C2C12细胞的生长特性
C2C12成肌细胞体外诱导分化为肌管的实验
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｔｏ ｍａｔｕｒｅ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｅｓ， ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｔｈｅ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ， ｔｈｅｎ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ， ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】（ １） Ｂｏｔｈ ２０ ｍＬ ／Ｌ ａｎｄ ５０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ２０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ （ ｏｎ ｄａｙ ７， ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｔｈ ｇｒｏｕｐｓ ａｒｅ ３１．４％ ±２．１％ ａｎｄ １９．０％ ±１．６％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， Ｐ ＜ ０．０００１） ． （ ２） Ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ２０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｆｏｒ ３－ ４ ｄａｙｓ， ｍｙｏｔｕｂｅｓ ｓｔａｒｔｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ． Ｌａｔｅｒ ｏｎ， ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｍｙｏｔｕｂｅｓ ａｐｐｅａｒ， ａｎｄ ａｔ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｎ ８－ ９ ｄａｙｓ （ ｄａｙ９， ｔｈｅ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｗａｓ ４０．２％ ±１．３％ ） ． Ａｆｔｅｒ ｔｈａｔ， ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｇｏｔ ｓｅｎｉｌｅ ａｎｄ ｅｎｄ ｉｎ
关于骨骼肌肌细胞增殖及分化过程中凋亡现象
关于骨骼肌肌细胞增殖及分化过程中凋亡现象【关键词】骨骼肌关键词: 骨骼肌;细胞凋亡;细胞分化摘要:目的对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究. 方法本实验采用体外培养的C2C12肌母细胞分化模型，用流式细胞仪检测肌细胞分化过程中细胞周期的变化，提取细胞基因组DNA进行电泳分析，用原位末端标记法进行了凋亡细胞染色，电子显微镜观察凋亡小体的形成. 结果 C2C12细胞在肌分化诱导24h和48h，检测出凋亡现象;而对照组、肌分化诱导72h组均未检出凋亡现象. 结论在肌肉分化、发育的过程中，某些细胞会按自身程序主动死亡，以凋亡细胞的形式排除，而且具有明显的时间性，终末分化的肌管不易出现凋亡.Keywords:skeletal muscle;cell apoptosis;cell differentia-tionAbstract:AIM To investigate apoptosis in the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells.METHODS Murine C2C12myoblasts differential model was used in this experiment;the changes of cell cycle was tested by flow cy-tometry;genomic DNA was extracted for analysis by elec-trophoresis;in situ end-labeling（ISEL）and electron micro-scope were used to detect the apoptosis.RESULTS After C2C12cells from cultures were incubated for24or48hours in differentiation medium，apoptosis was detected;but no apoptosis was found in control group and C2C12cells from cultures incubated for72hours in differentiation me-dium.CONCLUSION During the differentiation and devel-opment of skeletal muscle，a fraction of cells might be lost through apoptosis automatically，andthis may be related to the time.Differentiated myotubes are possibly resistant to apotosis.0 引言细胞凋亡近年来已成为细胞生物学研究的新领域，它作为一种细胞生理性的死亡方式，在维护机体内环境稳定中起重要作用［1］ .凋亡现象的研究方法很多，形态上表现为细胞固缩、染色体凝集并向核膜靠拢，最终形成新月状小体;其生化学特征则是DNA在核酸电泳时呈梯级格局［2］ .凋亡概念的提出为研究胚胎发生、发展、个体形成、器官的细胞平衡增添了新的内容，指导医学实践.骨骼肌肌母细胞分化发育，首先必须退出细胞增殖周期，在多种因子的调节下，融合成具有多核的肌管结构［3］ .C2C12是小鼠骨骼肌肌母细胞，20mL L-1 胚牛血清的DMEM 培养基可诱导其分化［4］，且骨骼肌细胞分化过程中DNA的合成以及细胞周期发生明显变化［5］ .我们采用C2C12细胞模型，对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究，以阐述机体骨骼肌发生、发育中肌细胞的凋亡作用，从而为进一步研究骨骼肌损伤后再生的调控奠定基础.1 材料和方法1.1 材料 C2C12细胞（澳大利Proton教授惠赠），调整细胞密度至5×10 5 L-1 ，接种于100mL L-1 胚牛血清的DMEM（Hyclone）培养基中，在50mL L-1CO2 孵育箱培养（37℃）.培养至对数期细胞随机分为对照组和实验组，对照组为生长培养基GM（100mL L-1 胚牛血清的DMEM），实验组改变为分化培养基DM（20mL L -1 胚牛血清的DMEM），分别于24，48和72h换为分化培养基的进行实验.1.2 方法1.2.1 流式细胞仪对细胞的检测按文献［6］，分别取4组细胞试验，调整细胞数为1×10 6 mL-1 ，4℃PBS洗涤，700mL L-1 冷乙醇固定，上机前PBS洗涤细胞，加50μg mL-1 碘化丙啶，1mL L -1 Triton X-100，0.1mmol L -1 EDTA （Na）2 ，50μg mL-1 Rnase，4℃染色30min样品300目尼龙膜过滤，488nm氩激光激发，>610nm滤色片检测，对细胞进行分析.1.2.2 TUNEL法按原位细胞凋亡检测盒（德国宝灵曼）程序进行.常规细胞爬片，20μg mL-1 蛋白酶K消化30min，洗3遍，滴加TUNEL反应液，37℃，60min，振洗后加入convert-AP，37℃，60min，最后滴加底物显色液，10min终止反应，封片，光镜下分析.凋亡细胞的胞核呈现紫蓝色，未凋亡细胞的胞核不着色.1.2.3 电镜检测常规方法制作透射电镜标本，用TEM-200EX透射电镜观察.1.2.4 DNA的电泳分析细胞经2.5g L-1 胰酶消化，800min，离心5min收集细胞，48h漂浮细胞直接从培养液中离心收集.随之提取各组细胞基因组DNA做电泳分析，在50V，30mA下，用20g L-1 琼脂糖电泳2h，EB染色30min，紫外灯下观察、拍照记录.2 结果2.1 肌细胞分化过程中细胞周期 C2C12肌细胞分化培养基培养48h的细胞周期分析中，可见凋亡峰，在图中位于单倍体和二倍体峰之间（Fig1）.