第十一章色谱分析法概论

4．显色
(1) 紫外灯照射法
(2) 碘蒸气法：
(3) 碳化法：
(4) 专属显色剂显色法：

5．Rf值的计算
仪器和试剂

载玻片，烘箱，烧杯，点样毛细管，层析缸，铅笔 硅胶G，1%偶氮苯对照品溶液，0.01%对-二甲氨基偶 氮苯对照品溶液，偶氮苯和对-二甲氨基偶氮苯样品溶 液 展开剂（四氯化碳：氯仿=7：3）
（二）分配色谱法
利用被分离的各个组分在互不相溶 的固定相与流动相中的溶解度不同 而使试样组分在两相间不断产生分 配平衡。
分配系数
Cs X s Vs K Cm X m Vm
Vs为固定相的体积 Vm为流动相的体积
C s为溶质分子在固定相中 的浓度 Cm为溶质分子在流动相中 的浓度
注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质 以及柱温有关
（一）基本原理


将固定相（吸附剂）均匀地涂抹在光洁表面上， 将待测试样点在一端的起始线上，再把点样后 的薄层板放进密闭容器中，使薄层板的底端浸 入适当的溶剂进行展开。 借助薄层板上吸附剂的毛细管作用，溶剂会载 带分离组分向前移动展开，因各组分吸附能力 不同，所以组分移动速率不同，一定时间后各 组分彼此分离，在板上形成不同距离的斑点
• 与固定相作用差异 • 随流动相移动的速度不等 • • 差速迁移 色谱分离
色谱过程
实现色谱操作的基本条件是必须具备相
对运动的两相，固定相(stationary phase)
和流动相(mobile phase)。
色谱过程是组分的分子在流动相和固定
相间多次“分配”的过程。
第一节
色谱法发展与分类
一、什么是色谱法 色谱分析法简称色谱法 (chromatography) ，是一种物理 或物理化学分离分析方法。 1906年，植物色素分离，色带
2.吸附等温线
一定温度下，组分在吸附剂表面被吸附 达到平衡时，组分在两相中浓度相对关 系的曲线，称为吸附等温线（adsorption isotherm） 横坐标为组分在流动相的浓度，纵坐标 为在固定相的浓度。 一般分为直线型、凸型和凹型三种

凸形等温线

吸附剂表面有不同吸附力 的位点，组分分子优先占 据高吸附力位点。在浓度 较低时，组分吸附牢靠较 难洗脱，高浓度时，吸附 在低吸附位点的组分分子 吸附较为松散，洗脱快， 导致组分在浓度较高区域 迁移速度快于浓度较低区 域，流出曲线为前缘陡峭， 后部托位的不对称峰形。
1952年Martin & Synge 发明气-液色谱 1953年Janak发明气-固色谱
1954年Ray发明热导检测器
1957年Martin & Golay 发明毛细管色谱
1959年Porath & Flodin 发明凝胶色谱
1960年液相色谱技术完善
70年代离子色谱与薄层扫描
80年代超临界流体、毛细管电泳
柱色谱
色谱图
随时间 t 记录色谱流出曲线，即色谱图
I
t0
tR t R′
tR保留时间
Wσ
t0死时间
h
W½
h/2 0.607h
o
进样 空气 （惰性物质） 组分1
Wb
组分2
t
（二）固定相与流动相
1.固定相 （1）基本要求：均匀、坚固颗粒，吸附 力强且可逆，不发生化学反应及溶解。 （2）常用吸附剂 硅胶、氧化铝
图示

分离机制 利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现 分离连续萃取过程。分配系数大越易分离。
（二）固定相和流动相
1.固定相 将固定液涂渍在一定粒度的载体上构成。 载体（又称担体）仅起负载一定量固定 液的作用。 固定液是样品的良好溶剂，不溶或很难溶 于流动相

