磁性纳米铁治疗大鼠胶质瘤的实验研究

磁性纳米铁治疗大鼠胶质瘤的实验研究
(作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ )
【摘要】目的：研究局部使用磁性纳米铁热疗对大鼠胶质瘤的治疗效果。

方法：将传代培养的C6细胞立体定向接种于SD 大鼠的尾状核,14 d后肿瘤生长至直径0.5 ~ 1.0 cm时随机分成对照组和3、5、8 mg磁性纳米铁热疗组，分别立体定向注入等体积的生理盐水及3、5、8 mg的磁性纳米铁,于交变磁场中连续热疗3次,每次30 min,观察大鼠的生存时间及肿瘤体积变化。

免疫组织化学SP法检测bcl]2和bax蛋白表达。

结果：肿瘤热疗3次后3、5、8 mg磁性纳米铁热疗组大鼠的生存时间分别为(19.60 ±1.43)、(18.90 ±.75)、(20.40 ±2.26) d,明显长于对照组](13.30 ±1.69) d , P V 0.05 ],各剂量磁性纳米铁热疗组bax蛋白表达亦明显强于对照组，差异有统计学意义(均P V
0.05);各剂量磁性纳米铁热疗组间bax蛋白表达、bcL2 蛋白表达及生存时间比较差异无统计学意义(均P >0.05)。

结论:磁性纳米铁热疗能有效地促进大鼠胶质瘤细胞凋亡，抑制肿瘤增殖，延长荷瘤鼠的生存期。

磁性纳米铁热疗能促进bax蛋白的表达，对bcd2蛋白表达影响不明显。

【关键词】胶质瘤；纳米铁；热疗；凋亡
[Abstract] Objective: To explore the efficacy of magn etic nano [iron hyperthermia on rat glioma. Methods: C6 cells were injected in the SD rat caudate nu cleus by means of subculture of stereotactic ino culati on. After 14 days whe n the glioma had growed to 0.5 〜1.0 cm in diameter, the rats were divided in to four groups ran domly and the n the magn etic nano Jir on(3, 5, 8 mg ) or an equal volume of physic Jological saline were injected respectively. After finishing the magnetic nano ]iron treatment for three times in alternating magnetic field and keeping 30 min for each time, the survival time of rats and the change of tumor volume were observed and the protein expression of bcl[2 and bax were detected by the method of im muno histochemistry SP. Results: The survival time of rats in the magheticnano iron 3, 5, 8 mg groups was(19.60 ±1.43) days,(18.90
±1.75) days,(20.40 ±2.26) days, respectivety. Which were significantly higher than that of control group [ (13.30 ±1.69) days,P v 0.05 ] . The expression of bax protein in the magheticnano ]iron groups was also significantly stronger than that of control group(all P v 0.05). The expression of bax protein, bcl_2 protein and the survival time among the treatment groups had not difference(all P > 0.05). Conclusions: Magnetic
nano [iron hyperthermia can effecttively promote cell apoptosis in rat
glioma, i nhibit tumor proliferati on and prolong the survival time of tumor beari ng rat. Magn etic nano ]ir on hyperthermia can promote the expressi on of bax prote in, but the bcl ]2 expressi on of prote in is not obvious .
[Key words] glioma ; nano[iron ; hyperthermia ; apoptosis
胶质瘤(glioma)起源于神经外胚层，是中枢神经系统最常见
的恶性肿瘤(平均占44.69%) : 1 ]。

由于生长位置特殊、恶性程度高以及血脑屏障的存在，临床上胶质瘤治疗效果极差。

近来研究发现，胶质瘤对热疗敏感。

作者在建立大鼠胶质瘤脑内模型的基础上，通过立
体定位向肿瘤内注入不同剂量的磁性纳米铁进行热疗，并与对照组进行比较,探讨磁性纳米铁热疗是否可以使肿瘤缩小、延长荷瘤鼠的生存期以及磁性纳米铁热疗是否能够影响bax、bcl]2蛋白表达、促进
肿瘤细胞凋亡。

1材料与方法
1.1材料
SD健康大鼠80只,体重280〜300 g,雌雄不限，购于东南大学动物实验中心。

大鼠C6胶质瘤细胞株购于中国科学院上海生物研究
所，大鼠bax、bcl_|2蛋白单克隆抗体为美国Santa Cruz产品，交变磁场机器及磁性纳米铁颗粒(15 nm)由东南大学生物医学工程系提供。

