Aptamer核酸药物的研究进展

作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室(汪治清、杨新科);北京军区第二六一医院(佟玉品)#综述#
Aptamer核酸药物的研究进展汪治清佟玉品杨新科
Ap tamer指的是能结合蛋白或其他小分子物质的单链或双链寡核苷酸112。

体外筛选技术的发展和PCR技术的应用,使得Ap tamer的研究近年来有了长足的进步,筛选到了一大批能与各种蛋白或小分子特异紧密结合的核酸分子(Aptamer)。

这些Aptamer包含了RNA、双链DNA、单链DNA 等多种形式的寡核苷酸,其配体的性质各异。

体外筛选Aptamer不仅增强了人们对核酸-蛋白相互作用的认识,也为寻找新药提供了一条途径。

Aptamer核酸药物的研究近年来也取得了一些可喜成果。

我们拟就该方面的进展及相关问题作一综述。

1Aptamer筛选的一般程序及要点
各种分子的Aptamer筛选的程序大同小异,多采用亲合方法,即固定配体,使之与扩增的寡核苷酸库混合培养,待配体与寡核苷酸结合后洗去非结合核酸,然后洗脱配体-aptamer复合物,回收核酸,扩增,再进入下一轮筛选。

RNA 寡核苷酸库多从相应的DNA库转录而来,单链DNA库通过不对称PCR或从双链DNA库变性而来。

Aptamer筛选最重要的一条是如何保证核酸库的多样性。

从理论上讲,自由核酸的长度越大,库容就越大,但一般说来与蛋白或其他分子相互作用的核酸序列不会超过100bp,多集中于15~45bp之间。

对双链DNA来说,库容达1013便可进行有效筛选,单链DNA及RNA库容要求更低。

为保证PCR扩增的效果,寡核苷酸两端应为AT丰富区且不应有对称结构。

PCR扩增时,为防止某些特殊序列的超比例扩增,循环次数一般不超过20次,但为保证库容量,加大体系进行大规模扩增是必需的。

2病毒相关的aptamer核酸药物
用于抗病毒的aptamer多RNA分子,与病毒基因表达调控有关的蛋白作为其作用靶点,如HIV的Rev、Tat、RT及HCV的NS3等均是理想的作用靶点。

HIV的Rev蛋白是一相对分子质量为19000的调节毒粒蛋白表达的蛋白,主要功能是促进HIV基因表达由早期(转录调节蛋白mRNA)向晚期(转录HIV结构蛋白mRNA)的转化及促进晚期转录的进行,还在转运结构蛋白mRNA进入细胞质的过程中发挥作用。

Rev蛋白的上述作用是通过与env和gag-p ol mRNA上的一段234碱基的Rev效应元RRE的特异结合来实现的,而这种结合主要是Rev蛋白中富含碱性氨基酸的14肽段与RRE二级结构B茎区(60base),特别是其中46~48位的GGG的特异结合。

RRE区核苷酸被部分乃至全部随机变用以寻找更高亲和力的序列,从含32个随机核苷酸的RNA库中发现了新的Rev结合序列122。

Ye等132还测定了一Rev-aptamer复合物在可溶状态下的结构,发现了G-A,A-A的/错误0匹配及UAU三联核苷酸与Rev中,两个精氨酸侧链的相互作用,为以Rev为靶点的药物设计提供了新的思路。

RNA aptamer用于治疗,必须能被有效转录,在体内能抵抗快速降解,并能正确折叠且快速到达有效部位。

Good 等142基于人tRNA Met和U6SnRNA启动子,构建了一个表达盒,用于治疗的小分子RNA被保护在其中。

在细胞中,全长的转录产物高达2@107~1@109个,插入的HIV Rev结合序列则能有效的抑制HIV-1的基因表达,在AIDS的基因治疗方面展示了良好的应用前景。

Konopka等152比较了Rev-ap tamer及针对HIV-1Rev基因的核酶的抑制病毒作用,发现Rev-ap tamer能有效抑制病毒p24的产生,与核酶具有相近的效果,且核酶并不能增强aptamer的抑制作用。

人们对于这些核酸药物的输入方式也作了一些探讨,发现脂质体内不仅能保护核酸免受核酸酶的降解,也能有效地进入细胞。

进一步实验发现在RSV启动子下,这一RNA-aptamer可使病毒产生降低88%,C MV启动子自身能与HIV争夺转录因子,从而抑制病毒的复制,因而不适用于检验aptamer的抗病毒作用162。

