Aptamer核酸药物的研究进展
作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室(汪治清、杨新科);北京军区第二六一医院(佟玉品)#综述#
Aptamer核酸药物的研究进展汪治清佟玉品杨新科
Ap tamer指的是能结合蛋白或其他小分子物质的单链或双链寡核苷酸112。体外筛选技术的发展和PCR技术的应用,使得Ap tamer的研究近年来有了长足的进步,筛选到了一大批能与各种蛋白或小分子特异紧密结合的核酸分子(Aptamer)。这些Aptamer包含了RNA、双链DNA、单链DNA 等多种形式的寡核苷酸,其配体的性质各异。体外筛选Aptamer不仅增强了人们对核酸-蛋白相互作用的认识,也为寻找新药提供了一条途径。Aptamer核酸药物的研究近年来也取得了一些可喜成果。我们拟就该方面的进展及相关问题作一综述。
1Aptamer筛选的一般程序及要点
各种分子的Aptamer筛选的程序大同小异,多采用亲合方法,即固定配体,使之与扩增的寡核苷酸库混合培养,待配体与寡核苷酸结合后洗去非结合核酸,然后洗脱配体-aptamer复合物,回收核酸,扩增,再进入下一轮筛选。RNA 寡核苷酸库多从相应的DNA库转录而来,单链DNA库通过不对称PCR或从双链DNA库变性而来。
Aptamer筛选最重要的一条是如何保证核酸库的多样性。从理论上讲,自由核酸的长度越大,库容就越大,但一般说来与蛋白或其他分子相互作用的核酸序列不会超过100bp,多集中于15~45bp之间。对双链DNA来说,库容达1013便可进行有效筛选,单链DNA及RNA库容要求更低。为保证PCR扩增的效果,寡核苷酸两端应为AT丰富区且不应有对称结构。PCR扩增时,为防止某些特殊序列的超比例扩增,循环次数一般不超过20次,但为保证库容量,加大体系进行大规模扩增是必需的。
2病毒相关的aptamer核酸药物
用于抗病毒的aptamer多RNA分子,与病毒基因表达调控有关的蛋白作为其作用靶点,如HIV的Rev、Tat、RT及HCV的NS3等均是理想的作用靶点。
HIV的Rev蛋白是一相对分子质量为19000的调节毒粒蛋白表达的蛋白,主要功能是促进HIV基因表达由早期(转录调节蛋白mRNA)向晚期(转录HIV结构蛋白mRNA)的转化及促进晚期转录的进行,还在转运结构蛋白mRNA进入细胞质的过程中发挥作用。Rev蛋白的上述作用是通过与env和gag-p ol mRNA上的一段234碱基的Rev效应元RRE的特异结合来实现的,而这种结合主要是Rev蛋白中富含碱性氨基酸的14肽段与RRE二级结构B茎区(60base),特别是其中46~48位的GGG的特异结合。RRE区核苷酸被部分乃至全部随机变用以寻找更高亲和力的序列,从含32个随机核苷酸的RNA库中发现了新的Rev结合序列122。Ye等132还测定了一Rev-aptamer复合物在可溶状态下的结构,发现了G-A,A-A的/错误0匹配及UAU三联核苷酸与Rev中,两个精氨酸侧链的相互作用,为以Rev为靶点的药物设计提供了新的思路。
RNA aptamer用于治疗,必须能被有效转录,在体内能抵抗快速降解,并能正确折叠且快速到达有效部位。Good 等142基于人tRNA Met和U6SnRNA启动子,构建了一个表达盒,用于治疗的小分子RNA被保护在其中。在细胞中,全长的转录产物高达2@107~1@109个,插入的HIV Rev结合序列则能有效的抑制HIV-1的基因表达,在AIDS的基因治疗方面展示了良好的应用前景。Konopka等152比较了Rev-ap tamer及针对HIV-1Rev基因的核酶的抑制病毒作用,发现Rev-ap tamer能有效抑制病毒p24的产生,与核酶具有相近的效果,且核酶并不能增强aptamer的抑制作用。人们对于这些核酸药物的输入方式也作了一些探讨,发现脂质体内不仅能保护核酸免受核酸酶的降解,也能有效地进入细胞。进一步实验发现在RSV启动子下,这一RNA-aptamer可使病毒产生降低88%,C MV启动子自身能与HIV争夺转录因子,从而抑制病毒的复制,因而不适用于检验aptamer的抗病毒作用162。
T at蛋白是HIV反式激活蛋白。TAR(反式激活效应元件)位于HIV基因组+1到+57~+60位。TAR RNA在+1~ +59位间形成一个由4段茎区和1段6核苷酸环区的稳定二级结构,在第ó及第?茎区之间由UCU构成一个凸出部,是T at的结合位点。Tat与完整TAR结合,加上与其他细胞因子及上游启动子、增强子的结合来诱导HIV在细胞中的复制。针对T at蛋白的RNA-aptamer被设计成与TAR竞争性结合tat以阻止病毒复制。Lisziewicz172构建了一质粒,将50个串联的TAR RNA置于HIV-1LTR之下,在瞬时转染试验中,能抑制90%受tat调节的基因的表达,若将gag RNA特异性核酸引入该质粒,在人T细胞系Molt3中能抑制99%HIV-1或SIV的复制,并可维持14个月之久。Sullenger等182则将TAR与tRNA Met嵌合在一起,通过RNA聚合酶的作用来获取大量的TAR,与Tat结合以防止HIV在细胞中的复制。
Katahira等192筛选的37mer aptamer与Tat的结合力比天然的TAR高133倍。结构研究表明该aptamer的两个UAU三联碱基与Tat中的精氨酸侧链及谷氨酸主链间形成的氢键起着关键作用。该aptamer与Tat以1B1的方式结合,在体内与体外试验中均具有很强的抑制病毒复制作用。
阻断Ta-t TAR相互作用的另一途径是封闭TAR的Tat结合区。Bioizian等1102从一30自由核苷酸的DNA文库中筛选到一些TAR的ap tamer,并用核磁共振的方法测定了TAR-aptamer复合物的结构。该ap tamer呈现并不严紧的茎-环结构,顶环有一段共同序列5c-ACTCCCAT,中间6个核苷酸与TAR的顶端区互补。二级结构显示DNA aptamer茎结构及TAR的茎形成了半连续的螺旋。此发现为RNA结构的非反义寡核苷酸的研究提供了良好的启示。一些TAR的RNA aptamer能形成非典型的发夹结构,在顶端环中有共同的5c-GUCCAGA-3c序列,其中GA对于TAR-ap tamer的高亲和力至关重要。
Tuerk等122在实验中还分离到了HIV反转录酶(RT)的RNA配体,但与禽成髓细胞性白血病病毒(AMV)及莫罗尼鼠白血病病毒(MMLV)的反转录酶不能结合。这种aptamer能同时抑制R T的RNA依赖的DNA聚合酶活性及RNase H的活性,是潜在治疗AIDS的aptamer药物。Kensch等1112发现的HIV-1的RT RNA aptamer与RT具有极高的结合力,并且这种结合高度特异,该aptamer与HIV-2的RT结合力比HIV-1低4个数量级。Jing等1122还分离了HIV-1整合酶的单链DNA aptamer,核心环可依次结合3个K+,并且与K+的结合能引起环的变构,从而加固与HIV整合酶的结合而发挥抗HIV-1的活性。
HCV非结构蛋白NS3为70000~72000,N端含有丝氨酸蛋白酶所特有的Asn-His-Ser催化活性中心,C端具有三磷酸酶(NTPase)及RNA解旋酶(Helicase)活性。NS3在HC V多蛋白前体的裂解及HCV的复制中起重要作用。Urvil等1132分离到了针对NS3蛋白酶结构域的RNA aptamer,结合常数为650nmol P L,体外能很好的抑制NS3蛋白水解活性,该aptamer的G28~U34,A47~A55残基的磷酸基团与NS3之间的静电作用对于二者的结合尤为重要。Wang等1142分离到的NS3蛋白酶RNA aptamer有保守的GA(A P U)UGGGAC序列,与NS3的结合常数达到10nmol P L,能抑制99%的NS3蛋白酶活性。突变研究表明,aptamer的?及ó号茎与ó号环对维持aptamer的特异性至关重要。而NS3的Arg130、Arg 161为二者相互作用所需要的。Kumar等1152也分离到2个针对NS3的RNA aptamer,能同时抑制NS3的蛋白酶、解旋酶的活性,可望成为抗-HCV的药物。
Weiss等1162将Syrian金仓鼠朊蛋白rPr23-231与GST融合,用于筛选aptamer得到RNA分子,能特异结合PrP而不结合GST。该aptamer能形成G-四边形结合于PrP的N端23~ 52位。在有抗-PrP抗体的野鼠、仓鼠及牛的脑组织匀浆中,该ap tamer均能检测出PrP,在患羊瘙痒症鼠的脑组织匀浆中,该aptamer不能识别PrP27~30(缺少N端60个氨基酸)。该aptamer在传染性海绵样脑病的诊断方法的发展中迈出了重要一步。