图1 略2.2 形态学观察和TUNEL法染色光镜下观察，C2C12肌细胞GM培养24h可见少量凋亡细胞，胞核呈紫蓝色，GM诱导48h凋亡细胞数量增多，存活细胞部分开始融合.对照组、GM诱导培养72h组均未见凋亡细胞，后者肌细胞融合形成的肌管增多，肌管内含多个胞核的分化现象（Fig2）.图2 －图3 略2.3 电镜观察 GM诱导培养24h和48h的C2C12肌细胞中，出现凋亡细胞，凋亡细胞核浆比例增大，核片段聚集成块堆聚在核膜周围（Fig3）.2.4 细胞基因组DNA的电泳分析肌细胞于分化培养基培养24h、细胞出现梯状DNA，尤以48h悬浮细胞显著（Fig4）.图4 略3 讨论迄今已发现许多因素都可诱导细胞凋亡，生化机制还不十分明确［6］ .一般认为程序化细胞死亡过程中核DNA的降解是由于一种Ca2+ ，Mg 2+ 依赖性内切酶活化引起的［7，8］ .多细胞有机体的发生、发育有赖于细胞增殖、分化和死亡的精密结合，即细胞周期的正常运行，细胞的增殖和凋亡的平衡.对肌肉细胞凋亡现象的研究将对揭示肌细胞恶变、老化、退变性肌病等的发病机制及其治疗有重要意义.FCM是检测细胞凋亡有效而灵敏的方法，为观察凋亡提供了新的手段［9］ ;凋亡细胞检测技术TUNEL法，是利用凋亡细胞生化特征的先进检测技术，具有很高的灵敏性.本实验中肌细胞分化的特定时期即肌母细胞在分化培养基培养24h和48h，TUNEL法染出了凋亡细胞，此外，DNA凝胶电泳分析出现反映核小体断裂的DNA梯状带.以上结果表明，在肌肉分化、发育的过程中，某些细胞会按自身程序主动死亡，以凋亡细胞的形式排除，这在肌肉组织重建有积极的意义.另外，凋亡的发生具有明显的时间性，分化早期（24h）检测出凋亡细胞数量较少，可能原因是此期间为特异性基因开放期，分子水平反映活跃，形态改变不太显著;分化后期（72h）不再发生凋亡，主要原因在于诱导72h后肌母细胞已经融合形成肌管，肌管是终末分化的肌细胞，不能再进入细胞分裂周期.不过，最近有的学者SV40大抗原引入肌管，终末分化的肌管重新进入细胞周期，出现减数分裂和凋亡，说明肌管仍具有凋亡发生的机制［10］ .细胞凋亡时伴有多种基因转录和蛋白质合成.c-myc是调控细胞增殖的主要基因，c-myc的表达产物是一种转录因子，与细胞增殖分化及癌变有密切关系.Evan 等［11］选用大鼠成纤维细胞Rat1/myc为实验模型研究发现，当有某些因素（低血清浓度，抑制细胞周期因子，抑癌基因）存在时c-myc基因的表达与细胞程序性死亡密切相关.本实验在诱导肌细胞分化时采用20mL L-1 血清的DMEM培养基，c-myc可能在细胞的凋亡方面起了很重要作用，c-myc的调节过程的机制仍很不清楚.总之，肌母细胞分化、发育的过程中出现凋亡现象可能为保证肌肉发育成熟所必须，为清除不再需要的肌细胞提供了一个有效机制，它的研究对于肌肉系统疾病认识将有很大帮助.参考文献［1］Miyashita T，Reed JC.bcl-2oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line ［J］.Blood，1993;8（1）:151-156.［2］Ueda N，Shah SV.Apoptosis ［J］.J Lab Clin Med，1994;124（2）:169-177.［3］Walsh K，Perlman H.Cell cycle exit upin myogenic differentia-tion ［J］.Curr Opin Genet 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flow cy-tometry ［J］.J Immunol Methods，1994;172（1）:1-16.［10］Endo T，Nadal GB.Reversal of myogenic terminal differentia-tion by SV40large T antigen results in mitosis and apoptosis ［J］.J Cell Sci，1998;111（pt8）:1081-1093.［11］Evan GI，Wyllie AH，Gilbert CS.Induction of apoptosis in fi-broblasts by c-myc protein ［J］.Cell，1992;69（1）:119-128.。
植物源无血清培养基的研究进展
科技视界SCIENCE & TECHNOLOGY VISION0 引言与传统的培养基相比，无血清培养基不含动物血清或其他生物提取物，能支持细胞在体外长时间生长和繁殖，是继天然培养基和合成培养基之后的第三类培养基。
目前商业化的无血清细胞培养基有明显的特征区别，通常可分为4种类型：无血清培养基（Serum -free medium ，SFM ）、 无动物源培养基（Animal -component -free medium ，ACFM ）、无蛋白培养基（Protein -free medium ，PFM ）、化学成分限定培养基（Chemically defined medium ，CDM ）。
无血清培养基中没有添加血清，但会添加一些额外的成分来维持细胞的生长，因此，无血清培养基通常是由基础培养基和合适比例的激素、生长因子、贴壁因子和结合蛋白等添加因子组成。
在过去的几十年里，血清已经被各种成分所取代，如重组表皮生长因子（Epidermal growthfactor ，EGF ）、胰岛素、转铁蛋白、皮质醇，最常见的是牛垂体提取物（Bovine pituitary extract ，BPE ）用于培养贴壁角质形成细胞。
在基础培养基中添加血清的主要目的是提供促细胞生长成分，作为营养物质、激素、生长因子以及蛋白酶抑制剂，同时血清能够使细胞贴壁以及平铺在细胞瓶中，提供特殊的保护机制来避免细胞的机械损伤和剪切力，还可以抑制有毒部分对细胞的冲击，提高培养基的缓冲能力[1-3]。
血清中含有可以转运脂类、脂肪酸、激素和微量元素（尤其是铁元素）的白蛋白和转铁蛋白。
但是随着欧洲许多国家爆发疯牛病（Bovine spongiform encephalopathy ，BSE ），血清的应用受到越来越多的质疑。
由于批量使用的动物血清来源于自然生物体（主要是新生牛），它本身携带和采集、加工过程有污染外源微生物和致病因子的可能，因此，使用新生牛血清存在作者简介：张凯茵，南京财经大学本科生，主要研究方向为粮油副产品生物转化技术。
棕榈酸对骨骼肌细胞脂质沉积的诱导作用
第47卷第6期2021年11月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.47No.6Nov.2021DOI：10.13481/j.1671‑587X.20210606棕榈酸对骨骼肌细胞脂质沉积的诱导作用何勇,洪莉,黄国涛,赵芷涵（武汉大学人民医院妇产科，湖北武汉430060）［摘要］目的目的：探讨棕榈酸（PA）对骨骼肌细胞脂质沉积的作用及其最佳作用浓度和时间。
方法：在C2C12细胞生长至70%~80%时分为对照组和不同浓度（50、75、100和125μmol·L－1）PA组。
不同浓度PA组细胞采用含不同浓度PA的生长培养基培养，对照组细胞不给予PA（0μmol·L－1PA）。
CCK-8法检测各组细胞增殖活性，定量检测细胞中甘油三酯（TG）水平，油红O染色观察细胞中脂滴形成情况，2%马血清诱导细胞分化并评价各组C2C12细胞分化状态。
结果结果：与对照组比较，50、75和100μmol·L－1PA组C2C12细胞增殖活性差异无统计学意义（P>0.05），125μmol·L－1PA组C2C12细胞增殖活性明显降低（P<0.01），50、75和100μmol·L－1PA组细胞中TG水平升高（P<0.01），100μmol·L－1PA组C2C12细胞中TG水平升高最明显（P<0.01）；与培养24h比较，100μmol·L－1 PA培养48h后，C2C12细胞中TG水平升高（P<0.01）。
分化培养后，PA组和对照组C2C12细胞中均有较多肌管形成。
结论结论：100μmol·L－1PA作用48h可有效促进C2C12细胞脂质沉积。
