抗体竞
争结合，标本中抗原越多，与固相抗体结 合的酶标抗原越少，与底物反应生成的颜 色越浅，根据颜色深浅可定性或定量测定。
• 每次洗板要甩干微孔里的残液，避免残余
游离酶标记物显色干扰读数。
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22
实验第三步：
• 每孔先加入显色剂A液1滴（50微
升），再加入B液1滴（50微升）， 充分混匀
• 封板，置37℃水浴箱孵育15分钟。
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23
实验第四步：
• 每孔加入终止液1滴（50微升），混匀。 • 终止液为强酸溶液，使酶蛋白变性，终止
6
ELISA反应材料：
• 固相载体：聚苯乙烯或聚氯乙烯
有较强的蛋白吸附性能
• 酶标记物：标记抗原或抗体的酶常选择
辣根过氧化物酶（HRP）
• 酶底物： 四甲基联苯胺（TMB）
受酶作用后呈蓝色
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7
• ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学
反应的基础上，因而，具有特异性。
• 而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分
临床免疫学检查
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1
实验内容：
• 乙型肝炎病毒(HBV)血清学标志物检查
• HBsAg-乙型肝炎病毒表面抗原 • HBsAb -乙型肝炎病毒表面抗体 • HBeAg -乙型肝炎病毒e抗原 • HBeAb -乙型肝炎病毒e抗体 • HBcAb -乙型肝炎病毒核心抗体
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2
实验要求：
子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化 底物分子发生反应，产生放大作用，使本法 具有很高的敏感性。
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8
反应类型
酶标记抗体
• 夹心法
抗体
• 间接法
• 竞争法
包被抗原
• 捕获法
• 应用生物素-亲和素系统的ELISA
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9
一)双抗体夹心法
1.将已知抗体包被微量反应板，和待检 抗原反应，再加酶标抗体和底物，根 据显色反应对抗原进行定性或定量。
判定阳性结果的最低OD值
• COV：计算出的Cutoff值 • S/CO：样本吸光度/COV
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29
• Cutoff值计算：
COV=阴性对照平均OD值×2.1
• 标本OD值≥COV为阳性； • 标本OD值＜COV为阴性； • 阴性对照OD值低于0.05作0.05计算，
高于0.05按实际OD值计算
• 掌握酶联免疫的检测原理 • 了解试剂盒的使用 • 掌握乙型肝炎病毒标志物检
测结果的临床意义
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3
实验原理：
• 酶联免疫检测（ELISA）
– ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
– 它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的 一种免疫酶技术。
• 可用于测抗原，也可用于测抗体
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15
• ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已
成功地应用于多种病原微生物所引起的传染 病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。 也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量 测定，根据已经使用的结果，ELISA法具有 灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动 化操作等特点。
– 此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速， 目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
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4
• ELISA是以免疫学反应为基础， • 抗原、抗体的反应在固相载体──聚苯乙烯微量滴定板
的孔中进行，
• 微孔对蛋白有很好的吸附作用，（试剂盒已经包埋好
相应的抗原、抗体蛋白成分）
• 每加入一种试剂孵育反应后，多余的游离反应物可洗
涤除去，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
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5
反应过程：
• 包被：将已知抗体或抗原通过物理吸附结合到固相
载体表面使其固相化
• 抗原抗体反应：加入被检标本和酶标记物，使之与
固相抗体或抗原发生免疫反应而被结合固定，经洗 涤除去游离的酶标记物
• 酶促反应：加入酶底物，使之发生酶促反应而显色。
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20
实验第一步：
• 每盒试验需设阳性对照2孔，阴性对照2
孔， 空白对照1孔
• 每孔中加入待测标本50微升 • 除空白孔外每孔加入酶结合物50微升 • 封板 • 置37 ℃恒温孵育30分钟
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21
实验第二步：
• 洗板 • 手工洗板：首先弃去孔内液体，分别各孔
注满洗涤液，静置2分钟，甩干，重复5次 后拍干。
的有（无）或含量（定量）。
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接收器
透光板
光源
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27
仪器读数：
• 酶标仪读数：先用空白孔校零，再用
波长450nm（建议使用双波长的酶标 仪比色，参考波长630nm）读取各孔 OD值。
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28
仪器读数：
酶标仪参数：
• OD值：样本的吸光度 • Cutoff值：厂家设定的此批试剂盒
酶促反应，故加样时应注意。
• 目视读数。
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24
目视读数：
– TMB在酶的作用下呈蓝色， – 加入终止液（稀硫酸）后变黄，
• 反应孔颜色深浅同阳性对照孔颜色
比较
• 颜色相同或接近判定为阳性， • 颜色相差区别大判定为阴性。
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显色系统：
• 在450nm波长有最高吸收峰， • 通过颜色变化及呈色深浅来推断检测对象
• 定量加样器 • 微量吸头 • 滤纸 • 37℃恒温水浴箱 • 洗板机 • 酶标仪
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实验准备：
• 取出试剂盒，室温平衡30分钟 • 配制洗涤液（1：25倍稀释） • 样本血清制备：用真空采血管
抽取空腹静脉血5mL，静置15分 钟后，以3500转/分, 离心5分钟, 分离血清备用。
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实验材料：
• 乙型肝炎病毒检测试剂盒
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试剂盒:
• 微孔反应板（48人份） • 酶结合物（6.2 mL *1瓶） • 阳性对照（1.0 mL *1瓶） • 阴性对照（1.0 mL *1瓶） • 洗涤液（40 mL *1瓶） • 显色剂A（8.0 mL *1瓶） • 显色剂B（8.0 mL *1瓶） • 终止液（7.0 mL *1瓶） • 封片（2张） • 说明书（1份）
2.是检测抗原最常用的方法。
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二）间接法
• 标本中的待检抗体与固相抗原结合后，利
用酶标记抗抗体（抗人Ig）进行检测。
• 是检测抗体的最常用方法
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ppt课件.