3生长因子及肿瘤蛋白相关的aptamer药物近年来,对生长因子及肿瘤蛋白的aptamer的研究方兴未艾。肿瘤微血管为肿瘤生长提供养分,血管内皮生长因子VEGF对于肿瘤血管的形成起着重要作用,因而也被选作筛选抗肿瘤aptamer的靶点。聚乙二醇偶联的VEGF165的RNA ap tame-r NX1838是第一个进入临床试验的aptamer。在体外实验中,NX1838能有效阻止VEGF与人脐带血管内皮细胞HUVECs的结合,并以剂量依赖方式阻止了VEGF调节的KDR和PLC-C磷酸化、钙离子的流动及VEGF诱导的细胞增殖。在恒河猴实验中,1mg P kg aptamer静脉注射可使血浆中ap tamer浓度达到25.5L g P mg半衰期为9.3h,清除率为6.2 ml P h1172。安全实验表明NX1838不会引起毒副作用和抗体产生。在人类临床试验中,每只眼1~2mg的剂量是安全有效的。在裸鼠Wilms肿瘤实验中连续5周的NX1838治疗可使肿瘤萎缩84%1182。Pigpen蛋白在实验性大鼠脑神经胶质瘤微血管内皮细胞高度表达。Blank等1192以该脑瘤的内皮细胞作为靶点,筛选到了一批能结合Pigpen蛋白的单链DNA ap tamer,这种以整个细胞作为靶点为筛选ap tamer提供了更大的可能性和多样性。
血小板衍生的生长因子PDGF及其受体见于多种肿瘤中,可加速肾小球系膜细胞增生和基质积累从而造成多种进行性肾病。在大鼠肾小球性肾炎模型中,静脉注射聚乙二醇偶联的PDGF aptamer,在第6天、第9天能分别降解64%和78%的肾小球系膜细胞有丝分裂。对这类肾炎的长期治疗也达到了同样令人满意的效果1202。
Oncostatin M(OSM)是一多功能的IL-6家族细胞因子,作为强有力感染因子,可作为类风湿性关节炎的侯选对象。Rhodes等1212筛选到OSM的高亲和力RNA aptamer并加以改造,用于探讨OSM在炎症反应失调中的作用,可望成为又一治疗试剂。
4作为蛋白抑制剂的aptamer
基于aptamer与蛋白质作用的高度特异性,人们试图寻找一些与疾病相关蛋白的aptamer,用于相关疾病的治疗与诊断。
中性粒细胞在急性炎症中起重要作用,其嗜苯胺蓝粒中含高水平的丝氨酸蛋白酶-弹性蛋白酶,能降解细胞间质中的许多成分,并对内皮细胞有细胞毒作用。体内弹性蛋白酶与一些抑制因子存在动态平衡,但在成人哮喘综合征、局部消肿注射和一些慢性病中,这种平衡被打破,弹性蛋白酶的功能过量发挥。Charlton等1222筛选到了弹性蛋白酶的单链DNA aptamer,其对弹性蛋白酶的抑制作用比以前报道的任何弹性蛋白酶的可逆抑制剂的作用都强,在阻止激活的中性粒
细胞引起弹性蛋白酶降解反应中,比蛋白酶抑制因子(PI)更为有效。在小鼠急性肺炎模型中,该ap tamer以剂量依赖方式抑制肺部损伤和中性粒细胞侵入,效果良好。Charlton 等1232还将此aptamer的应用推广到炎症的诊断。该ap tamer 能结合于激活的中性白细胞表面,通过荧光流式细胞仪分析该aptamer在激活中性粒细胞表面的结合情况即可检测炎症状态。
凝血酶(Thrombin)是一种糖蛋白,体内未见有凝血酶与核酸结合的报道。Bock等1242首次在体外分离到了具有抗凝血酶凝集活性的96mer的单链DNA aptamer。保守的15mer 5c-GGTTGGTGTGGTTGG-3c为大多数克隆所共有。合成的15 mer比96-mer的结合力高100倍,Kd值达到25~200nmol P L。该15-mer aptamer被夹住两个thrombin分子的不同正电荷区域之间,靠静电及疏水力相互作用。这两个正电荷区域,一个是血纤蛋白原识别位点,另一个是假想的肝素结合位点。DNA分子与血纤蛋白原识别位点间存在盐桥。水蛭素(hirudi n)能结合于凝血酶的阴离子结合区并对15mer aptamer与凝血酶的结合有竞争作用。Yop M是41500的抗鼠疫毒力蛋白,可结合凝血酶,该15met的aptamer能与之竞争。在体内实验中,该15mer的aptamer也显示了良好的抗凝集活性,Aptamer的注入速度与血浆凝血酶原的延迟时间具有良好的线性关系,注入10min内抑制作用达到平台期。aptamer在体内的半衰期约为(108?14)s。这种快速作用与短的半衰期可能在一些治疗中更为实用1252。在人富血小板血浆(PRP)中,该aptamer对凝血酶诱导的血小板凝集的剂量依赖抑制为0.5U P L,IC50值为70~80n mol P L。体外实验中, 0.2U P L、0.4U P L的肝素分别抑制6.5%、34.9%的凝血酶诱导的聚集,而ap tamer可达79.7%,体内效果ap tamer比肝素更好。在心肺分流术(CPB)中,肝素常用作抗凝剂,但肝素有引起血小板减少等副作用。在狗CPB实验中,人们用aptamer替代肝素,效果良好,静脉注射后,该aptamer主要聚集于肾脏、肝脏、血液和肌内组织1262。
Tasset等1272筛选到一个29mer的凝血酶单链DNA aptamer,能结合于凝血酶表面的肝素结合位点,比15mer的结合力高20~50倍,体外也能抑制凝血酶催化的血纤维蛋白凝集反应,该aptamer的核心序列与15mer的极为相近。
人补体C5的RNA ap tamer与C5的结合能抑制C5水解成C5a和C5b,成为有潜在治疗价值的补体抑制剂1282。
5与小分子作用的aptamer
自90年代体外筛选aptamer以来,人们已发现了很多能与小分子物质特异结合的ap tamers。这些aptamer在诊断、治疗与新药研制中有着重要意义。
茶碱在哮喘、支气管炎和肺气肿的治疗中常用作支气管扩张药物,易引起中毒,与血清中的可可碱、咖啡因难以区分。Jenison等1292从RNA库中分离到茶碱aptamer,其与茶碱的亲和力比与咖啡因的亲和力高10000倍以上,咖啡因与茶碱在结构上极为相似,只在N-7位多一个甲基,RNA分子与荷碱结合后,茶碱的构型有较大改变,而无论有无茶碱结合,该RNA的Tm值都达到72e,表明其有稳定的二级结构。这一结果也显示了RNA的高度配体鉴别能力。
氨基糖类抗生素能结合核糖体23s RNA,从而阻断细菌蛋白的合成达到治疗目的。但耐药性已成为抗生素面临的棘手问题。Aptamer则被用于寻找药物的新靶点。Lato等1302分离了紫青霉素(Lividomycin)的RNA aptamer。序列分析表明,与很多生物体内有与之相近的基因组序列,有些位于某些病原微生物的关键基因内,这一发现为开发此类药物提供了有益启示。托普霉素(Tobramycin)的RNA aptamer有一茎环结构,二者以多糖-RNA识别的方式结合。托普霉素结合于RNA/大沟0中央的茎环结构,部分被结合的托普霉素位于/大沟0底部与环上突出的胞嘧啶残基之间,这一结果对已有药物基于空间结构重新设计以克服耐药性提供了帮助。新霉素B以同样的方式与RNA aptamer结合。B urke等1312分离了氯霉素(Chloramphenicol,Cam)的RNA aptamer,发现其有高度保守的5~6碱基的中央螺旋,侧翼有A丰富的/凸出0。序列分析表明该RNA与Cam在23s rRNA上的结合位点高度相似。
多巴胺(Dopamine)是酪氨酸衍生物,是重要的神经递质。Mannironi等1322分离了其RNA aptamer,与多巴胺结合的相对分子质量2.8@103。多巴胺通过3c-OH和脂肪链与ap tamer的两个茎环结构结合,该ap tamer也可结合L-酪氨酸。
为了克服ap tamer易被核酸酶降解的弱点,Williams等1332在制备肽激素-抗利尿激素的单链DNA aptamer时,先筛选出了抗利尿激素对映异体的ap tamer,再合成了该aptamer的对映异构体,后者对核酸酶不敏感。
生命分子的相互作用一方面需要彼此匹配的空间结构,另一方面需要各种/力0如氢键、离子键甚至范得华力稳定已形成的结合。当这两个条件都得以满足时,一切稳定的结合均是可能的。核酸库的无限多样性提供了空间结构的可选择性,而核酸分子带负电的磷酸基团能与多种正电基团通过静电作用形成稳定结合,氮与羟基是形成氢键的重要元素,核酸分子中富有这两种基团,也就是说核酸库是满足生命分子相互作用的两个条件)))空间和力,这也是近年来筛选各种分子的aptamer的理论基础。基础研究的工作重心在于探讨aptamer与其配体结合对于生命过程中各种可能的调节作用;应用研究则着重于ap tamer新药的研制,这也是最具吸引力的领域之一。迄今筛选到的HIV、HCV、多种肿瘤及肿瘤相关因子、凝血酶、弹性蛋白酶、茶碱、氨基糖类抗生素的ap tamer已在治疗中展示了良好的应用前景,相信在此方面ap tamer将大有可为。
参考文献
1Ellington AD,Sz os tak J W.In v it ro selection of R NA molecules that bind specific liganes.Nature,1990,346:818-822.
