第三章 发酵液预处理

絮凝的效果与絮凝剂的加量、相对分子质量和类型、 溶液的pH、搅拌转速和时间等因素有关。在絮凝过程中，
常需加入一定量助凝剂以增加絮凝效果。
较多的絮凝剂有助于增加桥架数量，但过多的添加量 反而会引起吸附饱和，絮凝剂争夺胶粒而使絮凝团的粒径 变小，絮凝效果下降。
3、混 凝
对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高
2. 变性法
① 加热， ② 大幅度调节pH值， ③ 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。 不足之处: a. 加热法只适合于对热较稳定的目的产物；
极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸
碱； 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合
3. 吸附法
加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 ① 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协
固相干度不如过滤设备。
4.种类：种类多，按其作用原理不同，可分为过滤式
离心机和沉降式离心机两大类。
5.离心机种类：
a. 碟片式离心机
b.管式离心机
C. 倾析式离心机
（二)过滤
微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或
细胞碎片以及残余的固体培养基成分。 过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与 液体进行分离的过程。 在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清， 并且有高的收率。
在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，
称为等电点。
1. 酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀
在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、
水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形 成沉淀；
在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu++、
Zn++、Fe+++和Pb++等形成沉淀。 由于羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常 强于碱性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（ pH 4.0－5.5）。但单靠调节pH至等电点的办法不能将大 部分蛋白质除去。
同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；
② 在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠， 两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒 子吸附并包裹在其中除去。
三、 固液分离工程及设备
范围：培养基、发酵液、某些中间产品和半成品。
其中发酵液由于种类多、粘度大和成分复 杂，分离最为困难。
方法：分离筛、重力沉降、浮选分离、离心分离
它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作 用，强烈地吸附在胶粒的表面。 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同
的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮
团，这就是絮凝作用。
工业上使用的絮凝剂可分为三类： 1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、 聚苯乙烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海 藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。 目前最常见的高分子聚合物絮凝剂
q—胶体的电动电荷密度，即滑移面上的电荷密度；
δ—扩散层的有效厚度，即为吸附层和扩散层界面处 电位φd降低到其值为1/e处的距离，
ζ电位与扩散层厚度δ和电动电荷密度q成正比，而扩散 层厚度又与溶液中离子强度有关，当双电层的排斥力不足 以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的结果导致胶 粒的互相碰撞而聚集起来。 在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，能降低ζ电
和过滤等，其中用于发酵液固液分离的主 要是离心分离和过滤分离。
重力沉降 浮 选
通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。 用于固液比重差小、直径5～30μ m颗粒的分离，污水处理
旋液分离
悬浮液以较高速度沿切线方向进入旋风分离器，
轻相由分离器中央排出，重相由分离器下部排出， 但不适合直径<5 μm颗粒去除（可用丝网分离器）。
发酵液中的杂质
（1）高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）
在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质
的交换容量。
（2）杂蛋白
在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量
和吸附能力， 在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象， 使两相分离不清。 在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污
滤剂，可提高过滤效率5倍。
不影响目的产物，可消除发酵液中某些杂 质对过滤的影响，提高过滤速率。
（三）凝聚与絮凝
凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶 体粒子的分散状态，使聚集起来，增大体积，以便于过滤，
常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。
通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的 作用使溶液中带相反电荷的粒子（即正离子）被吸附在其周 围，在界面上形成了双电层。但是这些正离子还受到使它们 均匀分布开去的热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，
⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生
物污染、蛋白酶水解等作用的影响。
这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。
（二）改善发酵液过滤特性的物理化学方法
通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流体
性能，降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。
1. 降低液体粘度： 根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的 粘度成反比，降低液体粘度可有效提高过滤速率。注意加 热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。 有加水稀释法和加热法
1.原理：悬浮液通过过滤介质时，固态颗粒与溶液分离。
2.类型： 澄清过滤
5. 加入反应剂：
加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如
CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块 状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，
改善过滤性能；如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化
为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液 过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助
可以加入三聚磷酸钠，它和镁离子形成可溶ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ络合物
Na5P3O10＋Mg＋＋＝Mg Na3P3O10＋2Na十
2.Mg2+：三聚磷酸钠→形成三聚磷酸钠镁 （可溶性络合物） 3.Fe2+ ——黄血盐，→普鲁士兰沉淀
（二）杂蛋白的去除方法
蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。
在酸性溶液中带正电荷；
在碱性溶液中带负电荷。
2. 调整pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷 性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。 氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发 酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值