T at蛋白是HIV反式激活蛋白。

TAR(反式激活效应元件)位于HIV基因组+1到+57~+60位。

TAR RNA在+1~ +59位间形成一个由4段茎区和1段6核苷酸环区的稳定二级结构,在第Ó及第Ô茎区之间由UCU构成一个凸出部,是T at的结合位点。

Tat与完整TAR结合,加上与其他细胞因子及上游启动子、增强子的结合来诱导HIV在细胞中的复制。

针对T at蛋白的RNA-aptamer被设计成与TAR竞争性结合tat以阻止病毒复制。

Lisziewicz172构建了一质粒,将50个串联的TAR RNA置于HIV-1LTR之下,在瞬时转染试验中,能抑制90%受tat调节的基因的表达,若将gag RNA特异性核酸引入该质粒,在人T细胞系Molt3中能抑制99%HIV-1或SIV的复制,并可维持14个月之久。

Sullenger等182则将TAR与tRNA Met嵌合在一起,通过RNA聚合酶的作用来获取大量的TAR,与Tat结合以防止HIV在细胞中的复制。

Katahira等192筛选的37mer aptamer与Tat的结合力比天然的TAR高133倍。

结构研究表明该aptamer的两个UAU三联碱基与Tat中的精氨酸侧链及谷氨酸主链间形成的氢键起着关键作用。

该aptamer与Tat以1B1的方式结合,在体内与体外试验中均具有很强的抑制病毒复制作用。

阻断Ta-t TAR相互作用的另一途径是封闭TAR的Tat结合区。

Bioizian等1102从一30自由核苷酸的DNA文库中筛选到一些TAR的ap tamer,并用核磁共振的方法测定了TAR-aptamer复合物的结构。

该ap tamer呈现并不严紧的茎-环结构,顶环有一段共同序列5c-ACTCCCAT,中间6个核苷酸与TAR的顶端区互补。

二级结构显示DNA aptamer茎结构及TAR的茎形成了半连续的螺旋。

此发现为RNA结构的非反义寡核苷酸的研究提供了良好的启示。

一些TAR的RNA aptamer能形成非典型的发夹结构,在顶端环中有共同的5c-GUCCAGA-3c序列,其中GA对于TAR-ap tamer的高亲和力至关重要。

Tuerk等122在实验中还分离到了HIV反转录酶(RT)的RNA配体,但与禽成髓细胞性白血病病毒(AMV)及莫罗尼鼠白血病病毒(MMLV)的反转录酶不能结合。

这种aptamer能同时抑制R T的RNA依赖的DNA聚合酶活性及RNase H的活性,是潜在治疗AIDS的aptamer药物。

Kensch等1112发现的HIV-1的RT RNA aptamer与RT具有极高的结合力,并且这种结合高度特异,该aptamer与HIV-2的RT结合力比HIV-1低4个数量级。

Jing等1122还分离了HIV-1整合酶的单链DNA aptamer,核心环可依次结合3个K+,并且与K+的结合能引起环的变构,从而加固与HIV整合酶的结合而发挥抗HIV-1的活性。

HCV非结构蛋白NS3为70000~72000,N端含有丝氨酸蛋白酶所特有的Asn-His-Ser催化活性中心,C端具有三磷酸酶(NTPase)及RNA解旋酶(Helicase)活性。

NS3在HC V多蛋白前体的裂解及HCV的复制中起重要作用。

Urvil等1132分离到了针对NS3蛋白酶结构域的RNA aptamer,结合常数为650nmol P L,体外能很好的抑制NS3蛋白水解活性,该aptamer的G28~U34,A47~A55残基的磷酸基团与NS3之间的静电作用对于二者的结合尤为重要。

Wang等1142分离到的NS3蛋白酶RNA aptamer有保守的GA(A P U)UGGGAC序列,与NS3的结合常数达到10nmol P L,能抑制99%的NS3蛋白酶活性。

突变研究表明,aptamer的Ñ及Ó号茎与Ó号环对维持aptamer的特异性至关重要。

而NS3的Arg130、Arg 161为二者相互作用所需要的。

Kumar等1152也分离到2个针对NS3的RNA aptamer,能同时抑制NS3的蛋白酶、解旋酶的活性,可望成为抗-HCV的药物。

Weiss等1162将Syrian金仓鼠朊蛋白rPr23-231与GST融合,用于筛选aptamer得到RNA分子,能特异结合PrP而不结合GST。

该aptamer能形成G-四边形结合于PrP的N端23~ 52位。

在有抗-PrP抗体的野鼠、仓鼠及牛的脑组织匀浆中,该ap tamer均能检测出PrP,在患羊瘙痒症鼠的脑组织匀浆中,该aptamer不能识别PrP27~30(缺少N端60个氨基酸)。