2Tuerk C,Mac-Dougal WS.In vitro evolution of func tional nucleic acids:
hi gh-affi nity RNA li gands of HIV-1proteins.Gene,1993,137:33-41.
3Ye X,Gorin A,Elli ngton AD,et al.Deep penetration of an al pha-heli x into a widened RN A major groove in the HIV rev peptide-RNA aptamer complex.Nat Struct Biol,1996,3:1026-1033.
4Good PD,Krikos AJ,Li SX,et al.Expres sion of s mall,therapeutic RNAs in human cell nuclei.Gene Ther1997,4:45-54.
5Konopka K,D uzgunes N,R os si J,et al.Receptor ligand-facili tated cati onic liposome delivery of ant-i HIV-1Rev-binding apta mer and ri bozyme DNAs.J Drug Target,1998,5:247-259.
6Konopka K,Lee NS,Rossi J,et al.Rev-binding aptamer and CMV promoter act as decoys to inhibit HIV replication.Gene,2000,255:235-244.
7Liszi ewicz J.Inhibi tion of HIV replication by regulated expres sion of a polymeric Tat ac ti vation response RNA decop as a s trategy for gene therapy in AID S.Proc Natl Acad Sci U S A,1993,90:8000-8004.
8Sullenger BA,Gallardo HF,Ungers GE,et al.Over e xpression of TAR sequences renders cells resistant to HIV replication.Cell,1990,63:601-608.
9Katahira M,Kobayashi S,Matsugami A,et al.Struc tural study of an RNA aptamer for a Tar protei n complexes w i th ligands.Nucleic Acids Symp Ser,1999,42:269-270.
10Bioizian C,Dauss e E,Yurchenko L,et al.DNA aptamers selected agai nst the HIV-1trans-activation-responsive RNA element form R NA-DAN kis sing complexes.J Biol Che m,1999,274:12730-12737.
11Kensch O,Connolly BA,Sternhoff HJ,et al.HIV-1reverse transcri opas epseudo knot RNA apta mer interac tion has a bi ndi ng affini ty in the lo w pico molar range c oupled wi th hi gh s pecify.J Bi ol Chem,2000, 275:18271-18278.
12Jing N,Hogan ME.Structure-ac tivity of tetrad-forming oli gonucleotides as
a potent ant-i HIV thepeutic drug.J Biol Chem,1998,273:34992-34999. 13Urvil PT,Kakiuchi N,Zhou D M,et al.Selection of RN A aptamers that bi nd s peci fically to the NS3protease of hepati tis C virus.Eur J Bi oche m, 1997,248:130-138.
14Wang J,Fauzi H,Fikuda K,et al.The RNA aptamer-bi ndi ng site of hepati tis V virus NS3protease.Bioche m Bi ophys Res Commun,2000, 279:557-562.
15Kumar PK,Machida K,Urvil P T,et al.Is olation of R NA aptamers specific to the NS3protein of hepatitis C virus from a pool of completely random R NA.Vi rology,1997,237:270-282.
16Weiss S,Pros ke D,Neumann M,et al.RNA apta mers specifically interact w i th the pri on protein prp.J Virol,1997,71:8790-8797.
17Tucker CE,Chen L,J udkins M B,et al.Detection and pl as ma pharmacokinetics of an ant-i vascular endothelial gro wth factor oligonleotide apta mer(NX1838)in rhesus monkeys.J Chromatogy Bi omed Sci Appl,1999,732:203-212.
18Drolet D W,Nelson J,Jucker CE,et al.Pharmacokinetics and safety of anant-ivascular endothelial growth fac tor apta mer(NX1838)following
i njecti on into the vi treous humor of rhes us monkeys.Pharm Res,2000,
17:1503-1510.
19Blank M,Weins chenk T,Priemer M,e t al.Sys te matic of revol ution of a DNA aptamer bindi ng to the rat brain tumor micro vessels:selective targeti ng of endothelial regulatory protei n pi gpen.J Biol Chem,2001, 276:16464-16468.
20Os tendorf T,Kunter U,Grone HJ,et al.specific antagoni sm of PDGF prevents renal scarring i n experi mental gol merulonephri tis.J Am Soc Nephrol,2001,12:909-918.
21Rhodes A,Deakin A,Spaull J,et al.The generation and characteri zati on of antagoni st RN A aptamers to human oncostatin M.J Biol Chem,2001, 15:275:2855-29561.
22Charlton J,Kirschenheuter G P,Smith D.Highly potent irreversi ble
i nhibitors of neutrophil elastase generated by selection from a randomized
DNA-valine phosphonate library.Biochemistory,1997,36:3018-3026. 23Charlton J,Sennell o J,Smith D.In vi v o imagi ng of infla mmation using an aptamer inhibitor of human neutrophil elas tase.Chem Biol,1997,4;809-816.
24Bock LC,Griffin LC,Latham JA,et al.Selecti on of si ngle-stranded D NA molecules that bind and inhibit human thrombin.Nature,1992,355:564-571.
25Griffi n LC,Bock LC.In vivo anticoagulant properties of a novel nucleotide-based thrombin i nhibitor and demonstration of regional anticoagulation in extracorporeal circuits.Blood,1993,3271-3276.
26DeAnda AJR,Coc ttre SE,Moon MR,et al.Pil ot study of the efficacy of a thrombi n inhi bitor for use during cardiopulmonary bypass.Ann Thoral Surg,1994,58:344-350.
27Tasset D M,Kublik MF,Steiner W.Oligonucleoti de inhi bitor of human thrombi n that bind dis ti nct epitopes.J Mol Biol,1997,272:688-698.
28Blesecker G,Dihel L,Enney K,et al.Deri vation of R NA aptamer
i nhibitors of human complement C5.Immunopharmac ology,1999,42:219-
230.
29Jenis on RD,Gi ll SC,Pardi A,et al.High-resolution molecular discri mi nati on by R NA.Science,1994,263:1425-1429.
30Lato SM,Ellington AD.Screening che mical libraries for nucleic-acid binding drugs bhy in vit ro selection:a test case wi th lividomycin.Mol Divers,1996,2:103-110.
31Burke D H,Hoff man DC,Brown A,et al.R NA aptamers to the pepti dyl trans ferase inhibitor c hloramphenicol.Chem Bi ol,1997,4:833-843.
32M annironi C,Scerch C,Fruscol oni P,e t al.M olecular recogniftion of amino acids by RNA apta mers:the evoluti on into an L-tyrosine binder of
a dopaming-binding RNA moti f.RNA,2000,6:520-527.
33Willia ms KP,Liu XH,Sc humacher TN,et al.Bioactive and nuclease-resis tant L-D NA ligand of vasopressi on.Proc Natl Acad SciU S A,1997, 94:11285-11290.