1.2方法
1.2.1 C6胶质瘤细胞培养
细胞分装于底面积为50 cm2的培养瓶中,加入适量体积分数为2.5%胎牛血清、15%马血清的F 12K培养液,置于温度为37 C、体积分数为5%的CO2恒温恒湿培养箱中，单层培养法传代培养生长至所需的细胞数，在细胞对数生长期培养瓶大约满85%时，以0.25%胰酶消化(不含EDTA),收集消化液，离心后去除上清液，F］12k液洗2次后制成细胞悬液，调节细胞浓度为］1X107(10 好1〜1 X108 (10 心1］, 置于37 C恒温摇床待接种；苔盼蓝排斥实验检测显示细胞活力〉95%。

1.2.2胶质瘤细胞脑内原位接种
用1%的戊巴比妥钠按照］0.4 ml (100 g)-1 ］剂量行腹腔注射麻醉后，将大鼠头部固定在脑立体定向仪上，剪去头顶部毛发，碘酒、乙醇消毒后铺孔巾。

内眦连线与头部正中定位仪引导下根据Batker 法确定右尾状核靶点，于冠状缝前1 mm、中线右旁开3 mm处用圆头牙科钻钻一孔径约1.2 mm的小孔，深达硬脑膜表面但不伤及脑组织；以25 4微量注射器抽取10山单细胞悬液,沿骨孔缓慢垂直进针至硬脑膜下6 mm,再回退1 mm,以1 4 min-1的注射速度匀速缓慢注射10 “肿瘤细胞，注射完毕后留针5 min,缓慢拔针,骨蜡封闭骨孔。

生理盐水冲洗手术野，皮肤消毒后4号线缝合切口。

123胶质瘤生长观察及体积大小的评估
接种后每2 d行MRI扫描，观察肿瘤大小及生长情况，测量肿瘤的最大长径（a）和最大宽径（b）,计算肿瘤体积（V=a旳2/2）;接种14 d 后肿瘤直径为0.5 ~ 1.0 cm时随机将80只大鼠分成生理盐水对照组及3、5、8 mg磁性纳米铁热疗组4组,每组20只。

1.2.4磁性纳米铁瘤内注入
大鼠麻醉成功后将头部固定于立体定向仪上，剃毛、消毒、铺巾。

原切口切开头皮，寻找到原骨孔，以50山微量注射器分别抽取30山等体积的生理盐水及3、5、8 mg磁性纳米铁立体定向注入相应的瘤区，行MRI扫描确认注入部位准确。

1.2.5胶质瘤热疗
交变磁场选择频率40 kHz,功率80 kW,磁感应强度0〜100 kA m-1,连续热疗3 d,每日1次，持续时间为30 min。

热疗结束后第2 天每组取10只大鼠处死，取标本行光镜、免疫组织化学检测，余40只大鼠分笼饲养，观察生存时间并做好死亡记录。

1.2.6光镜检查
大鼠处死后，无菌条件下迅速取出脑组织，分别固定于10%多聚甲醛,4 C冰箱固定24 h后，脱水、石蜡包埋、切片后染色，光镜下观
察瘤区的细胞形态及密度。

1.2.7免疫组织化学染色
肿瘤组织5 g厚切片,常规脱蜡后水化，再经0.01% mol L-1 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）于微波炉内处理15 min,然后加入一抗bcl]2 和bax,4 C冰箱孵育12 h;具体染色步骤严格按SP试剂盒说明进行。

DAB显色,
细胞核作苏木素衬染。

阳性对照由南京凯基公司提供
，
阴性对照采用缓冲液代替一抗。

Bax与bcl]2结果判断：肿瘤细胞中bax 蛋白表达位于胞浆，胞浆中出现高出背景棕黄色的为阳性细胞；而肿瘤细胞中bcl]2蛋白表达位于胞膜或胞浆内，细胞膜或胞浆出现棕黄色为阳性细胞。

于400倍显微镜下计数1 000个细胞中的凋亡细胞，计算凋亡指数（apoptosis index, AI）,AI=凋亡细胞数/1 000 X100%。

1.3统计学处理
实验测定数据用x- ±s表示，多样本均数比较采用方差分析，利用SPSS统计分析软件处理各组数据，以P V 0.05为差异有统计学
意义。

2结果
2.1各组大鼠胶质瘤MRI表现
大鼠接种后13 d MRI扫描显现肿瘤直径可达到0.5〜0.8 cm,位于尾状核；立体定向注射磁性纳米铁颗粒连续热疗3次后,复查MRI显示瘤体缩小，脑水肿减轻，中线归位,磁性纳米铁位于瘤区（图1、
2)
2.2各组大鼠脑内胶质瘤生长曲线
根据测量计算得出的肿瘤体积(V=a >4)2/2),绘制生长曲线(图3)。