［关键词］盆底功能障碍；肥胖；高脂；棕榈酸；脂质沉积［中图分类号］R711.4［文献标志码］AEffect of palmitic acid on induction of lipid deposition inskeletal muscle cellsHE Yong,HONG Li,HUANG Guotao,ZHAO Zhihan（Department of Obstetrics and Gynecology，People’s Hospital，Wuhan University，Wuhan430060，China）ABSTRACT Objective：To explore the effect of palmitic acid（PA）on the lipid deposition in the skeletal muscle cells，and to discuss the optimum action concentration and time.Methods：The C2C12cells were divided into control group and different concentrations（50，75，100，and125μmol·L－1）of PA groups when the C2C12cells grew to70%－80%.The C2C12cells in different concentrations of PA groups were given growth media containing different concentrations of PA，while the C2C12cells in control group were not treated with PA（0μmol·L－1PA）.CCK-8method was used to detect the cell proliferation activities of cells in various groups，the triglyceride（TG）levels in the C2C12cells in various groups were detected，Oil Red O staining was used to observe the formation of lipid droplets in the C2C12cells in various groups，and2% horse serum was used to induce the cell differentiation and evaluate the differentiation of C2C12cells in various groups.Results：Compared with control group，there were no significant differences in the proliferation activities of the C2C12cells in50，75，and100μmol·L－1PA groups（P>0.05），the [文章编号]1671‑587X(2021)06‑1380‑06[收稿日期]2021‑02‑03[基金项目]国家自然科学基金面上项目（81971364，81771562）[作者简介]何勇（1994－），男，湖北省恩施州人，在读硕士研究生，主要从事女性盆底功能障碍性疾病和妇科肿瘤方面的研究。
MyHC基因在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达
MyHC基因在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达林亚秋;张明;邬杨楠;李瑞文;郑玉才【摘要】以体外培养的C2C12成肌细胞为研究对象,然后利用荧光定量PCR检测肌球蛋白重链(myosin heavy chains,MyHC)的3种亚型MyHCl、MyHC2x和MyHC2b在成肌诱导分化中(0-8 d)中的时序表达规律.结果表明,MyHC1基因在诱导分化的0-4 d表达呈上升趋势,4-8 d又呈下降趋势,在第4d和第6d的表达水平显著高于其他天数(p＜0.05).MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达呈上升趋势,但在第8d又开始下降.MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势,第6d和第8d表达水平显著高于其他天数(p＜0.05).【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(040)003【总页数】4页(P350-353)【关键词】肌球蛋白重链基因;C2C12成肌细胞;时序表达【作者】林亚秋;张明;邬杨楠;李瑞文;郑玉才【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;成都市妇女儿童中心医院生殖与不孕研究所,成都610051;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041【正文语种】中文【中图分类】Q593+.3骨骼肌是机体的重要组成部分, 肌纤维是组成骨骼肌的基本单位, 由成肌细胞分化而来, 其特性直接决定肉的品质, 是动物养殖的重要经济性状. 肌纤维特性主要包括肌纤维的类型、直径、密度及肌纤维生长发育规律等. 其中肌纤维类型的多样性以及复杂的时空分布模式是肌肉功能差异的分子基础, 不同类型的肌纤维在收缩功能、线粒体成分和代谢特性等方面有很大差异[1], 进而导致肌肉之间品质的差别[2]. 研究表明, 肌肉中红肌纤维所占的比例越大, 白肌纤维所占比例越小, 肌肉的品质就越好[3-5]. 1994年, Scohiaffin和Reggiani确定了哺乳动物中与肌纤维类型相对应的肌球蛋白重链MyHC的类型, 即肌球蛋白重链的亚型MyHCI(MyHCslow)、MyHCIIa、MyHCIIx和MyHCIIb分别对应I型、IIa型、IIx型和IIb型肌纤维[6]. 目前肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MyHC)同功型被认为是决定肌纤维快、慢类型的主要决定因素[7], 是区分肌纤维类型和研究肌肉适应性的分子标志. 因此阐明MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达规律具有重要的意义. 本实验以C2C12成肌细胞为研究对象, 利用荧光定量PCR检测MyHC1、MyHC2x和MyHC2b基因在诱导分化的0-8 d成肌细胞中的表达规律, 研究结果为阐明动物肌肉生长及肉品质形成的分子机制提供重要的基本资料.1.1 实验材料和主要试剂实验所用C2C12成肌细胞系由本实验室保存.细胞培养基DMEM/F12、马血清购自Gibco公司; 胰蛋白酶(购自sigma公司), Trizol试剂、SYBR® Premix Ex Taq TM (2×)和pMD-19T载体购自大连TaKaRa公司; 反转录试剂盒和Taq DNA聚合酶购自Fermentas公司;其他均为国产分析纯.1.2 方法1.2.1 C2C12成肌细胞的培养从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存管, 快速放于37 ℃水浴中, 轻摇1 min使其溶解, 然后加入10倍冻存液体积的培养基, 1050 rpm离心4 min, 弃上清, 将细胞接种于含10 %FBS的高糖DMEM培养基中, 在37 ℃, 5 %CO2的培养箱中静臵培养. 待细胞将长至90 %以上的时候进行传代, 在37 ℃、5 %的CO2培养箱中培养24 h, 第2天换为含2 %马血清高糖DMEM培养基诱导分化, 继续培养用于后续研究.1.2.2 细胞总RNA提取与反转录分别收集诱导0、2、4、6、8 d的C2C12成肌细胞, 吸出培养皿中的培养液. 按照Trizol试剂盒说明书提供的方法提取细胞总RNA, 紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量, 然后-80 ℃保存备用.取1 μg总RNA按照反转录试剂盒说明书以Oligo (dT) 为引物合成cDNA第一链.1.2.3 荧光定量PCR根据小鼠MyHC1、2b、2x的mRNA基因序列(登录号分别为BC158018、AJ278733、DQ021871), 应用Primer Premier5.0软件, 设计MyHC1、MyHC2x和MyHC2b基因特异引物(表1), 送交上海生物工程股份有限公司合成. 利用荧光定量PCR检测MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在不同分化时期的C2C12细胞中的表达规律. 反应体系为20 μL: SYBR® Premix Ex Taq TM(2×)PCR 10 μL , 10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL, cDNA 1μL, 灭菌水8 μL. 反应条件为95 °C预变性1 min, 95 °C 30 s, 61 ℃/58 ℃ 30 s, 45个循环, 72 °C 延伸30 s. 荧光定量结果采用2-ΔΔCt方法进行分析[8].1.3 数据分析数据采用SPSS 13.0 软件进行分析, 所得数据用平均值±标准误( mean ± SE) 表示, 采用ANOVA进行显著性检验分析, 当P<0.05 时, 认为差异显著, 当P<0.01 时, 认为差异极显著.2.1 细胞总RNA的鉴定提取的细胞总RNA样品经紫外分光光度计测定, 其OD260/OD280值均在1.8-2.0之间, 表明细胞RNA无蛋白及酚污染. 