(收稿日期:2001-06-06)
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他汀类药物的研究进展
他汀类药物的研究进展 ［摘要］现今世界上使用的治疗高脂血症的他汀类药物有：洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀和阿托伐他汀。这类药物降脂作用强、抗动脉粥样硬化作用肯定，耐受性好，虽然与某些药物合用可导致横纹肌溶解的严重不良反应，但低剂量使用可减少甚至避免。现对这种药物的新剂型、结构特征、作用靶点、药代动力学、药理作用、不良反应、药物经济学及市场发展前景7个方面进行综述。 ［关键词］他汀类药物；药物新剂型；作用靶点；临床评价；药代动力学；药理作用；发展前景；药物经济学 他汀类药物是20世纪80年代后期开发的羟甲戊二酰辅酶A(HMG—CoA)还原酶抑制剂。该类药物的问世是降脂药治疗史上的重大进展，其除具调脂作用强、耐受性好等优点外，在冠心病的一级和二级预防中也发挥着重要作用，即可降低心血管事件发生率和心血管疾病死亡率。为对该类药物的结构特征、药动学、药理作用、不良反应4个方面进行综合性比较，现综述如下。 1.已上市或正在开发的他汀类药物新剂型 目前，已上市或正处于开发中的他汀类药物包括：洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀等，临床上，因西立伐他汀与贝特类降脂药合用可造成横纹肌溶解，导致患者死亡的严重不良反应频频发生，故已于2001年撤市。匹伐他汀由日本Nissan Chem株式会社开发，是一种很有前途的药物，目前Ⅲ期临床试验已结束，正处于注册前状态。匹伐他汀低剂量(0．1、0．3、lmg／kg)的降低密度脂蛋白胆固醇(LDL—C)疗效即相当于10倍量的阿托伐他汀，0．5mg／(kg·d)即可降低血胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)分别达7％～20％和10％～39％，对糖尿病合并高胆固醇血症的患者更为有效。与辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀和阿托伐他汀的对比研究表明，虽然彼此都能剂量依赖性地降低TC，但是匹代他汀药效最佳，是潜在的超级他汀[1]。 2.作用靶点 洛伐他汀分离自霉菌培养物，普伐他汀和辛伐他汀是通过对洛伐他汀的化学结构进行改进而得的半合成品，氟伐他汀则是第一个全合成的HMG—CoA还原酶抑制剂。他汀类药物结构中均有羟甲基戊二酸活性结构，只是存在形式不同。洛伐他汀和辛伐他汀是非活性内酯形式药物，必须代谢成其相应的开环羟基酸形式才能抑制HMG—CoA还原酶。普伐他汀以具有活性的开放酸盐结构存在，水溶性大，主要作用于肝脏，抑制肝脏胆固醇合成的能力比周围组织高400倍～1 200倍，因此，无明显抑制外周组织合成胆固醇的作用而不良反应少。洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀的结构和相对分子质量十分接近，在疗效、不良反应、耐受陛等方面仅程度上稍有差异。氟伐他汀结构与以上3种他汀类药物明显不同，是以氟苯取代吲哚环的甲羟戊酸内酯的衍生物，无需代谢转化就具有药理活性[2]。阿托伐他汀与氟伐他汀一样，均含有氟苯环和氮杂环，是全人工合成的第2个他汀类药物，二者与辛伐他汀和洛伐他汀相比，水溶性增大，脂溶性降低。罗伐他汀为单一对映体，以活性羟酸钙盐形式存在。除普伐他汀外，罗伐他汀比其它他汀类药物有更强的亲水性[3]。 3. 药代动力学 口服他汀类药物，阿托伐他汀和氟伐他汀几乎全被吸收，辛伐他汀吸收比较完全（80%-85%）,普伐他汀、洛伐他汀仅少量吸收（34%和31%）。食物除对洛伐他汀和普伐他汀的吸收有影响外，对其他他汀类药物均无影响。普伐他汀的亲水性强，其血浆蛋白结合率较低，为45%，其余4种血浆蛋白结合率都在95%以上。源于肝细胞的胆固醇是形成血胆固醇的主要原因，而源于非肝细胞的胆固醇是正常细胞所必需的，他汀类药物的主要作用部位是肝脏，其肝脏
如何正确服用他汀类药物
如何正确服用他汀类药物 他汀类药物，适于高胆固醇血症和以胆固醇升高为主的混合型高脂血症，是最全面的降脂药物，也是指南推荐的降脂首选药物，能够延缓动脉粥样硬化，全面防治冠心病、心肌梗死、脑卒中等心脑血管疾病。 根据半衰期的长短，可将他汀类降脂药可分为：短效类他汀，如辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、血脂康等；长效类他汀，如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀。 他汀类药物主要通过抑制合成胆固醇的酶发挥降脂作用。由于人体合成胆固醇的酶在夜间的活性最强，所以对于老一代他汀类药物如普伐他汀来说，最好在睡前服用，能够更好的抑制该酶，发挥最大的降脂效果。
但是，并非所有的他汀类药物都需要在睡前服用。 可以在早上服用的他汀：辛伐他汀正旨平。对于高胆固醇血症患者，一般 起始剂量为每天10mg，晚间顿服；对于冠心病患者可以20mg/日为起始剂量，晚间顿服。 但有多项临床研究结果提示： 1. 晨起服药组降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的作用略低于晚间服药组，但仍可使两者分别下降21%和31 %。 2. 晨起服药组降低甘油三酯的幅度明显优于晚间服药组（38%比19%）。与晚间服药相比，晨起服药可更能有效降低甘油三酯水平，调节轻中度混合性高脂血症患者的血脂异常。 需睡前服用的他汀：普伐他汀。成人开始剂量为10mg-20mg，一日1次，临睡前服用。应随着年龄及症状适宜增减，一日最高剂量40mg。 研究显示，睡前服用普伐他汀比上午服用的生物利用度低60%，但降脂疗效反而高。这表明肝脏在晚间摄取药物多，降脂效果更好。 需晚餐时服用的他汀：洛伐他汀。成人常用量为10-20mg，每日一次，晚餐时服用剂量可按需要调整，但最大剂量不超过每天80mg。 食物有利于增加洛伐他汀的吸收，空腹时服用洛伐他汀吸收减少30%，因此需晚餐时服用。 【特别提醒】血脂康中的主要降脂成分为洛伐他汀。推荐的剂量为一次2粒，一日2次，早晚饭后服用；轻、中度患者一日2粒，晚饭后服用。 可晚餐时或睡前服用的他汀：氟伐他汀。推荐剂量为20或40毫克，每日一次。晚餐时或睡前吞服。 在稳态状态下，与晚饭后4小时给药相比，晚饭后即时给药会导致血浆峰浓度降低2倍，达峰时间增加2倍。因此可以晚餐时或睡前吞服。
各种他汀类药物如何选择
精心整理 各种他汀类药物如何选择？ 他汀类药物因能安全有效地降低胆固醇、稳定逆转斑块，目前已成为抗动脉粥样硬化，降低心血管疾病风险的基石。临床常用的他汀类药物有洛伐他汀（美降之）、辛伐他汀（舒降之），普伐他汀（普拉固）、氟伐他汀（来适可）、阿托伐他汀（立普妥）、瑞舒代他汀（可定）以及匹伐他汀（力清之）。这么多他汀有什么不同，哪一种适合自己呢？他汀类药物有相同的功能团—羟基戊二酸，都具有相同的共性，如均可竞争性抑制胆固醇的合成。但因具有不同的取代基，故每个他汀类药又具有独特的异质性（个性）如药效学的强度（降脂效价）、药动学的参数、适应证、肌肾毒性的大小、相互作用的多少以及药物基因组学的影响等均不相同。下面从不同的几个方面对他汀类药物做一比较。他汀类药物分为天然化合物和完全人工合成化合物 1 天然化合物洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀 2 人工合成化合物氟 伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀、瑞舒伐他汀亲脂性对于他汀类药的肝选择性十分重要，而更高亲脂性的则可更多的分布于非肝组织如肌肉等（包括与受体结合力强、作用持续久、风险更大等），也就可能存在更多的肌肉安全性问题。他汀类药物是水溶性还是脂溶性，是由它们的油水分配系数或辛醇 / 水分配系数，他汀类药的油水分配系数与其吸收、分布、代谢、以及排泄强烈相关。无论亲水性他汀类药还是亲脂性他汀类药均有利有弊，而理想的分配系数应是中性，即不太疏水性也不太亲水性。他汀类药物亲脂性顺序依次为西立伐他汀＞辛伐他汀＞洛伐他汀＞氟伐他汀＞阿托伐他汀＞瑞舒伐他汀＞普伐他汀两类他汀类药分布方式的区别在于亲脂性他汀类药是通过被动转运和非选择性扩散进入肝细胞和非肝组织 ; 而亲水性他汀类
核酸疫苗的研究进展