分配色谱法两种类型
1.正相色谱法：用极性溶液作固定液，用 非极性或弱极性溶液做流动相，分离极 性化合物。 2.反相色谱法：用非极性或弱极性溶液作 固定液，用极性溶液做流动相，分离非 极性或弱极性化合物。
1930年R.Kuhn用色谱柱分离出胡萝卜素
1935年Adams and Holmes 发明了苯酚-甲醛型离子交 换树脂，进一步发明了离子色谱
1938年Izmailov 发明薄层色谱 1941年Martin & Synge 发明了液-液分配色谱 1944年Consden,Gordon & Martin 发明纸色谱
二、分类：
1．按两相分子的聚集状态分： 流动相 固定相 类型
液体 液体 气体 气体 固体 液体 固体 液体 液-固色谱 液-液色谱 气-固色谱 气-液色谱 液相色谱
气相色谱
超临界流体色谱法
续前
2．按操作方式分：
柱色谱
填充柱色谱 毛细管柱色谱 纸色谱 薄层色谱 高分子薄膜色谱
平面色谱
电泳法
3．按分离机制分： 分配色谱：利用分配系数的不同

2.流动相
（1）基本要求：纯度合格、溶解样品、 粘度小，性质稳定，可挥发便于回收样 品 （2）选择 从试样、吸附剂和流动相三个方面考虑。 相似相溶、混合溶剂、梯度洗脱

（二）分配柱色谱法
固定与流动相均为液体， 液态固定相是固定液被涂渍在惰性 材料载体上构成固定相

流动相→必须与固定相不为互溶 载体→惰性，性质稳定， 不与固定相和流动相发生化学反应


【实验装置】
前沿线
色斑
起始线
图3-6 薄层色谱示意图
质谱分析法 电化学分析法 仪器分析 色谱分析法 分析仪器联用技术 热分析法 光分析法
1、电化学分析方法的分类
classification of electrochemical analysis 电导分析法
电位分析法
电化学分析法 电泳分析法
电解分析法
库仑分析法
极谱与伏安分析法
2、光分析方法的分类
分子光谱 原子光谱 紫外可见法 原子吸收法 光分析法 核磁法 原子发射法


固定相→吸附剂（硅胶或AL2O3） 具表面活性吸附中心 吸附平衡 吸附系数 Xm + nYa→Xa + nYm
[ X a ][Ym ]n X a S a Ka n X m Vm [ X m ][Ya ]
Vm 为流动相的体积
[ X a ]为溶质分子在吸附剂表 面的浓度 S a 为吸附剂表面面积 [ X m ]为溶质分子在流动相中 的浓度
色谱分析法概论
容量分析 化学分析 重量分析 电化学分析 分析化学 光学分析 仪器分析 质谱分析 色谱分析 热分析等
原子吸收光谱法 原子发射光谱法 原子荧光光谱法 紫外-可见吸收光谱法 红外吸收光谱法 核磁共振波谱法
有 机 波 谱 分 析
classification of instrument analytical method
选择性系数 K S [ RSO H ] [ X ] [ RSO H ] [ H ] 3 S m 3 S m 注：Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、 离子交换树脂性质以及温度有关
离子交换树脂的主要性能

1.交联度：X7，交联度大，树脂网眼小， 大离子难进入，交换速度慢，选择性好。 2.交换容量：即能参加交换反应含有的活 性基团数，一般为1～10mmol/g。 3.粒度：以溶胀后能通过的筛孔目数表示。
俄国植物学家Tswett于
1901年发现：利用吸附
原理分离植物色素
1903年发表文章：On a new category of adsorption phenomena and their application to biochemical analysis 1906年Tswett 创立“chromatography”—“色谱法”新名 词 1907年在德国生物会议上第一次向世界公开展示显现彩
离子交换色谱法的流动相
组分离子的保留值可通过调节流动相的 pH值或离子强度来控制。 多采用各种缓冲液来控制流动相的pH值

四、尺寸排阻色谱法
凝胶色谱法；空间排阻色谱法 以多孔凝胶为固定相，按照分子大小顺 序对试样中组分进行分离。

流动相→水——凝胶过滤色谱 流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱

（三）离子交换色谱法
网状立体结构的高分子聚合物， 带有许多活性基团，一部分为与 骨架相连的带负电荷的阴离子基 团或带正电荷的阳离子基团等不 可交换的离子基团，另一部分是 这些离子基团上结合的与其电性 相反的可交换的离子。
（三）离子交换色谱法