且总RNA经1 %琼脂糖凝胶电泳显示RNA有28 S, 18 S, 5 S 3条主要区带, 说明样品中的RNA基本没有降解, 可用于后续分析.2.2 MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在C2C12细胞分化过程中的表达变化荧光定量PCR结果显示: MyHC1基因在0-4 d表达呈上升趋势, 在4-8 d又呈下降趋势, 但在第4 d和第6 d的表达水平显著高于其他天数(p<0.05)(图1).MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达是呈上升趋势, 但在第8 d又开始下降(图2).MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势, 第6 d和第8 d表达水平显著高于其他天数(p<0.05)(图3).肌纤维类型及其组成是肌肉生长和肉品质形成的生物学基础, 可直接影响肌肉色泽、嫩度和肌内脂肪含量, 因此备受动物育种工作者的广泛关注. 骨骼肌根据肌纤维的形态、功能和生理生化特性分为两类, 即Ⅰ型(红肌, 慢肌)和Ⅱ型(白肌, 快肌)肌纤维. Ⅰ型含有更多的线粒体和细胞色素, Ⅱ型细胞色素和肌红蛋白含量较少. 后来学者指出MyHC的亚型可决定肌纤维的类型, 是分子水平上的主要检测指标[9]. 本实验以2 %的马血清诱导C2C12细胞分化, 分别收集诱导0-8 d的细胞, 利用荧光定量PCR检测MyHC1、MyHC2x和MyHC2b的表达规律, 结果指出这些基因在分化过程中具有一定的表达规律, MyHC1基因在分化的前期表达呈上升趋势, 在分化后期表达水平开始下降, 在第4 d表达最高(p<0.05); MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达是呈上升趋势, 但在第8 d又开始下降,在第6 d表达水平最高. MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势, 在分化后期表达水平高. 这一实验结果与肌肉本身的生长发育特性、生理变化规律是基本相符的[10,11]. 这与杨晓静等[12]的研究结果相似, 3日龄猪MyHC1和MyHC2x的表达水平显著高于20日龄及以后猪的表达水平,MyHC2b在20日龄猪的表达水平显著高于3日龄猪的表达水平. 总之肌纤维类型的组成在动物生长发育的整个时期受各种外界因素的影响会发生肌纤维类型转化的现象[13-15], 对动物肉品质的形成具有很大的影响, 因此研究肌纤维类型的转化及其调控机制将是一个十分有价值的课题.【相关文献】[1] BERCHTOLD M W, BRINKMEIER H, MUNTENER M. Calcium ion in skeletal muscle: its crucial role for muscle function, plasticity, and disease[J].Physiol Rev, 2000, 80:1215-1265.[2] PICARD B, JURIE C, DURIS M P, et al. Consequences of selection for higher growth rate on muscle fibre development in cattle[J]. Livest Sci, 2006, 102: 107-120.[3] LEFAUCHEUR L, MILAN D, ECOLAN P, et al. 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C2C12细胞的生长特性
C2C12细胞的生长特性
相差倒置显微镜下，刚传代的C2C12细胞呈球形或椭圆形，有折光性，30 min后开始贴壁，8h后贴壁完全。贴壁后的C2C12细胞呈梭形，单核，位于细胞中央。起始4.0×104了个细胞接种于直径为35 mm的细胞培养皿，3d后达80%左右汇合，4d后几乎占据培养皿所有细胞生长表面，继续培养则相邻细胞变长并相互融合，肌小管形成增多。
成肌细胞是骨骼肌的前体细胞，是一种正常情况下位于成熟肌纤维表面的肌源性细胞，具有很强的增殖和分化能力。小鼠成肌细胞系C2C12细胞由Yaffe等[[83]克隆建立，体外培养的C2C 12细胞能在低血清诱导条件下分化为多核的肌管，并表达myosin和myogenin等成熟骨骼肌的各种标志蛋白。因此，C2C12细胞通常成为体外研究成肌细胞增殖和分化的首选模型。
《C2C12细胞成肌分化过程中CaMKⅡ对MEF2C的调控作用及对分化的影响》范文
《C2C12细胞成肌分化过程中CaMKⅡ对MEF2C的调控作用及对分化的影响》篇一一、引言肌肉分化是细胞生物学中的一个重要过程，它涉及到一系列复杂的信号转导和基因表达调控。
在众多参与肌肉分化的分子中，CaMKⅡ和MEF2C的相互作用及其在C2C12细胞成肌分化过程中的调控作用尤为重要。
本文旨在探讨CaMKⅡ对MEF2C的调控机制及其对C2C12细胞成肌分化的影响。
二、CaMKⅡ与MEF2C简介1. CaMKⅡ：CaMKⅡ是一种钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶，是细胞内重要的信号转导分子。
在肌肉分化过程中，CaMKⅡ的活性与钙离子浓度的变化密切相关，其能够调节多种下游信号分子的活性，从而影响肌肉细胞的发育和分化。
2. MEF2C：MEF2C是一种肌细胞特异性转录因子，在肌肉细胞的发育和分化过程中发挥关键作用。
MEF2C的表达和活性受到多种上游信号分子的调控，其中CaMKⅡ就是其中之一。
三、CaMKⅡ对MEF2C的调控作用在C2C12细胞成肌分化的过程中，CaMKⅡ通过磷酸化作用对MEF2C进行调控。
具体而言，CaMKⅡ能够磷酸化MEF2C的特定氨基酸残基，从而改变其构象和功能。
磷酸化后的MEF2C能够与其下游靶基因的启动子结合，促进这些基因的表达，进而促进肌肉细胞的发育和分化。
四、CaMKⅡ对C2C12细胞成肌分化的影响1. 促进肌肉分化：CaMKⅡ通过调控MEF2C的活性，促进了C2C12细胞的成肌分化。
在分化过程中，CaMKⅡ的活性增加，进而磷酸化MEF2C，使其表达增加，从而促进肌肉相关基因的表达和肌肉细胞的发育。
2. 维持肌肉表型：在成熟的肌肉细胞中，CaMKⅡ仍发挥重要作用。
它能够维持肌肉细胞的表型，使其保持收缩功能和形态学特征。
这有助于维持肌肉组织的稳定性和功能。
五、结论本文研究了C2C12细胞成肌分化过程中CaMKⅡ对MEF2C 的调控作用及对分化的影响。
结果表明，CaMKⅡ通过磷酸化作用调控MEF2C的活性，进而影响肌肉细胞的发育和分化。
《C2C12细胞成肌分化过程中CaMKⅡ对MEF2C的调控作用及对分化的影响》范文
《C2C12细胞成肌分化过程中CaMKⅡ对MEF2C的调控作用及对分化的影响》篇一一、引言在细胞生物学领域，肌肉细胞的分化是一个复杂而精细的过程，涉及到多种信号通路和调控因子的相互作用。
C2C12细胞作为一种常用的成肌细胞模型，其成肌分化的研究对于理解肌肉发育和疾病治疗具有重要意义。
其中，CaMKⅡ（钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ）和MEF2C（肌细胞增强因子2C）是成肌分化过程中的关键调控因子。
本文旨在探讨C2C12细胞成肌分化过程中CaMKⅡ对MEF2C的调控作用及其对分化的影响。
二、CaMKⅡ与MEF2C概述CaMKⅡ是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在肌肉细胞的生长、发育和功能维持中发挥着重要作用。
MEF2C是一种转录因子，属于MEF2家族成员之一，参与肌肉细胞的分化过程。
在C2C12细胞的成肌分化过程中，CaMKⅡ与MEF2C之间存在着密切的相互作用和调控关系。
三、CaMKⅡ对MEF2C的调控作用在C2C12细胞成肌分化的过程中，CaMKⅡ通过多种途径对MEF2C进行调控。
首先，CaMKⅡ通过磷酸化作用激活MEF2C，提高其转录活性。
其次，CaMKⅡ与MEF2C形成复合物，共同参与下游基因的转录调控。
此外，CaMKⅡ还能通过与其他信号分子的相互作用，影响MEF2C的稳定性和定位。
这些调控作用共同促进了MEF2C在成肌分化过程中的表达和活性。
四、CaMKⅡ对成肌分化的影响CaMKⅡ对MEF2C的调控作用进一步影响了C2C12细胞的成肌分化过程。
一方面，CaMKⅡ通过激活MEF2C，促进了肌肉相关基因的表达和肌肉细胞的成熟。
