木质纤维素的酶降解工艺

木质纤维素的酶降解工艺
姓名：黄国昌学院：生命科学院学号：405604604515
1.文献综述
1.1 研究的意义
能源问题是关系国民经济发展的大事，目前大多数国家仍以石油为主。

但从世界石油储量和消费量来看，今后全世界能开采的石油约2万亿桶，估计可再用50年左右，石油的最终枯竭是在所难免的，开发其替代品是人们关心的问题。

燃料乙醇属可再生资源，用它取代部分汽油，意义重大，有关人士称之为“一次能源的革命”。

将乙醇与汽油按一定的比例混配成的乙醇汽油，不仅能减少汽油消耗，而且能有效降低汽油尾气污染，推广和使用对于解决能源危机和环境污染具有重要的意义。

乙醇不仅是助燃剂，而且是抗爆剂，添加到汽油中可提高汽油的辛烷值，并能够降低环境污染。

美国加利福尼亚的科学家经研究认为，为了提高汽油辛烷值而加入汽油中的MTBE(甲基叔丁基醚)有致癌作用，虽有争议，但加利福尼亚州还是决定2002年起禁止使用MTBE，美国环保署现也同意逐步禁止使用。

乙醇可代替MTBE加入汽油，而且乙醇的燃烧在自然界形成自身的循环，减少了能够形成臭氧的污染物的排放，没有任何污染，且缓解地球的温室效应。

目前我国乙醇生产原料主要为国库备荒陈粮。

我国人口众多，粮食并不宽裕.陈粮毕竟有限，拓宽燃料乙醇生产原料，降低生产成本是势在必行，必须尽快加快研究。

就世界范围来说，尽管有报道称美国用于乙醇生产的玉米量至少可以扩大五倍而不会破坏其市场。

但人口的增长，可耕地的减少，粮食作为原料终究不能长久。

现在各国正致力于开发天然纤维素生产燃料乙醇，这主要是基于废物利用的考虑。

天然的木质纤维素资源是地球上最丰富和廉价的可再生资源，主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素(木素)，纤维素可水解为葡萄糖，能很容易地用酵母发酵成乙醇，半纤维素可水解为戊糖和已糖，也可用来发酵生产乙醇。

我国是农业大国，植物纤维资源也十分丰富，仅农业秸杆、皮壳就达4亿多吨，林业生产所提供的采伐和加工剩余物也有1000万吨之多，然而，在这庞大的数量中，人类仅能在建筑、造纸、纺织、燃料、饲料等方面利用其中极少的一部分。

随着世界人口的激增，粮食和能源的短缺将日趋严重，从天然纤维素生产燃料乙醇是一条解决能源危机的有效途径，因此，研究植物纤维素制燃料乙醇具有深远的现实意义。

1.2 木纤维素的性质
木质纤维素的结构较复杂。

细胞壁中的半纤维素和木质素通过共价键联结成网络结构,纤维素镶嵌其中。

纤维素是由葡萄糖通过β-1 ,4 糖苷键联接而成的线性长链高分子聚合物。

纤维素大约由500 到10 000个葡萄糖单元组成。

纤维素分子中的羟基易于和分子内或相邻的纤维素分子上的含氧基团之间形成氢键,这些氢键使很多纤维素分子共同组成结晶结构,并进而组成复杂的微纤维、结晶区和无定形区等纤维素聚合物。

X-射线衍射的实验结果显示,纤维素大分子的聚集,一部分排列比较整齐、有规则,呈现清晰的X-射线衍射图,这部分称之为结晶区；另一部分的分子链排列不整齐、较松弛, 但其取向大致与纤维主轴平行,这部分称之为无定形区。