13
三）竞争法
• 将待检抗原和酶标抗原与相应固相抗体竞
争结合，标本中抗原越多，与固相抗体结 合的酶标抗原越少，与底物反应生成的颜 色越浅，根据颜色深浅可定性或定量测定。
• 每次洗板要甩干微孔里的残液，避免残余
游离酶标记物显色干扰读数。
ppt课件.
22
实验第三步：
• 每孔先加入显色剂A液1滴（50微
升），再加入B液1滴（50微升）， 充分混匀
• 封板，置37℃水浴箱孵育15分钟。
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23
实验第四步：
• 每孔加入终止液1滴（50微升），混匀。 • 终止液为强酸溶液，使酶蛋白变性，终止
6
ELISA反应材料：
• 固相载体：聚苯乙烯或聚氯乙烯
有较强的蛋白吸附性能
• 酶标记物：标记抗原或抗体的酶常选择
辣根过氧化物酶（HRP）
• 酶底物： 四甲基联苯胺（TMB）
受酶作用后呈蓝色
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• ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学
反应的基础上，因而，具有特异性。
• 而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分
临床免疫学检查
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实验内容：
• 乙型肝炎病毒(HBV)血清学标志物检查
• HBsAg-乙型肝炎病毒表面抗原 • HBsAb -乙型肝炎病毒表面抗体 • HBeAg -乙型肝炎病毒e抗原 • HBeAb -乙型肝炎病毒e抗体 • HBcAb -乙型肝炎病毒核心抗体
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实验要求：
子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化 底物分子发生反应，产生放大作用，使本法 具有很高的敏感性。
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反应类型
酶标记抗体
• 夹心法
抗体
• 间接法
• 竞争法
包被抗原
• 捕获法
• 应用生物素-亲和素系统的ELISA
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一)双抗体夹心法
1.将已知抗体包被微量反应板，和待检 抗原反应，再加酶标抗体和底物，根 据显色反应对抗原进行定性或定量。
判定阳性结果的最低OD值
• COV：计算出的Cutoff值 • S/CO：样本吸光度/COV
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• Cutoff值计算：
COV=阴性对照平均OD值×2.1
• 标本OD值≥COV为阳性； • 标本OD值＜COV为阴性； • 阴性对照OD值低于0.05作0.05计算，
高于0.05按实际OD值计算
• 掌握酶联免疫的检测原理 • 了解试剂盒的使用 • 掌握乙型肝炎病毒标志物检
测结果的临床意义
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实验原理：
• 酶联免疫检测（ELISA）
– ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
– 它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的 一种免疫酶技术。
• 可用于测抗原，也可用于测抗体
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• ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已
成功地应用于多种病原微生物所引起的传染 病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。 也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量 测定，根据已经使用的结果，ELISA法具有 灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动 化操作等特点。
– 此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速， 目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
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• ELISA是以免疫学反应为基础， • 抗原、抗体的反应在固相载体──聚苯乙烯微量滴定板
的孔中进行，
• 微孔对蛋白有很好的吸附作用，（试剂盒已经包埋好
相应的抗原、抗体蛋白成分）
• 每加入一种试剂孵育反应后，多余的游离反应物可洗
涤除去，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
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反应过程：
• 包被：将已知抗体或抗原通过物理吸附结合到固相
载体表面使其固相化
• 抗原抗体反应：加入被检标本和酶标记物，使之与
固相抗体或抗原发生免疫反应而被结合固定，经洗 涤除去游离的酶标记物
• 酶促反应：加入酶底物，使之发生酶促反应而显色。
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实验第一步：
• 每盒试验需设阳性对照2孔，阴性对照2
孔， 空白对照1孔
• 每孔中加入待测标本50微升 • 除空白孔外每孔加入酶结合物50微升 • 封板 • 置37 ℃恒温孵育30分钟
ppt课件.
21
实验第二步：
• 洗板 • 手工洗板：首先弃去孔内液体，分别各孔
注满洗涤液，静置2分钟，甩干，重复5次 后拍干。
的有（无）或含量（定量）。
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接收器
透光板
光源
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仪器读数：
• 酶标仪读数：先用空白孔校零，再用
波长450nm（建议使用双波长的酶标 仪比色，参考波长630nm）读取各孔 OD值。
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仪器读数：
酶标仪参数：
• OD值：样本的吸光度 • Cutoff值：厂家设定的此批试剂盒
酶促反应，故加样时应注意。
• 目视读数。
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目视读数：
– TMB在酶的作用下呈蓝色， – 加入终止液（稀硫酸）后变黄，
• 反应孔颜色深浅同阳性对照孔颜色
比较
• 颜色相同或接近判定为阳性， • 颜色相差区别大判定为阴性。
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显色系统：
• 在450nm波长有最高吸收峰， • 通过颜色变化及呈色深浅来推断检测对象