该aptamer在传染性海绵样脑病的诊断方法的发展中迈出了重要一步。

3生长因子及肿瘤蛋白相关的aptamer药物近年来,对生长因子及肿瘤蛋白的aptamer的研究方兴未艾。

肿瘤微血管为肿瘤生长提供养分,血管内皮生长因子VEGF对于肿瘤血管的形成起着重要作用,因而也被选作筛选抗肿瘤aptamer的靶点。

聚乙二醇偶联的VEGF165的RNA ap tame-r NX1838是第一个进入临床试验的aptamer。

在体外实验中,NX1838能有效阻止VEGF与人脐带血管内皮细胞HUVECs的结合,并以剂量依赖方式阻止了VEGF调节的KDR和PLC-C磷酸化、钙离子的流动及VEGF诱导的细胞增殖。

在恒河猴实验中,1mg P kg aptamer静脉注射可使血浆中ap tamer浓度达到25.5L g P mg半衰期为9.3h,清除率为6.2 ml P h1172。

安全实验表明NX1838不会引起毒副作用和抗体产生。

在人类临床试验中,每只眼1~2mg的剂量是安全有效的。

在裸鼠Wilms肿瘤实验中连续5周的NX1838治疗可使肿瘤萎缩84%1182。

Pigpen蛋白在实验性大鼠脑神经胶质瘤微血管内皮细胞高度表达。

Blank等1192以该脑瘤的内皮细胞作为靶点,筛选到了一批能结合Pigpen蛋白的单链DNA ap tamer,这种以整个细胞作为靶点为筛选ap tamer提供了更大的可能性和多样性。

血小板衍生的生长因子PDGF及其受体见于多种肿瘤中,可加速肾小球系膜细胞增生和基质积累从而造成多种进行性肾病。

在大鼠肾小球性肾炎模型中,静脉注射聚乙二醇偶联的PDGF aptamer,在第6天、第9天能分别降解64%和78%的肾小球系膜细胞有丝分裂。

对这类肾炎的长期治疗也达到了同样令人满意的效果1202。

Oncostatin M(OSM)是一多功能的IL-6家族细胞因子,作为强有力感染因子,可作为类风湿性关节炎的侯选对象。

Rhodes等1212筛选到OSM的高亲和力RNA aptamer并加以改造,用于探讨OSM在炎症反应失调中的作用,可望成为又一治疗试剂。

4作为蛋白抑制剂的aptamer
基于aptamer与蛋白质作用的高度特异性,人们试图寻找一些与疾病相关蛋白的aptamer,用于相关疾病的治疗与诊断。

中性粒细胞在急性炎症中起重要作用,其嗜苯胺蓝粒中含高水平的丝氨酸蛋白酶-弹性蛋白酶,能降解细胞间质中的许多成分,并对内皮细胞有细胞毒作用。

体内弹性蛋白酶与一些抑制因子存在动态平衡,但在成人哮喘综合征、局部消肿注射和一些慢性病中,这种平衡被打破,弹性蛋白酶的功能过量发挥。

Charlton等1222筛选到了弹性蛋白酶的单链DNA aptamer,其对弹性蛋白酶的抑制作用比以前报道的任何弹性蛋白酶的可逆抑制剂的作用都强,在阻止激活的中性粒
细胞引起弹性蛋白酶降解反应中,比蛋白酶抑制因子(PI)更为有效。

在小鼠急性肺炎模型中,该ap tamer以剂量依赖方式抑制肺部损伤和中性粒细胞侵入,效果良好。

Charlton 等1232还将此aptamer的应用推广到炎症的诊断。

该ap tamer 能结合于激活的中性白细胞表面,通过荧光流式细胞仪分析该aptamer在激活中性粒细胞表面的结合情况即可检测炎症状态。

凝血酶(Thrombin)是一种糖蛋白,体内未见有凝血酶与核酸结合的报道。

Bock等1242首次在体外分离到了具有抗凝血酶凝集活性的96mer的单链DNA aptamer。

保守的15mer 5c-GGTTGGTGTGGTTGG-3c为大多数克隆所共有。

合成的15 mer比96-mer的结合力高100倍,Kd值达到25~200nmol P L。

该15-mer aptamer被夹住两个thrombin分子的不同正电荷区域之间,靠静电及疏水力相互作用。

这两个正电荷区域,一个是血纤蛋白原识别位点,另一个是假想的肝素结合位点。

DNA分子与血纤蛋白原识别位点间存在盐桥。

水蛭素(hirudi n)能结合于凝血酶的阴离子结合区并对15mer aptamer与凝血酶的结合有竞争作用。

Yop M是41500的抗鼠疫毒力蛋白,可结合凝血酶,该15met的aptamer能与之竞争。

在体内实验中,该15mer的aptamer也显示了良好的抗凝集活性,Aptamer的注入速度与血浆凝血酶原的延迟时间具有良好的线性关系,注入10min内抑制作用达到平台期。

aptamer在体内的半衰期约为(108?14)s。

这种快速作用与短的半衰期可能在一些治疗中更为实用1252。

在人富血小板血浆(PRP)中,该aptamer对凝血酶诱导的血小板凝集的剂量依赖抑制为0.5U P L,IC50值为70~80n mol P L。

体外实验中, 0.2U P L、0.4U P L的肝素分别抑制6.5%、34.9%的凝血酶诱导的聚集,而ap tamer可达79.7%,体内效果ap tamer比肝素更好。