从图3可以看出，随瘤龄延长对照组瘤体明显增大，磁性纳米铁热疗组瘤体缩小，磁性纳米铁热疗组与对照组肿瘤体积比较差异有统计学意义(P V 0.05),各剂量磁性纳米热疗组间肿瘤体积比较差异无统计学意义(P >0.05)。

2.3各组大鼠生存时间比较
对照组随着时间的延长大鼠死亡只数迅速增加，平均生存时间为(13.30 ±1.69) d。

3、5、8 mg磁性纳米铁热疗组荷瘤鼠生存时间明显延长，平均生存时间分别为(19.60 ±1.43) d、(18.90 ±1.75) d、(20.4 ±2.26) d。

磁性纳米铁热疗组与对照组荷瘤鼠生存时间比较差异有统计学意义(P V 0.05),各剂量磁性纳米铁热疗组间荷瘤鼠生存时间比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1各组荷瘤鼠生存时间的比较(略)
光学显微镜下观察结果显示，治疗前肿瘤细胞密度高，呈浸润性活跃生长，治疗后瘤区细胞数明显减少，瘤细胞形态萎缩，肿瘤组织中可见纳米铁颗粒沉积(图4、5)。

2.5 bax、bcl]2蛋白的表达
bax蛋白表达位于细胞浆，bcl_2蛋白表达位于胞膜或胞浆中，呈片状或散在分布。

磁性纳米铁热疗可促进bax蛋白表达,加速胶质瘤细胞凋亡，胞浆呈现棕色染色（图6〜8）。

对照组与磁性纳米铁热疗组bax蛋白表达比较差异有统计学意义（P v 0.05）,磁性纳米铁热疗对bcl_2蛋白表达影响不明显（表2）。

表2各组荷瘤鼠bax、bcl_2蛋白表达（略）
3讨论
3.1磁性纳米铁热疗机制及使用现状
胶质瘤热疗是一类利用各种物理能量（如微波、射频和超声波等）在胶质瘤组织中产生热效应，使胶质瘤组织温度升高达到41〜43 C有效治疗温度，并维持一定时间（一般为30 min）,以破坏肿瘤细胞的代谢，加速肿瘤细胞凋亡而对正常脑组织无损伤的方法。

磁性纳米铁是一种在交变磁场中能够迅速升温的纳米材料] 2]。

居里温度[3-4 ] （Curie temperature, Tc）是磁场中某些物质由磁性转为非磁性的临界温度。

在温度v Tc时,这些物质显示强磁性，强烈吸收电磁波能量而升温；当温度》Tc时,它们转为非磁性物质，失去吸收电磁波能量升温的能力。

磁性纳米铁粒子就是一种具有较低Tc（4O〜45 C）的温敏材料。

当磁性纳米铁立体定向注入大鼠胶质瘤后，由于磁滞效应、
驰豫效应、畴壁共振等作用，在外磁场的照射下可以强烈吸收电磁波能量而升温至41〜43 C ,并能平稳维持30 min,促进肿瘤细胞凋亡, 抑制肿瘤的增殖，而对周围正常脑组织损害较小。

胶质瘤较其他恶性肿瘤对缺氧更敏感，同时具有低营养、低pH值、对热耐受性低等特点。

热疗可直接损伤细胞及周围血管，使肿
瘤组织中酶活性降低甚至丧失，细胞受热出现核固缩、胞浆稀疏、有丝分裂障碍、胞体溶解及细胞膜结构受损等变化，溶酶体增多、活化；热疗还可以抑制DNA和RNA的合成及聚合，因此在细胞死亡之前，细胞内难以进行大分子的合成，导致细胞难以修复。

由于纳米铁粒子较小,可以被肿瘤细胞摄取并随着细胞的分裂分布于子代细胞，这样1 次注射可以连续多次热疗，杀伤新的肿瘤细胞。

磁性纳米铁热疗还可以使肿瘤微血管外径变小，血管壁变厚，血管密度降低，血管内皮细胞紧密连接增多，细胞连接间隙减小，有的血管甚至只能观察到完整的基膜而缺乏内皮细胞[5 ]，结果抑制肿瘤组织血管形成，减少了肿瘤血供，最终抑制肿瘤细胞增殖。