结晶结构使纤维素聚合物显示出刚性和高度水不溶性。

因此高效利用纤维
素的关键在于破坏纤维素的结晶结构,使纤维素结构松散,使得酶水解或化学水解更容易进行。

半纤维素在结构和组成上变化很大,一般由较短高度分枝的杂多糖链组成。

组成半纤维素的结构单元主要有:木糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖,半乳糖等。

各种糖所占比例随原料而变化,一般木糖占一半以上。

半纤维素排列松散,无晶体结构,故比较容易被稀酸水解成单糖。

木质素是由苯基丙烷结构单元通过碳碳键连接而成的高分子化合物。

木质素不能水解为单糖,在纤维素周围形成保护层,影响纤维素水解。

木质素中氧含量低,碳含量较高,其能量密度(27 MJ/kg) 较高,水解中留下的木质素残渣可作为燃料。

1.3 木质纤维素的水解工艺
木质纤维素原料具有较复杂的结构特点,需要将其水解成单糖,才能被微生物发酵利用生产乙醇。

针对不同木质纤维素原料特性,需要采用不同的水解工艺,一般分为酸水解工艺和酶水解工艺。

1.3.1 酸水解工艺
酸水解又分为浓酸水解和稀酸水解法。

1.3.1.1 浓酸水解工艺
浓酸水解在19世纪即已提出,它的原理是秸秆纤维素在较低的温度下可完全溶解于72%的硫酸、42%的盐酸和77%～83%的磷酸中,导致纤维素的均相水解。

浓硫酸水解为最常用方法,其主要优点是糖的回收率高,大约有90%的半纤维素和纤维素转化的糖被回收。

William A Farone 等提出的浓酸水解工艺:生物质原料干燥至含水10%左右, 并粉碎到约3～5 mm。

把该原料和70%～77%的硫酸混合,以破坏纤维素的晶体结构,最佳酸液和固体质量比为1.25∶1 ,糖的水解收率达到90%左右。

浓酸对水解反应器的腐蚀作用是一个重要问题。

近年来在浓酸水解反应器中利用加衬耐酸的高分子材料或陶瓷材料解决了浓酸对设备的腐蚀问题。

浓硫酸法糖化率高,约有80%～90%纤维素能被糖化,糖液浓度高,但采用了大量硫酸,需要回收重复利用。

一种方法是利用阴离子交换膜透析回收,硫酸回收率约80% ,浓度20%～25% ,浓缩后重复使用。

该方法操作稳定,适于大规模生产,但投资巨大,耗电量高,膜易被有机物污染。

1.3.1.2 稀酸水解工艺
主要工艺为: 木质纤维原料被粉碎到粒径2.5 cm 左右,然后用稀酸浸泡处理,将原料转入一级水解反应器,温度190 ℃,0.7 %硫酸水解3 min。

可把约20%纤维素和80%半纤维素水解。

水解糖化液经过闪蒸器后,用石灰中和处理,调pH 后得到第一级酸水解的糖化液。

将剩余的固体残渣转入二级水解反应器中,220 ℃,1.6 %硫酸处理3 min。

可将剩余纤维素中约70%转化葡萄糖,30%转化为羟基糠醛等。

经过闪蒸器后,中和,得到第二级水解糖液。

合并两部分糖化液,转入发酵罐,经发酵生产得到乙醇等产品。

在稀酸水解中添加金属离子可以提高糖化收率。

金属离子的作用主要是加快水解速度,减少水解副产物的发生。

近年来,Fe离子的助催化作用的研究令人关注。

Quang A Nguyen 等详细研究了Fe离子的催化效果。

华东理工大学等单位也对二价Fe 离子的催化效果进行了详
细研究。

总的说来,稀酸水解工艺糖的产率较低,一般为50%左右,而且水解过程中会生成对发酵有害的副产品。

1.3.2 酶水解工艺
应用酶催化可以高效水解木质纤维素,生成单糖。

酶水解工艺的优点在于:可在常温下反应,水解副产物少,糖化得率高,不产生有害发酵物质,可以和发酵过程耦合。

但是由于木质纤维素致密的复杂结构及纤维素结晶的特点,需要合适的预处理方法,使得纤维素分子成为松散结构,便于纤维素酶分子与纤维素分子的结合,然后通过纤维素酶分子的催化作用,高效地水解产生单糖。