另一方面，CaMKⅡ还参与了肌肉细胞的增殖和迁移过程，从而影响成肌分化的整体进程。
因此，在C2C12细胞中，CaMKⅡ的活性对成肌分化的速度和方向具有重要影响。
五、实验研究为了进一步探讨CaMKⅡ对MEF2C的调控及对成肌分化的影响，我们进行了相关实验研究。
首先，我们利用分子生物学技术检测了C2C12细胞中CaMKⅡ和MEF2C的表达水平及相互作用关系。
常见细胞种类及培养基
常见细胞种类及培养基在细胞生物学研究中，细胞培养是一个重要的实验技术，能够使细胞在人工环境中生长并繁殖。
在进行细胞培养实验时，选择适合的细胞种类和培养基非常重要。
以下是一些常见的细胞种类及其对应的适宜培养基的介绍。
1.人类胚胎肾细胞（HEK293）HEK293细胞是最常用的哺乳动物细胞系之一，广泛应用于分子生物学和生物医学研究。
这些细胞具有良好的转染效率和细胞生长能力，适用于蛋白质表达、病毒复制和分泌蛋白的研究等领域。
常见的HEK293培养基包括DMEM（Dulbecco修改的最小培养基）和Opti-MEM。
2.黑色素瘤细胞（A375）A375细胞是人类的恶性黑色素瘤细胞系，广泛用于研究黑色素瘤的发生机制、治疗方法和抗肿瘤药物的筛选。
这些细胞对细胞外基质的附着能力较强，在培养基中会形成有丝分裂的细胞凸起。
常用的A375细胞培养基包括RPMI 1640（罗斯威尔 Park Memorial Institute）和DMEM。
3.人类胚胎肺纤维母细胞（MRC-5）MRC-5细胞是一种常用的人类胚胎肺纤维母细胞系，通常用于研究呼吸系统疾病、病毒感染和疫苗培养等。
这些细胞具有良好的生长性能，易于进行转染实验和病毒感染模型的建立。
常见的MRC-5细胞培养基包括MEM（最小必需培养基）和DMEM。
4.小鼠肌肉细胞（C2C12）C2C12细胞是小鼠肌肉细胞的一个常用细胞系，广泛应用于肌肉发育和再生研究。
这些细胞可以在培养基中分化成多核肌肉纤维，并模拟肌肉形成和运动等生理过程。
常见的C2C12细胞培养基包括DMEM和FBS（胎牛血清）。
5.原代细胞原代细胞是从组织或器官中直接分离并进行培养的细胞，与细胞系相比，原代细胞具有更接近体内环境的特点，常用于药物筛选、代谢研究和组织工程等领域。
原代细胞的适宜培养基因品类繁多，如原代肝细胞可培养在Williams E培养基中，原代小鼠皮肤纤维母细胞可在MEM中进行培养。
除了上述所提到的细胞种类和培养基，还有许多其他常见的细胞种类和适宜的培养基，如人类乳腺癌细胞（MCF-7，常用的培养基为DMEM/F12）、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF，常用的培养基为DMEM）、人类肝细胞（HepG2，常用的培养基为DMEM）等。
C2C12细胞成肌诱导分化实验细节
C2C12细胞成肌诱导分化实验细节C2C12细胞的背景该细胞株是YaffeD,SaxelO建立的小鼠成肌细胞系的亚株。
该细胞分化较快，可形成能收缩的微管，产生特异的肌肉蛋白。
在骨形态形成蛋白（BMP-2）的作用下，该细胞可由成肌细胞分化为成骨细胞。
检测发现该细胞鼠痘病毒阴性。
诱导成肌实验原理成肌细胞分化的研究对理解肌肉细胞发育和修复（再生）是非常重要的。
低浓度的马血清能够有效刺激C2C12成肌细胞向成熟细胞分化。
C2c12培养条件DMEM高糖（品牌：中乔新舟货号：ZQ-100）+10%FBS（中乔新舟货号：ZQ500-A）+1%双抗（中乔新舟货号：CSP006）++1% Sodium Pyruvate 100 mM Solution（中乔新舟货号：CSP003）C2C12细胞形态成肌实验需要具备哪些条件诱导培养基：DMEM+2%马血清（注意：马血清的质量严重影响分化的分化，建议做复孔和不同马血清梯度浓度）1.传代密度：维持细胞浓度在1.5~10×105 viable cells/75 cm2；2~3天换液1次。
2.细胞代数：建议传代 C5 内开始实验3.分化诱导密度：70-80% 传代或加入分化培养基。
（注意：实验统计：细胞融合到100%，会严重影响成管细胞的形成）4.设置复孔：刚开始进行实验时，建议设立诱导4天、6天、8天、10天、12天这几个时间点观察，每天显微镜观察细胞形态，拍照存图。
一般8-9天达到高峰。
约有40%分化成熟的肌管，往后细胞逐渐衰老凋亡（注意：每天换液时需预热分化培养基，并轻柔沿壁加入，避免冲起细胞。
）5.尽可能在皿里培养，且使用明胶在进行包被，减少诱导过程中细胞漂浮的情况。
分化成功指标1.可通过吉姆萨Gimsa染色并显微镜下观察2.细胞免疫化学检测细胞肌性蛋白分子表达3.使用RT-PCR检测细胞肌性mRNA分子表达，结蛋白desmin、成肌分化抗原myod、生肌素myogenin、肌球蛋白mysin等在分化过程中表达逐渐增强图片来自丁香园。
1,25羟活性维生素D3对白细胞介素-6作用下肌原细胞增殖和分化的影响
1,25羟活性维生素D3对白细胞介素-6作用下肌原细胞增殖和分化的影响王会玲;李燕;徐凯;刘楠梅;田军;张金元【期刊名称】《上海医学》【年(卷),期】2014(37)5【摘要】目的探讨1,25羟活性维生素D3(1,25-D3)对白细胞介素-6(IL-6)刺激下肌原细胞增殖和分化的影响及其机制。
方法体外培养小鼠C2C12肌原细胞株,以2%马血清使细胞分化为肌索,给予IL-6和1,25-D3刺激细胞,观察细胞增殖情况和肌管形态。
采用Western印迹法检测维生素D3受体(VDR)、生肌分化因子D(MyoD)、肌细胞生成素(myogenin)和肌动蛋白重链(MHC)的蛋白表达量;采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测肌肉生长抑制素(myostatin)和肌萎缩Fbox-1蛋白(Atrogin-1)、MyoD和肌细胞生成素mRNA的转录水平。
结果倒置相差显微镜下见C2C12细胞呈梭形贴壁生长,增殖迅速;以2%马血清分化培养72h后,细胞可形成条索状肌管。
以20ng/mL IL-6刺激的细胞在培养48h内增殖较迅速,此后增殖缓慢;分化培养后的细胞融合形成的肌索较纤细且稀疏,直径明显缩短;以100ng/mL IL-6刺激的细胞在培养72h后有较多细胞发生脱落坏死,分化培养后的细胞形成的肌纤维极少且纤细。
与对照组比较,IL-6+1,25-D3组的VDR和1,25-D3组的VDR、MyoD、肌细胞生成素、MHC的相对表达量均显著升高(P值分别<0.01、0.05),IL-6+1,25-D3组MHC和IL-6组MyoD、肌细胞生成素、MHC的相对表达量均显著降低(P值分别<0.05、0.01)。
与1,25-D3组比较,IL-6+1,25-D3组MyoD、肌细胞生成素、MHC和IL-6组VDR、MyoD、肌细胞生成素、MHC的相对表达量均显著降低(P值分别<0.01、0.05)。
与IL-6组比较,IL-6+1,25-D3组VDR、MyoD、肌细胞生成素、MHC的相对表达量均显著升高(P 值分别<0.01、0.05)。
C2C12细胞培养注意事项
细胞名称：C2C12(小鼠成肌细胞)
细胞别称: C2c12; C2-C12; C12
细胞货号: SNL-204
生长特性:贴壁
培养条件: DMEM+10% FBS+1% P/S
培养环境:空气，95%；二氧化碳(CO2)，5%；37℃
细胞简介: C2C12细胞是由D·Yaffe和O·Saxel建立的小鼠成肌细胞株的亚克隆。
C2C12细胞分化很快，形成可伸缩的肌管并生成特征性的肌蛋白。
用骨形成蛋白2(BMP-2)处理C2C12细胞，会导致C2C12细胞的分化途径从成肌细胞转换为成骨细胞。
检测表明，C2C12细胞鼠痘病毒阴性。
C2C12细胞可以用于3D细胞培养，也是一种合适的转染宿主。
C2C12细胞培养注意事项
1细胞贴壁较弱
该细胞贴壁比较弱，消化时间偏短，注意控制消化时间。
另外，在遇到运输震荡、低温、室温静置太长时间、添加的培养基或其他试剂过冷等情况时会出现明显的细胞回缩变粗变短甚至脱落的现象，及时放回培养箱静置培养后可恢复正常。
2注意控制细胞密度
密度过高和过低都会影响细胞状态。
密度过低时，细胞生长速度减慢；长满后长时间高密度培养将导致细胞受损，可能影响后续实验。
建议细胞生长至80%密度时立即传代。
3细胞生长较快
注意每天观察细胞密度和培养基颜色，及时换液或传代。
应注意每天传代对细胞不利，通过控制接种密度将传代频率保持在2天左右传一次为宜。
4培养时背景中可能有黑点
背景中存在少量黑点，为细胞代谢产物和细胞碎片，不影响细胞生长。
若碎片较多可以通过PBS 润洗或换液清除。
c2c12细胞培养基成分
C2C12细胞是一种常用的肌肉细胞系，广泛应用于肌肉发育和再生的研究。
为了维持C2C12细胞的正常生长和分化，需要使用特定的培养基。
C2C12细胞的培养基成分通常包括以下几种：
