现阶段天然产物分离方式解析

现阶段天然产物分离方式解析
天然产物研究背景:天然产物是人类预防和治疗疾病的重要来源，不仅世界各种传统医药学中使用的药物均属于天然来源的物质，即使现在医药应用的化学药物中天然来源的化合物也超过了30%，还有更多的药物是以天然产物为先导化合物经过结构修饰和结构改造产生的。

目前国外天然产物作为药物主要有两类：一类是单体成分，如吗啡、麻黄碱、青蒿素、东莨菪碱、利血平、青霉素、紫杉醇等；另一类是某一类混合成分，如银杏叶制剂等。

根据Newman等人的综述报道，1981-2002年间全世界推出的877个药物小分子新化学实体中，约有61%来源于天然产物或受天然产物的启发而合成的衍生物或类似物，而具体在抗菌药物和抗肿瘤药物方面，天然产物来源的药物更是分别高达78%和74%。

自然界中数量庞大的生物永远是人类开发新药的源泉。

天然产物的研究与开发是一个复杂而富有挑战的艰苦工作，有报道称开发一个药物目前平均需要10年的时间、8亿美元的投入和筛选至少5000个化合物。

目前大约有100个来源于天然产物的候选药物在进行临床和临床前研究，相信在不远的将来会有更多更好的天然药物造福人类。

要从天然产物中筛选出新药，首先需要有基数庞大的候选天然产物，而我们面对的是非常复杂的动植物体系，比如从各种植物动物中提取的天然产物提取物，一般由成千上万的化合物所组成，其复杂性体现不但体现在化合物个数多，还在于分子量范围跨度大，浓度水平跨度大。

此类混合物中特定化合物，特别是低含量的化合物分离是目前面
临的巨大的挑战，分离难度非常困难，常常要耗费大量人力物力，因此分离成为整个研究过程的瓶颈。

现阶段天然产物分离方式:为了解决从复杂植物此生代谢产物中分离结构独特或者药理活性显著的天然化合物，经过上百年的探索与发展，药学家、植物化学家发展了很多种植物化学成分系统分离策略，将混合物中的化合物一个一个的分离出来，并进行结构鉴定，化学性质研究，以及药效研究。

模式1 .基于粗放的层析技术的分离方式
吸附层析法的分离原理是根据物质在吸附剂上的吸附力不同而得到分离，一般情况下与吸附剂相近的物质易被吸附剂吸附，反之不易被吸附剂吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。

层析技术依据吸附剂的差异可以分为硅胶柱层析、氧化铝柱层析、大孔树脂，活性炭柱层析、聚酰胺柱层析、硅酸镁柱层析、硅藻土柱层析等。

上述这些层析技术在植物化学研究中都起到了非常重要的作用，由于分离选择性好，价格经济合理，目前大部分研究课题组植物化学分离纯化过程仍然全部或者大部分采用硅胶柱层析或者氧化铝柱层析。

该方式沿用传统的方式，将溶剂萃取后的萃取组分进行大硅胶柱粗略分段，然后再用较小的硅胶柱结合对粗分的段进行细分段，依次直到得到单体。

经过数十年的使用，硅胶等正相色谱仍为研究者所采用，其中有其本身的优势，分离选择性好，填料较便宜，一次性使用，硅胶对环境危害较小，废弃物处理方便。

但是传统层析方式所面临的缺陷也一直为研究者所诟病，层析速度通常较慢，造成层
析填料对化合物吸附较大，目标物损失较大。

大量有机溶剂挥发到空气中造成严重的环境污染，操作间中狭窄的空间有机溶剂浓度过高给操作者带来极大的伤害，也带来了安全隐患。

以至于药学专业学生谈植化色变，恶劣的工作环境极大的阻碍优秀人才进入该研究领域。

目前对这种传统的也有一些改进，在实际操作上，增加了诸如反相硅胶层析技术，凝胶分离技术等新分离模式。

大大改善分离效果，提升了分离能力，由于这些技术属于较为粗放的分离方式，填料颗粒较粗，人工填柱子，因此仍然面临着分离过程粗放，可控性差，分离可视化程度低，溶剂污染严重问题。

模式2 . 基于高效分离技术的分离方式
随着科学技术的发展，逐渐出现了一些新型自动化，仪器化的高效分离技术，比如制备液相色谱，逆流色谱，超临界色谱等。

这些技术的出现给复杂体系分离带来了前所未有的革命，使得分离更高效，且实现了分离过程的可视化。

制备高效液相色谱（Preparative high performance liquid chromatography）技术高效液相色谱技术是目前除了高效毛细管电泳技术之外分离效率最高的分离技术，由于毛细管电泳技术不适合于分离规模的放大，多用于分析，鲜有用于分离纯化的报道。

