第四章 植物主要组织培养技术(5学时)

光照：先弱后强
4．花药培养中单倍体形成的途径
花药的结构：花药壁(2n)、药隔(2n)、花粉粒(n)
培养初期花粉发育的途径
根据 Sunderland,、Wicks 和 Norreel 的研究，可以把早期的花粉发育分为三类：
(1)、单核—正常分裂成一个生殖核、一个营养核。以后或一个生殖核发育，或一个营 养核发育，或二者均等发育。
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文本教案(第四章)
主讲教师：柳俊博士、教授
第四章 植物主要组织培养技术（5 学时）
教学目的与要求：
掌握植物组织培养的主要技术，特别是茎尖脱毒原理，花药培养获得单倍体以及幼胚培 养技术的应用。
第一节、植物脱毒及快速繁殖技术
一、 概念与意义
意义：能够有效地保持优良品种的特性； 生产无病毒种苗，防止品种退化； 快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用； 节约耕地，提高农产品的商品率； 便于运输。
鳞皮病毒需要在 40°C/30°C 条件下处理 8 周。 啐叶病毒需要在 50°C 条件下处理 3～22 小时。 亚洲青果病毒在 50°C 条件下处理 30～40 分钟。
* 茎尖分生组织培养再生植株
茎尖分生组织培养有两个概念：shoot tip－shoot apex； apical meristem－apical dome.
3．培养基及培养条件
培养基
花药培养常用的基本培养基：MS（Murashigc & Skoog，1962）； Nitsch(Nitsch， 1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborg et al.，1976)。
附加成分：蔗糖；激素。
蔗糖浓度 诱导频率
番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应
(5)、抑制因子 1976 年，Martin-Tanguy 等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存
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在有某种抑制因子。
茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径
(1)、药物防治病毒病效率低， (2)、抗病毒育种步履艰难 (3)、组织培养的高效隔离防治了病毒的再侵染
高浓度的 2,4-D 主要诱导花药形成愈伤组织，而不能形成胚状体，从而增加了二倍体 细胞发育的机会。
培养条件－温度和光照
温度：不同植物对温度的要求不同，如： 柑橘在 20°C 以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦很少，当将温度提高到 21 ～25°C 时便会有胚状体形成，而当温度提高到 26 以上时又完全不能形成胚状体。 油菜若将接种后的花药在 30 条件下培养 2～3 天，可显著提高花粉胚的形成率，小麦 在 33°C 条件下培养 3～5 天，可提高成愈率和绿苗率。
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2．植物脱毒的技术规程
* 母体植株的选择和预处理 母体的选择：欲脱毒材料的品种典型性；外植体健康程度选择。
预处理：
A
B
C
生 长 温 度
生长区
热处理区
高 温
无损伤
脱毒区
热致死区
香石竹在 38～40°C 条件下经两个月处理可除去全部病毒。 菊花在 35～38°C 的条件下处理 60 天可使病毒失活。 马铃薯在 37°C 条件下处理 10～20 天能除去卷叶病毒。 柑橘－速衰病毒、黄化病毒需在 40°C/30°C 条件下处理 7～12 周。
(2)、传导抑制 病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中， 维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。
(3)、激素抑制 在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的 侵入或者抑制病毒的合成。
(4)、酶缺乏 1969 年，Stace-Smith 提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中 缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。
二、植物的脱毒技术
1．基本原理
病毒在植物体内的分布具有不均匀性 理论假说：
(1)、能量竞争 病毒核酸和植物细胞分裂时 DNA 合成均需要消耗大量的能量，而分生 组织细胞本身很活跃，其 DNA 合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物 提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。
目前受病毒危害严重影响生产的有：
大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草。 蔬 菜：白菜、大蒜、葱、番茄、萝卜。 果 树：柑橘、苹果、草莓、香蕉。 花 卉：香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等
块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年相当一部分产品要用留作种。如：
大 蒜：留种量占产量的五到八分之一。 马铃薯：留种量占产量的十分之一。 贝 母：留种量占产量的三分之一。
I A A— indole-3-acetic acid 2,4-D— 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2,4
高秀云等对茄子的研究表明： MS＋2,4-D0.5mgl-1＋KT 1mgl-1 n 93.8% 2n 6.2% MS＋2,4-D 2mgl-1 ＋ KT 1mgl-1 n 64,1% 2n 35.9%
二、花药培养
首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者 Guha 和 Maheshwari (1964, 1966)。目前已有 250 多种植物花药培养成功。
目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的 育种中广泛应用。
花药培养的基本程序是： 外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培 养
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* 脱毒效果检测
指示植物鉴定(test plants) 所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的 寄主植物。
血清鉴定(serologic test) 试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)。
迅速获得纯合型材料，缩短育种年限
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获得育种中间材料 与诱变育种相结合可以提高诱变频率 与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义 作为遗传工程受体更为有效 用作基础遗传研究的各个领域
Utilization of haploid cell line
tetraploid 植物其 haploid 为 dihaploid 马铃薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 24 陆地棉 2n = 4x = 52 n = 2x = 26
hexaploid 植物其 haploid 为 triploid 普通小麦 2n = 6x = 42 n = 3x = 21
胚状体诱导频率(％) 0 14 40 55
2、花药预处理
大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。
烟草、茄子 3～5°C 72 小时
水稻
10°C 10～14 天
柑橘
3°C 5～10Байду номын сангаас天
马铃薯
4°C 48 小时
低温处理的作用：
可以激发花粉母细胞产生两个相等核，二不是一个营养核一个生殖核； 保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老； 激发花粉产生原胚； 促使细胞同步分裂。
2
42
18
4
64
0
脱毒率（％）
48 42.9
0
* 外植体的生理状态
三、离体无性繁殖(propagation in vitro)
1．离体繁殖的一般技术
无菌培养物的建立 培养物的增殖: 腋芽增殖；不定芽增殖；胚状体增殖; 愈伤组织增殖 生根培养 生产用苗的培植
2．离体繁殖的使用范围
用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要需要加速繁殖的特殊基因 型，如名贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等等。
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1．外植体的选择： 供试材料的遗传背景 供试材料的生理状态 花粉的发育时期
四分体 — 小孢子 — 单核花粉 — 双核花粉 最适期
Sunderland (1971)对烟草不同花粉发育时期的培养反应进行了观察：
花粉发育时期 减数分裂期 单核早期 单核晚期 双核早期
2％
3％
4％
6％
10％
5％
10％ 12％ 18％ 25％
花药培养常用的激素有：
细胞分裂素类： BA— 6-benzyladenine KT— kinetin
13％ 45％
17％ 8％
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Zeatin 生长素类： NAA— naphthalene acetic acid
(2)、单核—均等分裂为两个子细胞，以后不断发育。
(3)、异常多核花粉粒发育 Nitsch(1970)在南洋金花中观察到 4 核花粉发育成胚状体； Nemec 在风信子中发现，有些小孢子核连续分裂 3 次，形成类似 8 核胚囊的现象，称为花粉 胚囊。
单倍体植株形成途径
通过胚状体形成单倍体植株
NAA 浓度对品种“二猪咀”花药诱导胚状体的影响
花粉培养
花药培养
2．花粉或小孢子的分离
3．培养方法 花药看护培养 花粉悬浮培养 双层培养
四、单倍体植株的鉴定与二倍化
octoploid 植物其 haploid 为 tetraploid 草莓 2n = 8x = 56 n = 4x = 28
单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点： 体细胞染色体数减半； 生长发育弱，体形小、各器官明显减小；
雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。