因此木质纤维素酶水解工艺必然包含原料预处理的重要步骤。

1.3.
2.1 原料预处理
利用化学和物理方法进行预处理,使纤维素与木质素、半纤维素等分离开,同时纤维素内部氢键打开,成为无定型纤维素。

此外,还进一步打断部分糖苷键,降低聚合度,半纤维素被水解成木糖、阿拉伯糖等单糖。

经预处理后,有的纤维素的酶法降解速率甚至可以与淀粉水解相比。

1) 物理法
物理法主要是机械粉碎。

可通过切、碾和磨等工艺使生物质原料的粒度变小,增加和酶接触的表面积,更重要的是破坏纤维素的晶体结构。

2) 物理化学法
a) 蒸汽爆裂(自动水解)
蒸汽爆裂是木质纤维素原料预处理较常用的方法。

蒸汽爆裂法是用高压饱和蒸汽处理生物质原料,然后突然减压,使原料爆裂降解。

主要工艺:用水蒸汽加热原料至160～260 ℃( 0.69～4.83MPa) ,作用时间为几秒或几分钟,然后减压至大气压。

由于高温引起半纤维素降解,木质素转化,使纤维素溶解性增加。

蒸汽爆破法预处理后木质纤维素的酶法水解效率可达90%。

蒸汽爆裂法的优点是能耗低,可以间歇也可以连续操作。

主要适合硬木原料和农作物秸秆。

但蒸汽爆裂操作涉及高压装备,投资成本较高。

连续蒸汽爆裂的处理量较间歇式蒸汽爆裂法有增加,但是装置更复杂,投资成本大为增加。

b) 氨纤维爆裂
氨纤维爆裂(ammonia fiber explosion , AFEX) 法是将木质纤维素原料在高温和高压下用液氨处理,然后突然减压,造成纤维素晶体的爆裂。

典型的AFEX工艺中,处理温度在90～95 ℃,维持时间20～30 min ,每千克固体原料用1～2 kg 氨。

氨纤维爆裂装备与蒸汽爆裂装备基本相同,另外需要氨的压缩回收装置,因此投资成本也很高。

c) CO2爆裂
CO2爆裂原理与水蒸汽爆裂原理相似,在处理过程中部分CO2以碳酸形式存在,增加木质纤维素原料的水解率。

主要工艺:用4 kg CO2处理每公斤木质纤维素原料,在5.62 MPa 压力处理后减压爆裂处理,其效果比蒸汽爆裂法和氨纤维爆破法差,更缺乏经济竞争力。

3) 化学法
a) 稀酸预处理法
前面已介绍稀酸水解产率低,但其破坏纤维素的结晶结构,使原料结构疏松,从而有利于酶水解。

经过稀酸处理后可以显著提高纤维素的水解速率。

b) 碱预处理
碱处理法是利用木质素能够溶解于碱性溶液的特点,用稀氢氧化钠或氨溶液处理生物质原料,破坏其中木质素的结构,从而便于酶水解的进行。

碱处理机理在于OH-能够削弱纤维素和半纤维素之间的氢键及皂化半纤维素和木质素分子之间的酯键。

稀NaOH 处理引起木质纤维原料润胀,结果导致内部表面积增加,聚合度降低,结晶度下降,木质素和碳水化合物之间化学键断裂,木质素结构受到破坏。

碱处理木质纤维原料的效果主要取决于原料中的木质素含量。

4) 其它预处理方法
文献报道还有臭氧处理、有机溶剂处理、氧化处理等木质纤维预处理方法,但这些方法都因缺乏竞争力而很少被应用。

1.3.
2.2 酶催化水解
木质纤维素原料经过适当预处理后,可以利用纤维素酶催化水解纤维素生成葡萄糖,其优点是反应条件温和(50 ℃,pH 4.8) ,不发生副反应。

细菌、真菌及动物都可以产生可以水解木质纤维素原料的纤维素酶。

纤维素酶是一种很复杂的酶,是由几种酶共同作用下降解纤维素的。

酶降解纤维素至少需要三种酶协同作用: (1) 内切葡聚糖酶( EG, endo-1 ,4-D-葡聚糖水解酶,或EC3.2.1.4) ,攻击纤维素纤维的低结晶区,产生游离的链末端基; (2) 外切葡聚糖酶,常称纤维二糖水解酶(CBH ,1 ,4-p-D-葡聚糖纤维二糖水解酶,或EC3.2.1.91) ,通过从游离的链末端脱除纤维二糖单元来进一步降解纤维素分子; (3) 葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21) ,水解纤维二糖产生葡萄糖。