磁性纳米铁热疗能够增大血脑屏障的通透性，使抗体和免疫细胞进入瘤区，同时提高免疫细胞包括NK细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞的活性，使细胞因子NF] Y、TNF[ a和IL]12的合成增加，进而加强T细胞介导的肿瘤免疫[6,,同时局部热疗可增加膜脂流动性，使镶嵌在细胞表面的肿瘤抗原暴露，有利于抗体复合物脱落，通过免疫
效应对肿瘤靶细胞发挥细胞毒作用；此外，肿瘤热疗还产生大量的应
激性蛋白一一热休克蛋白（HSP）,可刺激机体的免疫系统，提高机体的免疫功能。

Take no等］7-8 ］用免疫组织化学方法发现，肿瘤热疗后局部热休克蛋白（HSP70）表达与CD8+T细胞及CD68+巨噬细胞呈正相关,而与淋巴结转移负相关；局部热疗还可以打破免疫系统与肿瘤之间的动态平衡，发挥抗肿瘤效应。

Jordan等］9-10 ］研究发现，纳米铁颗粒在交变磁场的作用下，磁颗粒均匀地弥散开来，结果使被加热区域体积增大，使得磁流体小液滴周围的瘤细胞也可被杀死，称之为“热旁观者”效应与其他热疗比较，这是纳米铁热疗的优势所在。

磁性纳米铁热疗为什么能使机体产生大量的免疫细胞和细胞因子，同时能
活化它们,这是否与磁性纳米铁粒子作为一种特殊的异物，进入机体引起的免疫应答有关还有待进一步研究。

3.2胶质瘤热疗对细胞凋亡的影响
bcl］2是从滤泡性淋巴瘤中分离出来的一种癌基因，能延长细胞寿命，有阻止细胞凋亡的能力，在癌的发生中起到重要作用。

Kaluza等［11 ］提出在肿瘤细胞中bcL〕2强表达。

Rieger等］12］
提出bcL［2家族中,Mc山蛋白与肿瘤早期复发和患者生存期缩短有关；bax可抵消bcl_2的活性作用,促进细胞死亡。

本实验证实，磁性纳
米铁热疗对bcl 2蛋白表达无明显影响，但是可以促进bax蛋白的表达，使bcl］2/bax比值缩小,促进肿瘤细胞凋亡。

磁性纳米铁热疗胶质瘤可以局部杀死肿瘤细胞，对全身及正脑组织损害较小。

本实验研究证实3、5、8mg磁性纳米铁热疗均可以有效延长荷瘤鼠的生存时间，3种剂量热疗效果相同(P >0.05)。

Jordan 等］13］采用磁性纳米铁热疗Fisher大鼠的颅内脑胶质瘤, 发现热疗组生存率较对照组高 4.5倍；2006年,Maier］Hauff等］14］使用磁性纳米铁粒子在交变磁场下热疗成功治疗了14名恶性胶质瘤患者,治疗后患者生存时间延长，MRI检查显示肿瘤缩小，患者无明显不适。

本实验在对脑胶质瘤大鼠磁性纳米铁热疗行MRI检查,亦发现肿瘤的体积明显缩小，脑水肿改善，中线渐归位，与对照组比较差异有统计学意义(P V 0.05)。

目前,虽然纳米铁热疗胶质瘤的成果斐然，但总的来说仍处
于体外及动物实验的研究阶段。

经过修饰后的超顺磁性纳米铁颗粒(USPIO)可以通过血脑屏障，这样经静脉注射后，通过主动与被动靶向聚集于瘤区，可大大提高瘤区磁性纳米铁浓度，增强疗效，最大限度地减少对正常组织的损伤；同时，经过修饰的磁性纳米铁颗粒可以携带特异性的配体，与肿瘤细胞表面特异性的受体结合，使纳米铁颗粒精确到达瘤区并稳定牢固停留；经过修饰后纳米铁颗粒还可以携带化疗药物，对肿瘤热疗的同时进行化疗］15］。

Gr ittner等］16］证实，与抗
体结合后的磁性纳米铁粒子仍旧保持了原来的完整性与稳定性；如近来研究发现胶质瘤细胞表面含有叶酸受体］17 ］,经过修饰后的磁
性纳米铁颗粒表面可包裹叶酸配体，静脉使用后,磁性纳米铁靶向性集中于瘤区,大大提高了热疗的安全性、有效性。