植物化学成分的复杂性使得具有卓越分离能力的制备液相色谱技术大有用武之地，样品只需要经过提取，过滤既可以直接进行分离纯化。

该方法具有极高的效率，配备合适的检测器，如二极管阵列或者质谱检测器，甚至可以在线进行结构鉴定。

随着经济的发展，越来越多的单位开始
购买制备液相色谱，很快开始应用于各种复杂的植物成分分离纯化上，并取得了很好的效果。

对于绝大多数研究组来说，采用这种方式存在诸多限制性因素，由于天然化合物的深入开发对化合物的量有一定要求，特别是对于具有较好活性的单体，制备量要求更大，甚至于达到公斤级，但是复杂的原料提取物中的大分子以及吸附能力强的杂质容易堵塞填料表面的孔道以及填料之间的孔道，因此反复使用粗提原料进样使得分离填料容易被污染以至于失去分离能力，从而缩短分离柱寿命。

另一方面，要利用制备液相色谱快速制备化合物必须提高设备的规格，但是设备价格一般与设备的规格成正比，国产直径为50 mm 直径轴向加压色谱系统价格在二十万以上，进口的同规格设备则价格翻番。

其次，填料价格昂贵，根据填料品牌不同，价格在1万到数万元不等，在使用制备液相时，所用的溶剂消耗和维护费用也是十分巨大的，这一系列因素，使得这一先进技术目前难以广泛普及。

高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography ，HSCCC ）是20 世纪80 年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术，它利用不互容的两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相保留在系统中作为固定相，另一相作为流动相，流动相持续流过系统进行洗脱，混合物在固定相和流动相之间反复分配，依据分配系数差异大小实现分离。

它的固定相和流动相都是液体，不需要固体支撑体，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，特别适合于天然生物活性成分的分离，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和
化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术；适合于中小分子类物质的分离纯化。

它相对于传统的固—液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。

HSCCC能采用多种多样的溶剂系统对任何极性范围的样品进行分离，能实现从微克、微升量级的分析分离到上百毫克、数克量级的制备提纯，由于无固定的固定相，不担心污染问题，适用于未经严格处理的大量粗制样品的中间级分离，非常适合于天然产物有效成分的分离，应用前景十分广阔。

美中不足的是溶剂系统的选择对于HSCCC 分离十分关键。

到目前为止溶剂系统的选择还没有一套可靠的理论，而是只能根据实际积累的丰富经验来选择，这极大限制了这一功能强大的技术在天然产物分离分析中的普及应用。

这些新型高效的分离的广泛应用使得植物化学的研究推进到前所未有的广度与深度，日益成为当今植物化学研究中不可或缺的手段。

不过值得注意的是目前中国仍然属于发展中国家，大部分研究机构和高校实验室研究经费仍然有限，如果全部都基于这些高效分离设备，难以负担起这些设备高昂的购买以及日常运行经费，势必造成难以形成规模化生产。

因此，全面推广此类高投入新技术仍然存在一定困难。

模式3. 通过有效的结合传统粗分离技术和高效新技术的分离方式传统柱层析技术特别是硅胶柱层析，填料价格便宜，不重复使用，使得其具有处理量大，不担心填料被污染，粗分离效果好，具备新技术不具备的优势之处，而新型高效分离技术，诸如高效液相制备
色谱，高速逆流色谱等，因其高效，重复性好，产品纯度高而日益成为将来发展的必然趋势。

对于天然产物研究中超复杂体系的研究，恪守传统方法或者不计成本的使用高新技术都是不合适的，因此，如果能充分结合传统技术和新型高效技术各自的优点，合理组合使用，将是一个经济合理的策略。

目前越来越多的研究单位开始采用这一策略，一般采用硅胶大柱划段，然后再结合制备色谱快速分离的方式进行快速纯化，这种手段很好的结合了传统硅胶柱层析和高效制备色谱新技术的的优势，对于第一步硅胶划段，其一，硅胶柱层析较好的结构分辨能力，能依据极性基团的差异很好的分段；其二，硅胶柱层析由于原料便宜，适合通过装大柱提高上样量，单次上样可达公斤级；其三，上柱的原料，即使经过溶剂萃取，仍然具有黑多杂的特点，硅胶柱层析在划段同时可以起到净化除杂的作用，这极大的为后续制备色谱减小了压力。

对于第二步制备色谱快速纯化，采取第一步初步划段和净化的组分作为原料对昂贵的色谱柱是一种非常有效的保护。

这种传统和现代的组合充分规避传统技术和新技术各自的缺陷，高效发挥二者的优势。

上述分离方式优缺点对比：见下表。