核酸疫苗的研究进展 任晓峰1.2, 尹杰超2, 李一经2,李广兴2 李根喜1.* (1.南京大学生命科学学院,江苏,南京 210093; 2.东北农业大学动物医学院,黑龙江,哈尔滨 150030) 核酸疫苗又称基因疫苗，是指将编码某种抗原蛋白的外源直接导入动物细胞，在宿主细胞中表达并合成抗原蛋白，并激起机体一系列类似于疫苗接种的免疫应答；起到预防和治疗疾病的目的。自1990年Wolff 等人[1]意外发现核酸疫苗后，其相关的研究得到了广泛的重视，并得以迅速发展，誉为“第三次疫苗革命”。本文就核酸疫苗的构建、特性、免疫机制、接种方式、影响因素、研究现状和前景作一综述。 关键词关键词：：DNA，疫苗，免疫，综述 一 核酸疫苗的构建 核酸疫苗是由编码病原体抗原的基因和作为真核细胞表达载体的质粒DNA 组成。病原体抗原的编码基因可以是一组相关基因或单一病原体免疫保护性抗原基因，也可以是编码抗原决定簇的一段DNA 序列，其表达产物应是病原体的有效成分，可以引发保护性免疫。用于构建核酸疫苗的载体质粒多以pUC 或pBR322质粒为基本骨架，主要包括启动子、增强子和3’端多聚A 。巨细胞病毒（CMV ）启动子和ROUS 肉瘤病毒（RSV ）的启动子都可在哺乳类细胞内表达。另外也有人采用来自哺乳动物和禽类的启动子。Fynan [2]等1993年将编码流感病毒血凝素H 或H7的cDNA 片段插入CMV 质粒的转录调控元件的下游，构建了抗流感病毒的核酸疫苗，另外，乙型肝炎病毒[3]、人免疫缺陷综合症病毒[4]、脑膜炎病毒[5]等基因均被成功地克隆到含CMV 启动子的真核表达载体上，并表现了免疫活性。 用于构建核酸疫苗的病毒载体包括流感病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、脊髓灰质炎病毒等。1994年Castrucci-MR [6]把可以引起保护性免疫反应的致死性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）的表位基因片段克隆到流感病毒（H 1N 1）的基因组中制备核酸疫苗，免疫小鼠后，可使小鼠抵抗致死性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的攻击，其免疫效果可维持4个月以上。 二 核酸疫苗的特点 与传统的灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗具有如下特点[7]：（1）免疫效果好，基因疫苗能在宿主细胞中产生外源性蛋白，此种蛋白比原核生物表达系统中产生的蛋白更象天然分子，其抗原识别递呈过程与自然感染十分相似，从而引起几乎等同于感染这些病原体或弱毒疫苗免疫后所产生的免疫应答，并且避免了基因重组技术在体外合成的蛋白质抗原表位丢失或改变。（2）利用一种表达载体同时表达多种蛋白，诱导机体产生针对多种病原体的免疫应答，从而起到一次注射核酸疫苗同时预防和治疗多种疾病的效果，并可抵抗某些变异病原体的侵袭（3）核酸疫苗接种后，蛋白质抗原在宿主细胞内，可直接与MHC I 类和MHC II 类分子结合，引起广泛的细胞免疫和体液免疫，但无毒力返祖的危险（4）安全性好，由于核酸疫苗一般采用表达载体在动物细胞体内进行抗原表达，不与宿主染色体DNA 整合，但能在宿主体内表达，与病毒活疫苗相比，避免了病毒本身存在的复毒和病毒基因组整合到宿主染色体的危险（5）核酸疫苗具有共同的理化特性，可在同一载体上构建表达多种抗原，生产多价疫苗或同时注
他汀类药物治疗骨质疏松症的研究进展
他汀类药物治疗骨质疏松症的研究进展 (作者：___________ 单位： __________ 邮编：___________ ) 【关键词】他汀类药物骨质疏松症研究进展 他汀类药物(statins)是最近20年公认为降低血浆低密度脂蛋白(LDL)和血浆胆固醇(CH)的有效药物，因为该药疗效显著，不良反应小，耐受性好，受到临床应用的重视和好评。目前国际上常用的他汀类药物至少有8种，包括洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin) 、辛伐他汀(simvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin) 、 阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、贝伐他汀(bervastatin) 及尼伐他汀(niavastatin)。近年来发现以辛伐他汀为主的他汀类药物可促进骨形成、减少骨折发生率、恢复骨骼微结构、增加骨骼强度等优点，但其确切的机制尚不清楚。医学界已高度关注该药在骨质疏松性骨折方面的应用研究，现认为他汀类药物属于3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，通过抑制胆固醇合成链中的限速酶还原酶减少胆固醇合成，临床广泛应用于降低胆固醇及预防心血管疾病；与此同时，他汀类药物同样具有激活成骨细胞，促进骨合成代谢作用，并且不同浓度剂量对骨合成代谢作用也不同，这一特性为临床治疗骨质疏松性骨折提供了新的思路，并成为目前研究成骨
作用的一个热点。现就其研究进展作综述。 1实验研究进展 1.1体外实验研究进展 1999 年Mundy等: 1］将大鼠BMP-2启动子(一2736/+114 bp) 携带的荧光素酶标记的基因转染到存活的大鼠成骨细胞上，通过观察荧光活性来评价启动子的作用。在30000多种化合物中发现他汀类药物(洛伐他汀)是唯一能增加这些细胞荧光活性的物质。Sugigama等:2］验证了他汀类药物可增强BMP-2及其基因的表达。辛伐他汀、美伐他汀及氟伐他汀都有该作用，但水溶性更好的普伐他汀却无此作用。在国内，宋纯理等］3］通过体外培养成年小鼠的成骨细胞进行研究，结果发现洛伐他汀作用72h后，成骨细胞胞浆内BMP-2表达水平增高，认为BMP-2是有效刺激成骨的细胞因子，不仅可以促进成骨细胞及其前体细胞的增殖，还促进成骨细胞的分化，甚至还促进肌细胞的前体细胞系分化为成骨细胞而抑制肌细胞的分化。蔡俊等］4］在观察辛伐他汀成骨分化功能的影响时发现，实验组与对照组比较，实验组Cbfa 1蛋白表达水平增高，ALP比活性增高且骨钙素含量增加，结论为1X 10-7mol/L辛伐他汀能够促进人骨髓基质干细胞成骨分化，此种促进作用可能与辛伐他汀增强其分化过程中相关蛋白的表达有关。余向前等］5］通过对人的骨髓基质细胞体外发现辛伐他汀通过促进成骨细胞相关基因的表达，从而促进hBMS成骨分化，同时具有抑制细胞增殖作用。在他汀类药物的体外试验中，多数学者认为他汀药物有促
-不同他汀类药物的分类比较
不同他汀类药物的分类比较 动脉粥样硬化性心血管病（ASCVD）是导致老年人死亡和影响生活治疗的主要疾病，随着年龄的增长，ASCVD的发病率和死亡率逐渐增加。血脂异常作为ASCVD事件的独立危险因素，控制血脂水平已成为当前预防与治疗ASCVD 的主要方式。临床常规检验提供的血脂参数主要包括总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)与甘油三酯（TG）。其中LDL-C水平与ASCVD的发病风险相关性最大，LDL可通过血管内皮进人血管壁内，在内皮下滞留的LDL被修饰成氧化型LDL，后者被巨噬细胞吞噬后形成泡沫细胞，泡沫细胞不断增多融合，构成动脉粥样硬化斑块的脂质核心。因此，应将LDL-C作为控制血脂异常的主要干预靶点。他汀类药物能明显的降低LDL，显著改善患者预后，具有最充分的临床研究证据，是被国内外各大指南推荐首选的调脂药物。 他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，可抑制内源性胆固醇合成的限速酶HMG-CoA还原酶降低胆固醇和脂蛋白水平，同时还可增加肝脏细胞表面LDL受体以增强LDL的摄取和分解代谢，减少体内LDL水平，从而通过上述药理机制发挥调脂作用。本院常用的他汀类药物有氟伐他汀（来适可）、普伐他汀（富利他之）、辛伐他汀（舒降之）、阿托伐他汀（阿乐、尤佳、立普妥）和瑞舒伐他汀（可定）等。本文通过不同他汀类药物的作用强度、药动学特征、不良反应等方面来介绍各药物的特点，以保障他汀类药物的合理应用。 1.作用强度：胆固醇治疗的目标值根据患者具体病情需使LDL-C降低至<1.8、 2.6或 3.4mmol/L（详见相关指南）。不同他汀类药物降LDL-C强度差异明显，以LDL-C降幅38%为例，每日需氟伐他汀80mg、普伐他汀40mg、辛伐他汀20mg、阿托伐他汀10mg、瑞舒伐他汀<5mg。结合本院各他汀药物剂量和常规用法用量（富利他之20mg，qn；来适可40mg，qn；舒降之20mg，qn；阿乐、立普妥20mg，qd，尤佳10mg，qd；可定10mg，qd），可推算普伐他汀（富利他之）、氟伐他汀（来适可）具有低强度的降脂作用（使LDL-C降低<30%），而辛伐他汀（舒降之）、阿托伐他汀（阿乐、尤佳、立普妥）和瑞舒伐他汀（可定）具有中等强度的降脂作用（使LDL-C降低30-50%）。可见同等剂量他汀类药物
他汀类药物抗炎作用研究进展
Co ll Cardi o l ,1995,25:1105-1110.[24]H am a N , Itoh H ,Sh irakam i G ,et al .R ap id ventricular inducti on of brain natriuretic pep tide gene exp ressi on in experi m ental acute m yocardial infarcti on [J ].C irculati on ,1995,92:1558. [25]K ikuta K ,Yasue H ,Yo sh i m ura M ,et al . Increased p las m a levels of B 2type natriuretic pep tide in patieats w ith unstable angina [J ].Am H eart J ,1996,132:101-107.