磁性纳米铁颗粒热疗、化疗、放疗等综合用于治疗肿瘤将成为今后胶质瘤治疗的方向。

近来,磁性纳米铁在MRI成像、基因转载等方面的研究也有突破性进展，它将成为磁性纳米铁颗粒应用性研究的又一个热点。

需要指出的是，磁性纳米铁颗粒热疗还存在技术瓶颈，即纳米铁材料的改进、治疗区域温度精确控制与无创测温，同时磁性纳米铁颗粒在体内代谢及远期的毒副作用还缺乏详细的观察与研究。

【参考文献】
:1］王忠诚.王忠诚神经外科学］M ］.武汉：湖北科学技
术出版社，2004:518 _542 .
:2］王洪武•现代肿瘤靶向治疗技术］M ］•北京:中国医药科技出版社,2005 : 144_145 .
:3］贺莲香，张阳德,何剪太，等.铁磁流体联合交变磁场对人肝癌细胞HepG］2的影响［J］•中国现代医学杂志，2007,9 :1042【1043.
:4］原续波，康春生,颜成虎，等.立体定位注射靶向功能载
药纳米粒子治疗恶性脑胶质瘤［J］.中国生物医学工程学报,2006,25(6): 765〕766 .
:5] ABE T, TAMIYA T, ONE Y, et al. Accumulation of cell cycle regulatory prote ins, p21 and p27, in duced after hyperthermia
in human glioma cells [ J]」nt J Hyperthermia, 2001,17(6):499 ]507 .
:6] ATANACKOVIC D, NIERHAUS A, NEUMEIER M, et al. 41.8 degrees C whole body hyperthermia as an adjunct to chemotherapy in duces proIon ged T cell activati on in patie nts with various malignant diseases [J] . Cancer Immunol Immunother,
2002,51(11 ]12):603〕613 .
:7] TAKENO S, NOGUCHI T, KIKUCHI R, et al. Immunohistochemical study of leukocyte infiltration and expression of HSP70 in esophageal squamous cell carcinoma [ J] .Oncol Rep, 2001,8(3): 585 [590 .
:8] ITO A, SHINKAIM, HONDA H, et al. Heat shock protein 70 expressi on in duces an titumor immun ity duri ng in tracellular hyperthermia using magn etite nan oparticles
[J] .Cancer Immunol Immunother, 2003,52(2):80 ]88 .
[9] JORDAN A, SCHOLZ R, WUST P, et al. Endocytosis
of dextra n and sila n ecoated matite nan oparticles and the effect of intracellular hyperthemia on hnetuman mammary careinoma cells
in vitro [ J] J Mag Magetic Mater,1999,194(1):185 [189.
[10] JORDAN A, SCHOLZ R.Presentation of a new magetic filed therapy system for the treatment of human solid tumors with gnetic fluid hyperthermia [J ] . J Mag Magetic Mater,
2001,225(5):18 20.
:11] KALUZA J, ADANAK D, RZYSZROUSKI T. Expressi on of on coprote in bcl]2 and Bax protein in the in filtrati on zone and in the pare nchyma of primary glia [derived suprate ntorial neophasms [ J ] . Pol J pathol,1998,49(4):273 ]277.
:12] RIEGER L, WELLER M, BORNIMANN A, et al. Bcl J2 family protein expression in human malignant glioma: a clinical Jpathological correlative study [ J ] . J Neurol Sci,1998,155(1):68 _75.
:13] JORDAN A, SCHOLZ R, MAOER [ HAUFF K, et al.
The effect of thermotherapy using magn etic nan oparticles on rat malignant glioma [J ] . J Neuro Oncol,2006,78(1):7 ]14.
:14] MAIER[HAUFF K, ROTHE R, SCHOLZ R, et al.
In tracra nial thermotherapy using magn etic nan oparticles comb ined with external beam radio therapy:results of a feasibility study on patie nts with gliobla stoma multiforme [J] .Neurooncol,2007,81(1):53 [60.
:15]顾宁.肿瘤热疗用纳米材料与相关设备]J ].常规医疗装备,2004,3(4):39 J50.
:16] GR[TTNER C, M]LLER K, TELLER J, et al. Syn thesis and an tibody conjugat on of magn etic nan oparticles with improved specific power absorption rates for alternatingmagnetic field cancer therapy [J]」Mag Magn Mater, 2007, 311(3): 18 [22.
:17] SONVICO F, MORNET S. VASSEUR S, et al. Folate Jconjugated iron oxide nan oparticles for solid tumor target ing as pote ntial specific mag n etic hyperthermia mediators: syn thesis, physicochemical character ization, and in vitro experiments
[J] .Bioconjugate Chemistry,2005,16(5):1181 [1188 .。