在心肺分流术(CPB)中,肝素常用作抗凝剂,但肝素有引起血小板减少等副作用。

在狗CPB实验中,人们用aptamer替代肝素,效果良好,静脉注射后,该aptamer主要聚集于肾脏、肝脏、血液和肌内组织1262。

Tasset等1272筛选到一个29mer的凝血酶单链DNA aptamer,能结合于凝血酶表面的肝素结合位点,比15mer的结合力高20~50倍,体外也能抑制凝血酶催化的血纤维蛋白凝集反应,该aptamer的核心序列与15mer的极为相近。

人补体C5的RNA ap tamer与C5的结合能抑制C5水解成C5a和C5b,成为有潜在治疗价值的补体抑制剂1282。

5与小分子作用的aptamer
自90年代体外筛选aptamer以来,人们已发现了很多能与小分子物质特异结合的ap tamers。

这些aptamer在诊断、治疗与新药研制中有着重要意义。

茶碱在哮喘、支气管炎和肺气肿的治疗中常用作支气管扩张药物,易引起中毒,与血清中的可可碱、咖啡因难以区分。

Jenison等1292从RNA库中分离到茶碱aptamer,其与茶碱的亲和力比与咖啡因的亲和力高10000倍以上,咖啡因与茶碱在结构上极为相似,只在N-7位多一个甲基,RNA分子与荷碱结合后,茶碱的构型有较大改变,而无论有无茶碱结合,该RNA的Tm值都达到72e,表明其有稳定的二级结构。

这一结果也显示了RNA的高度配体鉴别能力。

氨基糖类抗生素能结合核糖体23s RNA,从而阻断细菌蛋白的合成达到治疗目的。

但耐药性已成为抗生素面临的棘手问题。

Aptamer则被用于寻找药物的新靶点。

Lato等1302分离了紫青霉素(Lividomycin)的RNA aptamer。

序列分析表明,与很多生物体内有与之相近的基因组序列,有些位于某些病原微生物的关键基因内,这一发现为开发此类药物提供了有益启示。

托普霉素(Tobramycin)的RNA aptamer有一茎环结构,二者以多糖-RNA识别的方式结合。

托普霉素结合于RNA/大沟0中央的茎环结构,部分被结合的托普霉素位于/大沟0底部与环上突出的胞嘧啶残基之间,这一结果对已有药物基于空间结构重新设计以克服耐药性提供了帮助。

新霉素B以同样的方式与RNA aptamer结合。

B urke等1312分离了氯霉素(Chloramphenicol,Cam)的RNA aptamer,发现其有高度保守的5~6碱基的中央螺旋,侧翼有A丰富的/凸出0。

序列分析表明该RNA与Cam在23s rRNA上的结合位点高度相似。

多巴胺(Dopamine)是酪氨酸衍生物,是重要的神经递质。

Mannironi等1322分离了其RNA aptamer,与多巴胺结合的相对分子质量2.8@103。

多巴胺通过3c-OH和脂肪链与ap tamer的两个茎环结构结合,该ap tamer也可结合L-酪氨酸。

为了克服ap tamer易被核酸酶降解的弱点,Williams等1332在制备肽激素-抗利尿激素的单链DNA aptamer时,先筛选出了抗利尿激素对映异体的ap tamer,再合成了该aptamer的对映异构体,后者对核酸酶不敏感。

生命分子的相互作用一方面需要彼此匹配的空间结构,另一方面需要各种/力0如氢键、离子键甚至范得华力稳定已形成的结合。

当这两个条件都得以满足时,一切稳定的结合均是可能的。

核酸库的无限多样性提供了空间结构的可选择性,而核酸分子带负电的磷酸基团能与多种正电基团通过静电作用形成稳定结合,氮与羟基是形成氢键的重要元素,核酸分子中富有这两种基团,也就是说核酸库是满足生命分子相互作用的两个条件)))空间和力,这也是近年来筛选各种分子的aptamer的理论基础。

基础研究的工作重心在于探讨aptamer与其配体结合对于生命过程中各种可能的调节作用;应用研究则着重于ap tamer新药的研制,这也是最具吸引力的领域之一。

迄今筛选到的HIV、HCV、多种肿瘤及肿瘤相关因子、凝血酶、弹性蛋白酶、茶碱、氨基糖类抗生素的ap tamer已在治疗中展示了良好的应用前景,相信在此方面ap tamer将大有可为。

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(收稿日期:2001-06-06)
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