[26]M arumo to K ,H am ada M ,H i w ada K . Increased secreti on of atrial and brain natriuretic pep tides during acute m yocardial ischaem ia induced by dynam ic exercise in patients w ith angina pecto ris [J ].C lin Sci (Co lch ),1995,88:551-556. [27]T al w ar S,Squire I B,Dow nie PF,et al .P las m a N ter m inal p ro 2brain natriuretic pep tide and cardi o troph in I are raised in unstable angina [J ].H eart ,2000,84:421-424. [28]Om land T ,delemo s JA ,M o rrow DA ,et al .P rogno stic value of N -ter m inal p ro 2atrial and p ro 2brain natriuretic pep tide in patienis w ith acute co ronary syndrom es [J ].Am J Cardi o l , 2002,89:463. [29]GalvaniM ,O ttani F ,M urena E ,et al .N -ter m inal p ro 2brain natriuretic pep tide on adm issi on has p rogno stic value acro ss the w ho le spectrum of acute co ronary syndrom es [J ].J Am Co ll Cardi o l ,2003,41:402. [30]Tom as J ,Stefan J ,Bertil L ,et al .N T 2p ro BN P in unstable co ronny artery disease 2experiences from the FA ST ,GU STO I V and FR ISC trials [J ].Eur J H eart Fail ,2004,6:319-325.[31]Cheng V ,Kazanagra R ,Garcia A ,et al .A rap id bedside test fo r B 2type pep tide p redicts treatm ent outcom es in patients adm itted fo r decompensated heart failure :a p ilo t study [J ].J Am Co ll Carodi o l ,2001,37:386-391.[32]FR IS C -2investigato rs . Invasive compared w ith non 2invasive treatm ent in unstable co ronary artery disease :FR ISC p ro spective random ized m ulticentre study [J ].L ancet ,1999, 354:708. (收稿日期:2005-09-14) 他汀类药物抗炎作用研究进展 作者单位:11武警总医院心内科,北京市 100039;21武警宁夏总队医院,银川市 750004 作者简介:杨胜利(1965-),博士后,副主任医师,副教授。主要从事心血管病临床和介入治疗。E 2m ail :yangshengli @m edm ail .com .cn 杨胜利1,薛爱英2,刘惠亮1 关键词:洛伐他汀,辛伐他汀,西斯伐他汀类;降血脂药;抗炎剂文章编号:100820074(2006)0420409204 中图分类号:R 97216文献标识码:A 3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A (3-hydroxy -3-m ethyl glutaryl coenzym e A ,HM G -CoA )还原酶抑制剂,常称为他汀类(statins ),是临床最常用的调血脂药物。胆固醇 合成主要在过氧化物酶体(peroxisom es )和内质网 (endop las m ic reticulum ,ER )进行,规律性的在每天晨3∶00 ～5∶00达高峰[1] 。他汀类通过抑制胆固醇合成的关键性限速酶HM G -CoA 还原酶,从而阻断肝细胞的内源性胆固醇合 成。具体作用机制是使低密度脂蛋白胆固醇(LDL -C )受体表达增加。近年研究他汀类具有抗栓作用[2],除此之外,也能影响其它许多具有代谢作用的化合物合成。人们逐渐认识到动脉粥样硬化是一种炎症疾病,而临床他汀类应用获得了极大益处,提示其具有抗炎(anti -inflamm ato ry )作用[3] 。下面阐明他汀类抗炎作用的最新进展。 1 炎症在动脉粥样硬化发病机制中独立作用的证据 高胆固醇促进动脉粥样硬化形成,也可通过组织因子表达增加引起血栓形成[4,5]。氟伐他汀可减少组织因子从而减少血栓形成,除了降血脂作用之外,还有其它作用如减少R ho 蛋 白Cdc 42的异戊(间)二烯基化(p renylati on )[6]。血液循环中急性相蛋白C -反应蛋白(C -reactive p ro tein ,CR P )和纤维 蛋白原(fibrinogen )等可预测血管事件的发生[7,8]。 2 他汀类抗炎作用的实验和临床证据 他汀类可改善高胆固醇血症病人的内皮功能,使用辛伐他汀一月后可明显提高内皮依赖性血管舒张功能,说明来自于内皮的一氧化氮生物利用度是增加的。同样,用洛伐他汀5月后可改善行经皮冠脉介入治疗(percutaneous co ronary interventi on ,PC I )病人的冠脉内皮功能。他汀类可产生使斑块稳定的组织学改变。从经动脉内膜切除术获得的颈动脉粥样斑块分析,普伐他汀具有增加胶原和降低血脂、炎症细胞侵润、金属蛋白酶(m etallop ro teinase enzym es )和细胞死亡的作用。CR P 是一种炎性标记物并且有一种潜在的致动脉粥样硬化作用[9,10],普伐他汀可使CR P 水平降低[11]。 211 心脏移植 在97例心脏移植中用普伐他汀,使血管病变减少,1年存
他汀类药物研究进展综述
他汀类药物研究进展综述 心血管疾病是当今世界上威胁人类健康的重要疾病之一，1994年的统计数据显示,当时40%的死亡原因为心血管疾病，目前这一情况正在进一步恶化。对心血管危险因素的调查表明，中国人群中80.5%的个体心血管危险因素超过1个，其中血脂紊乱是发生率最高的危险因素。可见，在动脉粥样硬化的防治中，他汀类药物扮演着重要角色。他汀类药物可有效抑制胆固醇的合成，其调脂治疗的益处毋庸置疑。 过去医药界防治心血管疾病侧重在降压药的开发上，先后发明了不少有效的降压药。但是随着医药科学的不断发展，人们认识到高胆固醇、高脂肪等是发生心血管疾病的基本病因，高血脂是发生冠心病及高血压的主要危险因素。因此，人们把血脂调节药物的开发作为防治心血管疾病的重点来抓。自20世纪80年代末起，降血脂药物大量推出，其中他汀类药物受到人们好评，其临床疗效是其它各类调节血脂药物所不能相比的。 1、他汀类降脂药概述 他汀类药物（statins），即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A （3-hydroxy-3-methyglutaryl-coenzyme，HMG-CoA）还原酶抑制剂。大量基础研究和临床试验显示，他汀类药物不仅具有强大的降脂作用，还具有独立于其降脂作用之外的“多重效应”，如：改善血管内皮功能、抑制炎症和抗氧化反应、抗血小板聚集和抑制血栓形成、稳定粥样硬化斑块、抑制心肌细胞重塑和心肌细胞凋亡、抑制心脏电生理重塑和调节心脏植物神经功能等一系列作用。4S研究、CARE研究、LIPID研究等大规模临床试验结果显示，一些他汀类药物在迅速降低异常高的血浆总胆固醇（TC）水平的同时，可显著降低冠心病发病率、死亡率、降低总死亡率，在冠心病的一级预防和二级预防中发挥了重要作用，因此，他汀类药物的出现是心血管疾病治疗史上一个重要的里程碑，并成为目前临床上用于治疗各类高脂血症、防治动脉粥样硬化及冠心病的主力血脂调节药物，也是全球医药市场著名的“重磅炸弹”级药物[1]。 世界上第一个上市的他汀类药物是美国默克公司研制开发的洛伐他汀（Lovastatin），于1987年在美国上市。80年代末上市的他汀类药物还有1988年
他汀类药物临床应用的研究进展