1. DMEM/F12培养基：DMEM/F12培养基是一种基础培养基，可以提供细胞所需的营养物质和生长因子。
2. 10% FBS：胎牛血清是C2C12细胞生长所必需的营养物质之一，可以提供氨基酸、维生素、激素等物质。
3. GlutaMAX：GlutaMAX是一种谷氨酸盐添加剂，可以提高培养基中的谷氨酸浓度，促进C2C12细胞的生长和分化。
4. 青霉素和链霉素：这两种抗生素可以抑制细菌的生长，防止污染。
5. β-巯基乙醇：β-巯基乙醇可以去除培养基中的内毒素，减少对细胞的损伤。
除了以上基本成分外，还可以根据实验需要添加其他生长因子或抑制剂，如胰岛素、地塞米松、BAPTA-AM等。
这些物质可以影响C2C12细胞的分化方向和速度，从而用于研究肌肉发育和再生的机制。
需要注意的是，不同实验室可能会有略微不同的C2C12细胞培养基配方，因此在进行实验前最好先参考相关文献或咨询实验室技术人员的建议。
此外，在培养过程中还需要定期更换培养基并进行细胞计数和形态观察，以确保细胞的健康状态和实验结果的准确性。
C2C12细胞的传代培养及诱导分化实验报告
C2C12细胞的传代培养及诱导分化实验报告C2C12细胞的传代培养及诱导分化实验报告：通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，但转染原代细胞比较困难：非病毒载体、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响：新一代的脂质体技术，pH值。
脂质体法。
活化的树状聚合物。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面，从而吸附到带负电的细胞膜表面。
理论上说电穿孔法可用于各种细胞，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内，抑制降解活性。
磷酸钙共沉淀转染：需要电转仪器：中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，对原代细胞还可以，状态很不好。
每种细胞电转的条件都需要进行多次优化，不同细胞条件要自己摸索，经过包装细胞的包装得到改造后的病毒，可重复性好，且不需要另外采购特殊试剂、DNA浓度，经内吞进入细胞对原代培养的细胞，再进行感染，经过内吞被导入细胞。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
非脂质体的脂质，借助内吞作用进入细胞质，其与DNA结合形成胶束结构而非简单的双层膜结构，选择比较好的转染试剂。
活化的氨基可以调节胞内溶酶体pH值。
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子。
转染效率高，缓冲液非常有讲究，推荐QIAGEN的superfect转染试剂，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔、活体细胞。
C2C12成肌细胞体外诱导分化为肌管的实验
２ 四川大学华 西临床医 院干细胞 与组织工程研究 室 ，四川 成都 ．
摘
要 ：【 目的 】 观察低浓度 马血清体外诱 导成肌细胞 Ｃ Ｃ ２向成熟 肌细胞分 化 、 ２１ 形成肌管 的作用 ， 探索
定 向诱导 肌分化的途径及其 分子机制 。【 方法 】 Ｃ Ｃ ２ 将 ２ １ 成肌细胞用 含不 同浓度 马血清的高糖 Ｄ Ｅ Ｍ Ｍ培养基
ＸＩ Ｈｕ － Ｅ ｉｑｉ，ＤＥＮＧ Ｌｉ，ＹＡＮＧ ｉｍｉ ￣，Ｗ ＡＮＧ －ｈ Ｚｈ － ｎｇ Ｙａ ｚ ｕ
（１ Ｄ ｐｒ ｅｔ ｆ ａ ｏ ｐ ｙｉｏｙ Ｓ Ｎ Ｙ ｔ ｅ ｄ ａ Ｓ ｈｏ，Ｓ Ｎ Ｙ ｔ ｅ ｎｖｒ ｔ， ｕ ｎｚｏ １０ ９ ． ｅａｔ ｎ ｔ ｌ ｈｓ ｌ ， Ｕ ａ－ ｎＭｅｉ ｌ ｃｏｌ Ｕ ａ－ ｎＵ ｉ ｓｙ Ｇ ａ ｇｈｕ５ ０ ８ ， ｍ ｏＰ ｈ ｏ ｏｇ ｓ ｃ ｓ ｅｉ Ｃ ｉａ ．ｎｔｕｅｏ ｔｍ Ｃ ｌ ｎ ｎｉｅｒ ｇ ｕｘ ｓｉ ，Ｓｃｕ ｎＵ ｉ ｒｉ ， ｈｎ ｄ １０ １ Ｃ ｉａ） ｈｎ ；２ Ｉｓｔ ｆ ｅ ｅｌ ａｄＥ ｇｎｅｉ ，Ｈ ａ ｉ ｐｔ ｉｔ Ｓ ｓ ｎ Ｈｏ ａ ｉｈ ａ ｎｖｓ ｔ Ｃ ｅ ｇｕ６ ０ ４ ， ｈ ｌ ｅ ｙ ｎ
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２０ ０ ８年 １ 月
Ｊｎ ２ ０ ａ． ｏ ８
趋化因子cxcl12和cxcl4
趋化因子CXCL12 又称基质细胞衍生因子－1(SDF-1)是小分子的细胞因子，属于趋化因子蛋白家族。
它有两种形式，SDF-1α/CXCL12a和SDF-1β/CXCL12b。
趋化因子有四个保守的半胱氨酸残基形成两对双硫键以构成趋化因子的特殊结构。
第一第二半胱氨酸残基之间隔着一个介入氨基酸残基。
趋化因子CXCL12对淋巴细胞有强烈的趋化作用并在发育中起重要作用。
在胚胎发育中CXCL12引导造血干细胞从胎儿肝脏到骨髓的迁徙。
CXCL12基因敲除的小鼠常常死于胎中或出生后1小时内。
SDF-1α/CXCL12a还可以影响神经元的电生理。
CXCL12可以在许多组织（包括脑，胸腺，心，肺，肝，肾，骨髓，脾脏）中表达。
趋化因子CXCL12的受体是CXCR4。
但是，最近有人认为CXCL12还可以与CXCR7受体结合。
趋化因子家族成员基质细胞衍生因子1(stromal cell derivedfactor-1，SDF-1/ CXCL12)来源于骨髓基质细胞最初发现于小鼠体内，人类CXCL12基因位于10号染色体长臂。
CXC 趋化因子受体4(CXCchemokine recep tor 4，CXCR4)是CXCL12的惟一受体，而CXCL12 也是CXCR4的惟一配体。
CXCL12 与CXCR4相互作用而构成了一个与细胞间信息传递、细胞迁移有密切关的偶连分子对，由于它们是一对一的结合关系，并且有非常高的亲和力，这个偶连分子对是实现其生物学功能的基础。
CXCL12/CXCR4 的生物学功能有：①介导免疫反应。
②促进恶性肿瘤血管形成及转移。
③与HIV病毒感染有关。
④对造血干细胞的增殖、分化、归巢起重要的作用。
趋化因子CXCL12又称基质衍生因子-1 (SDF-1)是小分子的细胞因子,属于趋化因子蛋白家族。
它有两种形式,SDF-1 a/CXCL12a和SDF-1 e/CXCL12b.它们是SDF-lmRNA的2种不同的拼接变异体,二者在表达及功能上未发现差别。
达格列净促进小鼠骨骼肌细胞系C2C12分化的作用及机制的研究
论著㊃基础研究 d o i :10.3969/j.i s s n .1671-8348.2021.21.004网络首发 h t t ps ://k n s .c n k i .n e t /k c m s /d e t a i l /50.1097.r .20210918.0837.014.h t m l (2021-09-22)达格列净促进小鼠骨骼肌细胞系C 2C 12分化的作用及机制的研究*何廉旗1,任智超1,徐 丹2,张翠丽3,宋占春1ә(1.辽宁省抚顺市中心医院心血管内科 113006;2.辽宁省抚顺市中心医院科教部 113006;3.大连医科大学基础医学院,辽宁大连116044) [摘要] 目的 探讨达格列净(D A P A )在促进骨骼肌细胞分化中的作用及机制㊂方法 将小鼠成肌细胞系C 2C 12分为未分化组以及分化组(D A P A 0㊁5㊁10㊁50μm o l /L )㊂使用含2%马血清分化培养基诱导C 2C 12细胞分化,观察肌管形成情况,计算细胞分化指数,测定肌酸激酶(C K )活性㊂采用实时荧光定量聚合酶链反应检测生肌决定因子1(M y o D )㊁生肌素(M y o g e n i n )㊁肌球蛋白重链(M y H C )㊁腺苷酸活化蛋白激酶(AM P K )及p -AM P K m R N A 表达水平,W e s t e r n b l o t 检测M y o D ㊁M y o g e n i n ㊁M yH C ㊁AM P K 及p -AM P K 蛋白表达水平㊂结果 随D A P A 浓度增加,C 2C 12细胞分化指数明显增加,C K 活性也明显增加;但D A P A 50μm o l /L 组C 2C 12细胞分化指数㊁C K 活性与D A P A 10μm o l /L 组比较,差异均无统计学意义(P >0.05);C 2C 12细胞分化过程中D A P A (10μm o l /L )使M y o D ㊁M y o g e n i n ㊁M yH C 在m R N A 和蛋白水平表达均明显上调,差异均有统计学意义(P <0.05)㊂D A P A 促进C 2C 12细胞AM P K 磷酸化,而AM P K 抑制剂 C o m po u n d C 可阻断D A P A 对C 2C 12细胞的促分化作用㊂结论 