固定相→离子交换树脂
流动相→水为溶剂的缓冲溶液
被分离组分→离子型的有机物或无机 强酸性
图示


固定相——CaCO3颗粒 流动相——石油醚 色带
定义、实质和目的
定义：利用物质的物理化学性质
建立的分离、分析方法 实质：分离 目的：定性分析或定量分析
一、色谱法的历史发展 1.新型固定相和检测器的研制 2.色谱新方法的研究 3.色谱联用技术 4.色谱专家系统
（一）色谱分析法的历史

除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺 寸、凝胶孔径大小有关外，其他三种K值都 受组分的性质、流动相的性质、固定相的 性质以及柱温的影响
图示
第四节 平面色谱法
是将固定相涂铺成平面层状，色谱分离 在此平面上进行，为开放式的离线操作。 薄层色谱法、纸色谱法、薄层电泳法

一、薄层色谱法

按原理可分为 吸附、分配、 离子交换和尺 寸排阻法
注：Ka与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质 及温度有关
图示

分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离
吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开
Ka的意义

若Ka值较小，则说明该组分在固定相保 留作用较弱，不易被吸附，迁移速度快， 先流出柱。
（二）固定相与流动相
1.固定相 常用氧化铝和硅胶，也可选用硅藻土、 聚酰胺和纤维素等

2.流动相

也称展开剂
薄层色谱
0.25mm 厚 纤维素，硅胶 玻板
纸色谱法
滤纸，又称纸层析法，以纸为载体的色谱法。
薄层色谱的操作步骤
1．薄层板的制备 使表面均匀光滑且厚度为0.2mm～1mm， 在110℃下活化30min，冷后，备用。 2．点样 每个斑点直径不超过0.3cm，间距为1cm～1.5cm为 宜。 3．展开 注意：点样斑点必须保持在展开剂液面之上。展开 剂升到距离顶端1cm～1.5cm）或各组分已分开时， 取出，标出前沿位置。

分离机制： 利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性 渗透实现分离
聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶亲水性凝 胶等作固定相 以水或水溶液做流动相

小结：

四种色谱的分离机制各不相同，分别形成 吸附平衡、 分配平衡、离子交换平衡和 渗透平衡 K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择 性系数和 渗透系数
第三节经典液相色谱法
一、吸附柱色谱法 是根据吸附剂对样品中各组分吸附能力不 同，在两相作相对运动时，导致各组分 在色谱柱中产生差速迁移，使各组分流 出色谱柱的时间不同而分离

1.吸附作用与吸附平衡
吸附剂一般为较大比表面积 的多孔性固体颗粒，其表面 有许多吸附活性位点。 组分分子、流动相分子与吸 附剂表面吸附活性位点之间 吸附和洗脱速度相等时即达 到吸附平衡。
红外法
荧光法
3、色谱分析方法的分类
classification of chromatographic analysis 超临界色谱法 气相色谱法 色谱分析法 液相色谱法 电色谱法 薄层色谱法
激光色谱法
4、其他分析方法的分类源自热分析法质谱分析法
联用技术
其他分析法
色谱过程图解
• 组分的结构和性质微小差异
阳离子交换树脂
弱酸性
阴离子交换树脂
强碱性
弱碱性
图示

分离机制： 依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力） 不同而实现分离
（三）离子交换色谱法

阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ → RSO3-X+ + H+
固定离子 可交换离子 待测离子
[ RSO3 X ]S [H ]m [ RSO3 X ]S [ X ]
吸附色谱：利用物理吸附性能的差异
离子交换色谱：利用离子交换原理
空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同
3．按分离机制分：
亲合色谱法 化学键合相色谱法 毛细管电泳法
第二节 色谱原理
定性参数 定量参数 柱效参数 分离参数 相平衡参数
色谱分离过程

由过程可知，色谱法是利用混合物中各 组分在两相中吸附、分配、离子交换、 亲和力、分子尺寸等差异，使固定相对 各个组分的保留作用不同，当两相做相 对运动时，不同组分产生反复多次的差 速迁移而进行分离分析的方法。