他汀类药物临床应用的研究进展 刘景文111田义梅21（1.天津市第二医院天津300000；2.天津市北辰医院天津300000） 摘要：他汀类药物的降脂疗效确切，近年来，关于其在心脑血管病、肾脏疾病、糖尿病、免疫调节及抗炎等方面的研究增多，笔者现对其近年来的应用及研究进展做一综述。 关键词：他汀类 中图分类号：R45222222222222222222文献标识码：B22222222222222222文章编号：1672-8351（2011）05-0048-02 他汀类药物属三羟基三甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，是医学界降脂治疗的重大进步。该类药以其有效降脂作用应用于临床，近年来，专家学者关注他汀类药物降脂之外的其他作用。笔者对近年来关于他汀类药物的研究进展及临床应用情况综述如下。 1药理学 1.1药代动力学 他汀类药物药代动力学与其转运体及酶多态性密切相关[1]。第一代他汀类药物进入人体后经代谢产物β-羟酸发挥作用。洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀口服后分别于2～4h、1.3～2.4h、1～1.5h达血药浓度高峰，有效成分生物利用率为5%，生物半衰期约1～2h。第二代他汀类药物与第一代结构不同，由荧光团取代吲哚环，起效快。阿伐他汀口服血药浓度高峰在1～2h 出现，生物利用率约12%，生物半衰期约14h，肝代谢产物起到70%的作用，药效长达20～30h。氟伐他汀口服吸收达90%，蛋白结合率达99%，生物半衰期短，仅0.5～0.8h，是目前活性最强、分子量最小、副作用最少的他汀类药物，但起效慢。 1.2作用机制 在体内，他汀类药物竞争性抑制HMG-CoA还原酶活性，阻断肝内胆固醇合成，减少极低密度和低密度脂蛋白（VLDL、LDL）合成，增加肝内LDL受体，促使血LDL向肝内转移，加速血液LDL清除，耗竭细胞内胆固醇，使极低密度脂蛋白 缺血再灌注模型，观察了广枣对肾缺血再灌注后MDA及SOD 的影响。结果表明：使用广枣组与单纯肾缺血再灌注组比较，MIDA含量明显下降，SOD活性显著增强。说明广枣可抑制体内脂质过氧化反应，减轻肾脏损伤。使用广枣后，Na，K-ATP酶和Ca2-ATP酶活性较单纯缺血再灌注组均有显著提高，说明广枣能抑制肾缺血再灌注时引起的肾功能损伤。 广枣为中蒙医常用药物，毒副作用很小，且疗效好，可在临床上推广使用。[10] 除以上方剂外，安神镇惊丸由沉香、肉豆蔻、广枣、白云香、黑云香、丁香、檀香等中药组成，用于心跳气短、气血瘀滞、胸肋刺痛、失眠多梦、神经衰弱；肉寇五味丸由肉豆蔻、土木香、木香、广枣、荜茇组成，用于治疗冠心病、心绞痛、心肌供血不足、心慌、胸闷、心烦失眠、心神不安、神经衰弱、失眠多梦等症；八味沉香口服液主要成分为沉香、诃子、肉豆蔻、木香、广枣、木棉花、石膏和白云香。主要用于治疗室性早搏。 4广枣研究的阐释与展望 长期以来广枣主要用作蒙药材，对含广枣的传统方剂进行药理方面的深入研究，可确切其疗效，为研制新药提供依据。 广枣药材资源丰富，疗效可靠，有广阔的开发应用前景。广枣化学成分的研究必将有助于推进广枣药材和复方制剂的标准化和国化进程，为新型蒙药制剂的开发应用提供理论依据。 《内蒙古蒙成药标准》共收载内服药101种，含广枣制剂就有11种，约占10％。广枣作为藏蒙医常用药材配伍应用于临床，用于气滞血淤、心区作痛、心悸气短、心神不安等心肌缺血病症的治疗，经大量的临床研究已验证其疗效可靠。但是，尚缺少可用于药材鉴别和生药质量标准的特征成分及有效成分含量测定的控制指标。因此，有必要在参考临床用药经验的基础上，结合药理学研究，对广枣中的化学成分进行系统的研究，以期确定其中有治疗作用的活性部位或活性成分，并结合现代科学对心肌缺血损伤机制的最新研究成果，对广枣提取物中有抗心肌缺血作用的活性部位进行深入的药理学实验研究，以探讨广枣对急性实验性心肌缺血损伤保护作用的机理。为进一步阐明广枣中抗心肌缺血作用的主要活性部位、活性成分和作用机理，为广枣药材和制剂建立科学可控的质量标准，为更好地应用于临床和开发利用其资源提供科学的依据。参考文献 [1]百科词条.广枣.互动百科https://www.360docs.net/doc/a617177919.html,/wiki/ [2]樊海燕,赛音,宋一亭.蒙药广枣的研究进展[J].中草药, 2004,35(3):353-355. [3]唐丽,李国玉,杨柄友,匡海学.广枣化学成分的研究[J].中草药,2009,(4).541-3. [4]田景民.广枣化学成分的研究[D].内蒙古医学院,2007. [5]连珠,张承忠,李冲,周亚伟.蒙药广枣化学成分的研究[J].中药材,2003,(1). [6]赵宗孝,张昕原,巴根那.蒙药材清除自由基作用的比较[J].内蒙古民族大学学报（自然科学版）,2004,19（1）69-71. [7]李长伟，崔承彬，蔡兵.南酸枣的研究进展[J].解放军药学学报,24(3)231-33. [8]梁杨静,兰薇,桑柏,申旭霁.三味檀香散的药理研究进展[J].云南民族大学学报(自然科学版),2010,(2)87-9. [9]邓套图格,奥·乌力吉,赵明.蒙药八味沉香散治疗冠心病心绞痛的临床疗效观察[J].中国实用医药,2009;4(25)165-166. [10]张振涛,吴仁奇,张威.广枣对肾缺血再灌注损伤的保护作用研究[J].现代中西医结合杂志,2003,(18)1942-3.
Aptamer核酸药物的研究进展
作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室(汪治清、杨新科);北京军区第二六一医院(佟玉品)#综述# Aptamer核酸药物的研究进展汪治清佟玉品杨新科 Ap tamer指的是能结合蛋白或其他小分子物质的单链或双链寡核苷酸112。体外筛选技术的发展和PCR技术的应用,使得Ap tamer的研究近年来有了长足的进步,筛选到了一大批能与各种蛋白或小分子特异紧密结合的核酸分子(Aptamer)。这些Aptamer包含了RNA、双链DNA、单链DNA 等多种形式的寡核苷酸,其配体的性质各异。体外筛选Aptamer不仅增强了人们对核酸-蛋白相互作用的认识,也为寻找新药提供了一条途径。Aptamer核酸药物的研究近年来也取得了一些可喜成果。我们拟就该方面的进展及相关问题作一综述。 1Aptamer筛选的一般程序及要点 各种分子的Aptamer筛选的程序大同小异,多采用亲合方法,即固定配体,使之与扩增的寡核苷酸库混合培养,待配体与寡核苷酸结合后洗去非结合核酸,然后洗脱配体-aptamer复合物,回收核酸,扩增,再进入下一轮筛选。RNA 寡核苷酸库多从相应的DNA库转录而来,单链DNA库通过不对称PCR或从双链DNA库变性而来。 Aptamer筛选最重要的一条是如何保证核酸库的多样性。从理论上讲,自由核酸的长度越大,库容就越大,但一般说来与蛋白或其他分子相互作用的核酸序列不会超过100bp,多集中于15~45bp之间。对双链DNA来说,库容达1013便可进行有效筛选,单链DNA及RNA库容要求更低。为保证PCR扩增的效果,寡核苷酸两端应为AT丰富区且不应有对称结构。PCR扩增时,为防止某些特殊序列的超比例扩增,循环次数一般不超过20次,但为保证库容量,加大体系进行大规模扩增是必需的。 2病毒相关的aptamer核酸药物 用于抗病毒的aptamer多RNA分子,与病毒基因表达调控有关的蛋白作为其作用靶点,如HIV的Rev、Tat、RT及HCV的NS3等均是理想的作用靶点。 HIV的Rev蛋白是一相对分子质量为19000的调节毒粒蛋白表达的蛋白,主要功能是促进HIV基因表达由早期(转录调节蛋白mRNA)向晚期(转录HIV结构蛋白mRNA)的转化及促进晚期转录的进行,还在转运结构蛋白mRNA进入细胞质的过程中发挥作用。Rev蛋白的上述作用是通过与env和gag-p ol mRNA上的一段234碱基的Rev效应元RRE的特异结合来实现的,而这种结合主要是Rev蛋白中富含碱性氨基酸的14肽段与RRE二级结构B茎区(60base),特别是其中46~48位的GGG的特异结合。RRE区核苷酸被部分乃至全部随机变用以寻找更高亲和力的序列,从含32个随机核苷酸的RNA库中发现了新的Rev结合序列122。Ye等132还测定了一Rev-aptamer复合物在可溶状态下的结构,发现了G-A,A-A的/错误0匹配及UAU三联核苷酸与Rev中,两个精氨酸侧链的相互作用,为以Rev为靶点的药物设计提供了新的思路。 RNA aptamer用于治疗,必须能被有效转录,在体内能抵抗快速降解,并能正确折叠且快速到达有效部位。Good 等142基于人tRNA Met和U6SnRNA启动子,构建了一个表达盒,用于治疗的小分子RNA被保护在其中。在细胞中,全长的转录产物高达2@107~1@109个,插入的HIV Rev结合序列则能有效的抑制HIV-1的基因表达,在AIDS的基因治疗方面展示了良好的应用前景。Konopka等152比较了Rev-ap tamer及针对HIV-1Rev基因的核酶的抑制病毒作用,发现Rev-ap tamer能有效抑制病毒p24的产生,与核酶具有相近的效果,且核酶并不能增强aptamer的抑制作用。人们对于这些核酸药物的输入方式也作了一些探讨,发现脂质体内不仅能保护核酸免受核酸酶的降解,也能有效地进入细胞。进一步实验发现在RSV启动子下,这一RNA-aptamer可使病毒产生降低88%,C MV启动子自身能与HIV争夺转录因子,从而抑制病毒的复制,因而不适用于检验aptamer的抗病毒作用162。 T at蛋白是HIV反式激活蛋白。TAR(反式激活效应元件)位于HIV基因组+1到+57~+60位。TAR RNA在+1~ +59位间形成一个由4段茎区和1段6核苷酸环区的稳定二级结构,在第ó及第?茎区之间由UCU构成一个凸出部,是T at的结合位点。Tat与完整TAR结合,加上与其他细胞因子及上游启动子、增强子的结合来诱导HIV在细胞中的复制。针对T at蛋白的RNA-aptamer被设计成与TAR竞争性结合tat以阻止病毒复制。Lisziewicz172构建了一质粒,将50个串联的TAR RNA置于HIV-1LTR之下,在瞬时转染试验中,能抑制90%受tat调节的基因的表达,若将gag RNA特异性核酸引入该质粒,在人T细胞系Molt3中能抑制99%HIV-1或SIV的复制,并可维持14个月之久。Sullenger等182则将TAR与tRNA Met嵌合在一起,通过RNA聚合酶的作用来获取大量的TAR,与Tat结合以防止HIV在细胞中的复制。
各种他汀类药物如何选择