D A P A 可通过激活C 2C 12细胞AM P K 活性,促进细胞分化㊂[关键词] 达格列净;骨骼肌细胞;分化;代谢综合征[中图法分类号] Q 291[文献标识码] A[文章编号] 1671-8348(2021)21-3617-05S t u d y o n e f f e c t a n d m e c h a n i s m o f d a p a g l i f l o z i n i n p r o m i t n g di f f e r e n t i a t i o n o f m o u s e s k e l e t a l m u s c l e c e l l l i n e C 2C 12*H E L i a n qi 1,R E N Z h i c h a o 1,X U D a n 2,Z HA N G C u i l i 3,S O N G Z h a n c h u n 1ә(1.D e p a r t m e n t o f C a r d i o v a s c u l a r M e d i c i n e ,F u s h u n M u n i c i p a l C e n t r a l H o s p i t a l ,F u s h u n ,L i a o n i n g 113006,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f S c i e n c e a n d E d u c a t i o n ,F u s h u n M u n i c i pa l C e n t r a l H o s p i t a l ,F u s h u n ,L i a o n i n g 113006,C h i n a ;3.B a s i c M e d i c a l S c h o o l ,D a l i a n M e d i c a l U n i v e r s i t y ,D a l i a n ,L i a o n i n g 116044,C h i n a ) [A b s t r a c t ] O b je c t i v e T o e x p l o r e t h e r o l e a n d m e c h a n i s m of d a p ag l i f l o z i n (D A P A )i n p r o m o t i n g th e di f f e r e n t i a t i o n o f s k e l e t a l m u s c l e c e l l s .M e t h o d s T h e m o u s e m yo b l a s t c e l l l i n e C 2C 12w a s d i v i d e d i n t o 5g r o u p s :u n d i f f e r e n t i a t e d g r o u p a n d d i f f e r e n t i a t e d g r o u ps (D A P A 0,5,10,50μm o l /L ).T h e d i f f e r e n t i a t i o n m e -d i u m c o n t a i n i n g 2%h o r s e s e r u m w a s u s e d t o i n d u c e t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f C 2C 12c e l l s .T h e f o r m a t i o n o f m yo -t u b e s w a s o b s e r v e d ,t h e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n d e x w a s c a l c u l a t e d ,a n d t h e C K a c t i v i t y wa s m e a s u r e d .T h e r e a l -t i m e f l u o r e s c e n t q u a n t i t a t i v e P C R w a s u s e d t o d e t e c t m y o g e n i c d e t e r m i n a t i o n f a c t o r 1(M y o D ),m y o ge n i n ,m y o s i n h e a v y c h a i n (M y H C ),a n d a d e n y l a t e -a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e (AM P K )a n d p -AM P K m R N A e x pr e s -s i o n l e v e l s ;t h e W e s t e r n b l o t w a s u s e d t o d e t e c t t h e p r o t e i n e x p r e s s i o n l e v e l s o f M y o D ,M y o g e n i n ,M yH C ,AM P K a n d p -AM P K.R e s u l t s W i t h t h e i n c r e a s e o f D A P A c o n c e n t r a t i o n ,t h e C 2C 12c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n d e xa n d C K a c t i v i t y w e r e i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ;h o w e v e r ,c o m p a r e d w i t h t h e D A P A 10μm o l /L g r o u p,t h e d i f f e r -e n c e i n t h e C 2C 12c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n d e x a n d C K a c t i v i t y o f t h e D A P A 50μm o l /L g r o u p h a d n o s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05);D A P A (10μm o l /L )s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d t h e e x p r e s s i o n o f M y o D ,M y o ge -n i n a n d M y H C a t t h e m R N A l e v e l a n d p r o t e i n l e v e l d u r i n g th e d i f f e r e n t i a t i o n o f C 2C 12c e l l s ,a n d t h e d i f f e r -e n c e w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t (P <0.05).D A P A p r o m o t e d t h e p h o s p h o r yl a t i o n o f AM P K i n C 2C 12c e l l s ,w h i l e t h e AM P K i n h i b i t o r C o m p o u n d C c o u l d b l o c k t h e d i f f e r e n t i a t i o n -p r o m o t i n g ef f e c t o f D A P A o n C 2C 127163重庆医学2021年11月第50卷第21期*基金项目:辽宁省自然科学基金博士启动基金项目(2020-B S -284)㊂ 作者简介:何廉旗(1984-),主治医师,博士,主要从事代谢性心血管病的研究㊂ ә 通信作者,E -m a i l :s z c c l s z c c l @163.c o m ㊂Copyright©博看网 . All Rights Reserved.c e l l s.C o n c l u s i o n D A P A c a n p r o m o t e t h e c e l ld i f fe r e n t i a t i o n b y a c t i v a t i n g t h e AM P K a c t i v i t y of C2C12c e l l s.