纤维二糖和葡萄糖对于纤维素酶的催化作用具有强烈的反馈抑制作用。

要提高纤维素酶水解纤维素的效率,必须解除纤维素酶的反馈抑制。

因此将纤维素酶水解与发酵产乙醇进行耦合,使得中间产物纤维二糖和葡萄糖的浓度保持很低水平,从而可以解除其反馈抑制作用。

1.4 纤维素酶的产生菌
已知的纤维素酶产生菌主要有霉菌、担子菌等真菌，也包括细菌、放线菌和一些原生动物。

目前使用的纤维素酶主要来源于绿色木霉、里氏木霉、根霉、青霉、嗜纤细菌等，其中绿色木霉、白腐菌应用最为广泛。

2. 实验部分
2.1 菌种的活化和高产菌株的筛选
菌种来自江西武藏野生物化工有限公司，先用刚果红培养基进行活化，接种后于28℃恒温培养箱中培养4-6天，再点种接刚果红平板，培养5天后，挑取水解圈较大的单菌落接种到PDA试管斜面，共30支，28℃恒温培养5～6天后，置于4℃冰箱中保存。

2.2 稻草的预处理
稻草来自南昌市郊区附近农家，当年收割。

为了脱除稻草纤维素的木质素和降低其结晶度，使纤维素酶能充分和纤维素接触，先将稻草剪成2～3CM长的小段，再采用以下预处理
方法：
2.2.1汽爆法
稻草段装入三角烧瓶中，加入2倍体积2%的稀H2SO4,于高压灭菌锅中126℃、0.15MPa 维持10min左右，迅速减至常压，水洗后烘干粉碎，过80目筛备用。

2.2.2碱预处理
其机理是破坏木聚糖半纤维素和其他组分内部分子间（比如木素和其他半纤维素之间）的酯键。

稀碱预处理对木素含量高（＞26%）的针叶木没有效果，对稻草类（木素含量10%～18%）有效。

将稻草粉浸泡在2%的NaOH溶液中过夜，用水洗至中性，干燥后备用。

2.2.3汽爆加碱预处理
将上述汽爆后的纤维素粉浸泡在2%的NaOH溶液中过夜，用水洗至中性，干燥后备用。

2.3 单因素试验
2.3.1 基础培养基：
稻草10g/L，麸皮5g/L,蛋白胨3.0 g/L , 硫酸铵2.0 g/L , 酵母膏0.5 g/L ,KH2PO44.0 g/L , CaCl2·2H2O 0.3 g/L , M gSO4·7H2O 0.3 g/L , Tween-80 0.2ml/L。

2.3.2 不同预处理方法的影响
在三角瓶中分别加入不同预处理的稻草粉，每组三个对照，121 ℃灭菌20 min ，接种量5%，上摇床，转速150r/min，30℃培养96h.
2.3.3 不同氮源的影响
按照蛋白胨：硫酸铵分别为2:2，2:3，3:2(g/L)的比例配制培养基，121 ℃灭菌20 min ，接种量5%，转速150r/min，30℃培养96h.
2.3.4 起始pH的影响
按照基本培养基的配方：配制摇瓶液体发酵培养基6瓶，其中3瓶自然pH，另外3瓶调pH 至5.0，接种量5%，转速150r/min，30℃培养96h.
2.3.5离子浓度的影响
2.3.5.1 Mg2＋的影响
调整培养基中Mg2＋浓度分别为0.03%、0.02%，其他条件不变，摇瓶培养。

2.3.5.2PO43-的影响
调整培养基中PO43-浓度分别为4.0g/L、3.0g/L, 其他条件不变，摇瓶培养。

2.3.6 表面活性剂的影响
比较加入吐温80和不加吐温80对纤维素降解的影响。

2.3.7 碳源配比的影响
调整碳源比分别为稻草粉15g、稻草粉:麸皮10:5g/L、稻草粉:麸皮:葡萄糖10:4:2g/L，其他条件根据上述结果而定，接种量5%，转速150r/min，30℃培养96h.
2.3.8 温度的影响
根据以上实验结果，按照最佳培养基组合，分别在28℃、30℃以及30℃－28℃的温度下，接种量5%，转速150r/min，培养96h.
2.4 正交试验
根据单因素试验的结果，确定正交试验因素水平，设计正交试验，根据试验结果，进行
极差分析，确立最佳培养基组合及发酵条件。

2.5总糖含量及还原糖含量的测定
2.5.1 DNS试剂的配制
称取酒石酸钾钠91 g于500ml蒸馏水中，依次加人3，5-二硝基水杨酸3.5 g，NaOH 20 g，加热搅拌，使之溶解，再加人重蒸酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5 g，搅拌使之溶解，1000ml定容，贮于棕色瓶中，l周后使用。