精心整理 各种他汀类药物如何选择？ 他汀类药物因能安全有效地降低胆固醇、稳定逆转斑块，目前已成为抗动脉粥样硬化，降低心血管疾病风险的基石。临床常用的他汀类药物有洛伐他汀（美降之）、辛伐他汀（舒降之），普伐他汀（普拉固）、氟伐他汀（来之）成。:以及排泄强烈相关。无论亲水性他汀类药还是亲脂性他汀类药均有利有弊，而理想的分配系数应是中性，即不太疏水性也不太亲水性。他汀类药物亲脂性顺序依次为西立伐他汀>辛伐他汀>洛伐他汀>氟伐他汀>阿托伐他汀>瑞舒伐他汀>普伐他汀两类他汀类药分布方式的区别在于亲脂性他汀类药是通过被动转运和非选择性扩散进入肝细胞和非肝组织;而亲水性他汀类
药则更多的是依靠主动转运进入到肝脏与非肝组织如肌肉等。匹伐他汀属于亲脂性的 1半衰期阿托伐他汀钙、瑞舒伐他汀、匹伐他汀半衰期大于10小时，属于长效他汀，可以在一天任何时间服用。其他半衰期较短，需要晚上睡前服用。2药物代谢除了普伐他汀不需要经过肝脏代谢外，其他或多或少都要 特性: 剂等; 的他汀类药物半衰期较短，所以一般要求在临睡前服用，而阿托伐他汀、瑞舒伐他汀及匹伐他汀因具有较长的半衰期及较好的降脂疗效，可于一天内任意固定时间服用。食物可促进洛伐他汀及辛伐他汀的吸收，最好晚餐时服用；对其他药物并无明显影响。美国血脂新指南将他汀类药物治疗按强度分为三类：1降低LDL-C水平2降低LDL-C水平30%~50%称为中强度3
降低LDL-C水平>50%称为高强度若要降低LDL-C水平>50%，指南只推荐阿托伐他汀和瑞舒伐他汀。因此，这两种药物也称为强效他汀。虽然常用的7个他汀类药物都具有降脂作用，但由于它们化学结构功能团的不同，其适应证也有差别。美国食品药品管理局(FDA)批准7种他汀类药的适应证就各不相同，（见下表“√”表示可于相应疾病的治疗）。2007年3月8日FDA致死 中他汀类药物相关的肌肉不良反应进行了分析。结果表明，瑞舒伐他汀肌肉不良反应明显高于阿托伐他汀、辛伐他汀。而普伐他汀与洛伐他汀肌肉不良反应为最低。6种他汀类药物肌肉事件发生率从高到低依次为：瑞舒伐他汀>氟伐他汀>阿托伐他汀>辛伐他汀>普伐他汀>洛伐他汀他汀在肾安全性方面存在异质性。肾功能良好的患者使用他汀是安全的。估算肾小球
主要他汀类药物的作用区别
他汀类药物是治疗高胆固醇血症的首选药物。它具有抑制人体合成胆固醇、降低血中甘油三酯浓度的作用。一般的他汀类药物适用于治疗除纯合子家族性(遗传性)高胆固醇血症以外的任何类型的高胆固醇血症(在他汀类药物中唯有辛伐他汀对于纯合子家族性的高胆固醇血症有一定的疗效)。短期内服用他汀类药物较为安全，长期服用此药则容易产生副作用。所以长期服用此药的患者应定期检查其血丙氨酸氨基转换酶及肌酸激酶等项目。本类药不宜与烟酸、贝特类、环胞霉素合用，以免引起严重的肌肉及肝、肾功能损害。 他汀分为天然他汀(如洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀)和完全人工合成他汀(如氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀、匹伐他汀)是最为经典和有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗。 天然他汀是从生物中提取得到的，如美伐他汀可以从橘青霉的发酵产物中分离得到，因而也叫做生物他汀。相应的，完全人工合成的他汀则被称为化学他汀。 目前，主要认为，化学他汀本身没有生物活性，服用以后，需要肝脏分泌羧基脂酶对其激活以后，才能抑制肝脏合成脂类物质。酶解过程会产生化学性肝损伤；而天然他汀是一种生物活性物质，不需要酶解，进入人体后可以直接发生作用。其降脂作用比化学他汀强，也不存在个提差异。 辛伐他汀，与其余他汀类药不同的是，它对于纯合子家族性高胆固醇血症的病人也有一定的治疗效果。辛伐他汀适用于治疗伴有冠心病的高胆固醇血症的病人。值得注意的是辛伐他汀不能与四氢萘酚类钙通道阻滞剂米贝地尔合用。用法：成人的初始用药剂量是每次口服10毫克，每日服1次，晚睡前服用。以后可根据病人的病情调整用药剂量，但最大的用药剂量不可超过每日80毫克。纯合子家族性高胆固醇血症的病人，也可服用辛伐他汀进行治疗，每日40毫克，饭后顿服。如果病人的胆固醇仍无下降的趋势，可每天将80毫克的辛伐他汀分3次服用，即早饭后、午饭后，各服20毫克，晚饭后服40毫克。 阿托伐他汀，此药是一种新合成的他汀类降脂药物，其副作用较小。阿托伐他汀与其他他汀类药物相比，在与别类降脂药物联合应用时，其不良反应的发生率最低。并且，阿托伐他汀的降脂作用较强。用小剂量的阿托伐他汀，即能明显地降低血中胆固醇的浓度。用法：每天晚饭后口服一次。成人从每天10毫克的剂量开始服用。之后，根据病情调整用药剂量。成人每日用药的最大剂量不可超过80毫克。 匹伐他汀，初始剂量在降低低密度脂蛋白方面同阿托伐他汀相同，并且其药物相互之间的作用发生较少等特点有潜力成为治疗脂质异常症的标准药物。通常成人每次1～2mg匹伐他汀，每天1次，饭后口服。根据年龄、病情可以酌情增减药量，低密度脂蛋白值下降不明显时，可以考虑增加药量，每天的最大用药量为4mg。匹伐他汀与其他他汀药物比有其独到之处，由于有良好的降血脂作用而被称为“超级他汀”，因除显著降低低密度脂蛋白外，同时在升高高密度脂蛋白与降低甘油三酯的能力强于其他的他汀类药物，具有良好的安全性和耐受性。由于对血糖水平无影响，对伴糖尿病、代谢综合症的高脂血症患者更为适合。
核酸定量检测方法研究进展
收稿日期：2014-05-07 *通信作者：E-mail: bdd114@https://www.360docs.net/doc/a617177919.html, 核酸定量检测方法研究进展谢浩，胡志迪，赵明，甘绍举，丁先锋* (浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018) 摘要：核酸相关的研究和应用广泛存在于各个学科领域，与之相关的核酸定量检测技术越来越受到研究人员的重视。本文对目前实验室广泛采用的和近几年进展迅速的核酸定量方法(包括紫外分光光度法、荧光染料法、实时荧光定量PCR法、数字PCR法等)进行介绍，着重阐述其检测原理和优缺点，为研究人员今后进行相关研究提供参考。 关键词：核酸；定量；检测方法 Research progress of the methods for nucleic acid quantitive detection XIE Hao, HU Zhidi, ZHAO Ming, GAN Shaoju, DING Xianfeng* (College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Zhejiang 310018, China) Abstract: Nucleic acid-related research and applications is widespread in various disciplines. Researchers pay increasing attention to the nucleic acid quantitative detection technologies. Focusing on the detection prin-ciple and the merits and demerits, we will introduce some technologies (including ultraviolet spectrophotom-etry, fluorescent dye method, RQ-PCR, dPCR, etc.) that are widely used in laboratories and the rapid research progress of those technologies in recent years, so as to provide a reference for the future researches. Key Words: nucleic acid; quantitation; detection method 核酸(nucleic acid)是由核苷酸组成的一类生物大分子，是组成生物的最基本物质之一，具有贮存和传递遗传信息等生物学功能。与核酸定量技术相关的应用十分广泛，例如定量检测血浆中游离的循环DNA(free circulating DNA)用于疾病诊断[1]，法医取证DNA用于案件侦破[2]、组织病理学和基因测序技术的研究[3]，建立核酸的分子信标[4]等。往往定量方法的灵敏度及准确度需要达到较高的标准，紫外分光光度法是实验室常用的DNA定量方法，但随着仪器的进步，用于定量的核酸已从μg 发展到ng级别。国外普遍采用放射免疫法、荧光分光光度法、定量PCR法和DipstickTM试剂盒等进行DNA定量研究。 由于放射免疫法涉及同位素，而荧光分光光度仪、定量PCR仪和DipstickTM试剂盒又价格昂贵，因此在很大程度上限制了此类研究的开展。如何做到简便精确地定量核酸是生物计量研究的重点之一，也是现代化学和生物学领域研究面临的难题之一[5]。在许多微量核酸定量检测的方法中，检测样品易受到盐离子浓度、pH及残留的核酸提取试剂的影响，而且样品的核酸含量受到提取技术的限制，容易遗损，一旦影响到检测结果，就会造成很大的误差。常见的核酸定量方法种类繁多，但多数方法都需要一种基准方法，用于核酸分析和核酸定量水平进行评估，最新核酸定量基准的潜在方法有酶解同位素稀释质谱法，电感耦合等离子体联用定磷法和数字PCR拷贝数计数法，但是三种基准方法均不成熟，国际上尚