改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染；
细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下 也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。 主要有等电点沉淀法
位和脱除胶粒表面的水化膜，就能导致胶粒间的凝聚作用。
1、凝 聚
凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排 斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳
定的现象。
凝聚值：使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度。 反离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能 力越强。
阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序 Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+ 常用的凝聚剂电解质有：
目前最常见的高分子聚合物絮凝剂
有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物
根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：
非离子型 阴离子型（含有羧基） 阳离子型（含有胺基）
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
用量少，一般以mg/L计量；
絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
染，影响过滤效率。
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
（一）高价无机离子的去除方法
1. Ca2+ ：草酸、草酸钠→形成草酸钙沉淀
但草酸价格较贵，加入硫酸铅，在60℃下反应生成草酸铅。后者在 90－95℃下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。 草酸镁的溶解度较大。故加入草酸不能除尽镁离子。要除去镁离子，
分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附 桥架的双重机理；
对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚 和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和 絮凝机理的过程，称为混凝。
二、 发酵液的相对纯化
发酵液中杂质很多，其中有些杂质不仅直接影响产
品质量利收得率，同时对后继提取和精制有很大影响。
介质过滤
霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用过滤方法； 细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采用高速离心
分离， 如对发酵液进行预处理，也可用过滤进行固液分离。
离
心
工业上常用
（一）离心分离
1.原理：利用转鼓高速转动所产生的离心力，
来实现悬浮液、乳浊液的分离或浓缩。
2.优点：分离速率快、分离效率高、液相澄清度好等。 3.缺点：设备投资高、能耗大。此外，连续排料时，
对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞， 经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞 碎片分离。
一 、发酵液过滤特性的改变
（一）微生物发酵液的特性
①发酵产物浓度较低，大多为1％一10％，悬浮液
中大部分是水； ②悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； ③固体粒子可压缩性大； ④液相粘度大，大多为非牛顿型流体；
硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）；
氯化铝 AlCl3•6H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO4· 7H2O ； 石灰；ZnSO4；MgCO3
2、絮 凝
絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用， 使胶粒形成较大絮凝团的过程。 絮凝剂：是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对 分子质量可高达数万至一千万以上，它们具 有长链状结构， 其链节上含有许多活性官能 团， 包括带电荷的阴离子或阳离子基团以及 不带电荷的非离子型基团。
3. 凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎
片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较
大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除
去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。
4. 加入助滤剂
助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏
松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到 助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。 常用的助滤剂 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等。 最常用的是硅藻土，使用时，通常细粒用量为500 g/m3； 中等粒度用量为700 g/m3；粗粒用量为700-1000 g/m3。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺， 用于食品和医药工业时应谨慎。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的应用
医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），
聚苯乙烯类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、
聚合铁盐等），天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘
物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。
有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物 根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类： 非离子型、 阴离子型（含有羧基） 阳离子型（含有胺基）
工业上使用的絮凝剂
1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、 聚苯乙烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻 酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。
在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分。
在相距胶核表面约一个离子半径的Stern平面以内， 正离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附层或紧密层； 在stern平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开 去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓 度，称为扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型， 如图所示。
发酵液成分
微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生 物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各 种代谢产物。
目
的
分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和 改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利 进行。
方法选择
对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物
转移到液相，然后经固液分离除去固相；
扩散双电层的结构模型图
当胶粒在溶液中作相对运动时，总有一薄层液体随 着它一起滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大，滑移 面（剪切面）在图14－l中用波纹线表示。
这三种电位中只有ζ电位能实际测得，所以可以认为是 控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征。 ζ＝4πqδ/D D—水的介电常数；