2.5.2 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制
称取28.40克磷酸氢二钠定容至1L，为0.2 mol/L；称取21.01克一水柠檬酸定容至1L，为0.1 mol/L。

按照磷酸氢二钠:柠檬酸＝10.3:9.7的体积比，配成pH为5.0的缓冲液。

2.5.3 葡萄糖标准曲线的制作
精确称取经105℃、3h烘干至恒重的无水葡萄糖（AR）1.0克，配成10mg/mL浓度的标准葡萄糖液。

分别吸取10mg/mL标准葡萄糖液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于50mL 容量瓶中，用蒸馏水制成每毫升分别含有葡萄糖200、400、600、800、1000、1200μg的标准液。

各取不同浓度标准液0.5mL于试管中，加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.5mL，DNS试剂3 mL于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10mL混匀，冷却后，用紫外分光光度计550nm处比色，以所得的光密度OD值为纵坐标，以对应的葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线。

空白的制作：以0.5mL蒸馏水代替0.5mL标准葡萄糖液，以下操作步骤同标准曲线制作。

2.5.4 还原糖含量的测定
发酵液离心（3000r/min）5分钟后，取上清液，沉淀物用蒸馏水反复洗涤多次，洗涤液加入上清液中，取混合液0.5ml于试管中，加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.5mL，DNS试剂3 mL 于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10mL混匀，冷却后，用紫外分光光度计在550nm 处比色，所得光密度OD值与葡萄糖标准曲线对比，计算还原糖的含量。

2.5.5 总糖含量的测定
2.5.5.1 标准葡萄糖溶液的配制：
精确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品100mg,加适量水溶解,转移至100ml容量瓶中,加水至刻度,摇匀,配成浓度为1mg/ml标准葡萄糖溶液备用。

2.5.5.2 50ml/L苯酚溶液的配制:
取苯酚100ｇ,加铝片0.1ｇ和NaHCO3 0.05ｇ,常压蒸馏,收集182℃馏分10ｇ,加蒸馏水200ml溶解,置棕色瓶内放冰箱备用。

2.5.5.3 标准曲线的制作:
取6支大试管,用移液枪分别吸取10,20,40,60,80,100μl的标准葡萄糖液(1mg/ml),各加蒸馏水至2.0ml,然后各加入苯酚试液1ml,迅速滴加浓H2SO45ml,待试管冷却后,沸水浴中加热15min,取出放入冷水中冷却至室温,于490nm波长下测定吸光度。

2.5.5.4 样品总糖含量测定：
方法同标准曲线的制作方法。

2.5.6 发酵产物中单糖组成成分的分析
2.5.6.1 标准糖样的HPLC分析
标准糖样的制备：分别配制葡萄糖、纤维二糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖溶液，浓度均为1mg/ml，各取5ml瓶装。

HPLC分析：色谱仪采用RI检测器，外标法测定。

2.5.6.2 产糖的HPLC分析
分析柱为Carbohydrate analysis,流动相为乙腈－水（85∶15），流速1.0 ml/min，示差检测。

2.6 验证扩大试验
2.6.1 培养基
50L发酵培养基：Avicel 3% ,稻草2%，麸皮1% ,蛋白胨0.3% , 硫铵0.2% , 酵母膏0.05% , KH2PO4 0.3% , CaCl2·2H2O 0.03% , MgSO4·7H2O 0.03% , Tween-80 0.02% , 消泡剂适量。

2.6.2 50L扩大培养
将培养了48小时的液体种子，按10%接种量接种至28L液体培养基中，通风量1∶0.2～1vvm , 转速250-400r/min, 通过流加2N NH4OH 自动控制发酵液pH 为4.0; 通过控制风量和转速, 保持溶氧饱和度在20%。

2.7 发酵产物的提取分离
2.7.1 过滤处理
发酵终止后，将发酵液通过过滤处理，除去菌体及残余的培养基等固形物。

2.7.2 除蛋白
将滤液用草酸调pH=7，加入3%的TCA，使蛋白质沉淀，上清液由黄绿色变为浅黄色，此时pH=4，放置过夜，使蛋白充分沉淀;离心沉淀蛋白，取上清液减压浓缩至一定体积。

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