[K e y w o r d s]d a p a g l i f l o z i n;s k e l e t a l m u s c l e c e l l s;d i f f e r e n t i a t i o n;m e t a b o l i c s y n d r o m e糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病㊂而骨骼肌占人体重量的40%,是人体最大的代谢器官,因此,骨骼肌功能完整对维持机体代谢稳态至关重要[1]㊂骨骼肌的肌纤维表面的卫星细胞是一种干细胞,当骨骼肌受到损伤(包括运动导致的牵拉伤㊁物理创伤㊁化学损伤等)时,静止的卫星细胞被激活,进行增殖㊁分化㊁融合,最终生长为成熟肌纤维,完成对受损骨骼肌的修复[2]㊂有研究表明,糖尿病患者骨骼肌卫星细胞分化能力明显降低,导致骨骼肌再生能力下降[3-4]㊂新型口服降糖药 达格列净(d a p a g l i f l o z i n, D A P A)通过抑制钠-葡萄糖共转运蛋白2活性,促进尿糖排泄,降低血糖水平[5]㊂有研究表明,D A P A对腺苷酸活化蛋白激酶(a d e n y l a t e-a c t i v a t e d p r o t e i n k i-n a s e,AM P K)具有激活作用[6-7]㊂而AM P K是骨骼肌细胞分化的重要的调控因子,可通过激活一系列下游分子促进骨骼肌细胞分化[8-9]㊂尽管如此,D A P A 在骨骼肌细胞分化中的作用尚少见相关文献报道㊂本研究采用小鼠成肌细胞系C2C12细胞作为研究对象,拟明确D A P A在C2C12细胞分化中的作用,并初步阐明其分子机制㊂1材料与方法1.1材料小鼠成肌细胞系C2C12细胞购自美国A T C C公司,D A P A购自美国M C E公司,胎牛血清及马血清均购自美国G i b c o公司,AM P K抑制剂C o m p o u n d C (C C)㊁小鼠抗生肌素(m y o g e n i n)抗体(a b1835)及小鼠抗肌球蛋白重链(m y o s i n h e a v y c h a i n,M y H C)抗体(a b51263)均购自美国A b c a m公司,肌酸激酶(c r e a-t i n e k i n a s e,C K)活性测定试剂盒及小鼠抗β-t u b u l i n (S A B4200732)抗体均购自美国S i g m a公司,小鼠抗生肌决定因子1(m y o g e n i c d e t e r m i n a t i o n f a c t o r1, M y o D)抗体(s c_32758)购自美国S a n t a C r u z公司,兔抗AM P Kα抗体(2532s)及兔抗p-AM P K抗体(2537s)均购自美国C S T公司㊂1.2方法1.2.1细胞培养将C2C12细胞接种于100mm培养皿中,使用含10%胎牛血清杜氏改良E a g l e培养基(D u l b e c c o's m o d i f i e d E a g l e m e d i u m,D M E M)培养基(生长培养基),于37ħ㊁含5%C O2培养箱中进行培养,待细胞密度达到80%~90%融合时按1ʒ3进行细胞传代㊂传代细胞仍按上述培养条件继续培养,以备后续实验使用㊂1.2.2细胞分化体系的建立及形态学观察在生长培养基中待C2C12细胞融合至80%左右时将培养基更换为含2%马血清的D M E M培养基(分化培养基)继续培养,每隔1d换液1次,诱导分化7 d,使用相差显微镜观察分化后肌管形态并采集图像,计算细胞分化指数(融合2个或2个以上细胞核的细胞的百分比)㊂药物干预即在基础培养基基础上加入不同浓度D A P A(终浓度为0㊁5㊁10㊁50μm o l/L)及C C(终浓度为10μm o l/L)㊂1.2.3 C K活性测定使用细胞刮分别从培养皿刮下1.2.2项各组细胞㊂采用适量冰缓冲液(50mm o l/L磷酸钾)对细胞进行匀浆处理,4ħ㊁10000g离心15m i n,留取沉淀待测㊂按照C K测定试剂盒说明书于96孔板中单孔加入10μL标本及100μL反应试剂体系(缓冲液100μL,底物溶液10μL,酶混合物1μL),轻敲,混匀㊂37ħ孵育20m i n,340n m波长检测吸光度(A340)i n i t i a l㊂37ħ继续孵育20m i n,340n m波长检测吸光度(A340)f i n a l㊂按照公式计算C K活性:C K活性(u n i s t/L)=(A340)f i n a l-(A340)i n i t i a l(A340)-(A340)㊂1.2.4 W e s t e r n b l o t检测蛋白表达水平收集1.2.2项各组细胞,加入蛋白裂解液于冰上放置30m i n,4ħ㊁10000g离心10m i n,上清液为细胞总蛋白㊂采用蛋白定量(B C A)法测定蛋白浓度㊂50μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺电泳㊂湿转法转膜后于5%脱脂牛奶中封闭1h㊂加入一抗(稀释比均为1ʒ1000),4ħ封闭过夜㊂次日,二抗(稀释比均为1ʒ5000)孵育45m i n后进行电化学发光(E C L)显色㊂采用I m a g e J1.51软件对W e s t e r nb l o t带进行灰度分析㊂1.2.5实时荧光定量聚合酶链反应(p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n,P C R)收集1.2.2项各组细胞,使用北京普洛麦格公司R N A提取试剂盒提取细胞总R N A,并测定其浓度及纯度㊂使用日本T A K A R A公司逆转录试剂盒获取细胞c D N A㊂从N C B I网站下载小鼠M y o D㊁M y o g e-n i n㊁M y H C及G A P D H基因D N A及m R N A序列㊂采用p r i m e r3.0软件设计引物,M y o D-正向:C A A-G A C C A C C A A C G C T G A T C,M y o D-反向:C A G A C-C T T C G A T G T A G C G G A;M y o g e n i n-正向:A T C T G-C A C T C C C T T A C G T C C,M y o g e n i n-反向:G A C A G C-C C C A C T T A A A A G C C;M y H C-正向:A G C T T-G A A A A C G A G G T G G A A,M y H C-反向:C C T C C T-C A G C C T G T C T C T T G;G A P D H-正向:A G T-G T T T C C T C G T C C C G T A G,G A P D H-反向:G C C G T-8163重庆医学2021年11月第50卷第21期Copyright©博看网 . All Rights Reserved.G A G T G G A G T C A T A C T ㊂采用实时荧光定量法测定上述基因循环数(c yc l e t h r e s h o ld ,C t )值,反应条件:95ħ30s ,95ħ5s ,60ħ31s ,共40个循环㊂通过2-ΔΔC T 计算m R N A 相对表达水平㊂1.3 统计学处理采用S P S S 20.0统计软件进行数据分析,计量资料采用x ʃs 表示,组间比较采用独立样本t 检验㊂以P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 D A P A 促进C 2C 12细胞分化D A P A 以浓度依赖方式促进C 2C 12细胞分化,同时,细胞C K 活性增加,见图1㊂D A P A 50μm o l /L 组C 2C 12细胞分化指数㊁C K 活性与D A P A 10μm o l /L 组比较,差异均无统计学意义(P >0.05),故选用D A P A 浓度为10μm o l /L 进行后续实验㊂2.2 D A P A 在m R N A 水平及蛋白水平上调C 2C 12细胞M y o D ㊁M y o g e n i n ㊁M yH C 的表达D A P A 上调C 2C 12细胞M y o D ㊁M y o g e n i n ㊁M y -H C 的表达,差异均有统计学意义(P <0.05),见图2㊂2.3 D A P A 通过上调AM P K 磷酸化水平促进C 2C 12细胞分化㊂与D A P A 组细胞分化程度比较,D A P A+C C 组分化明显减低,差异有统计学意义(P <0.01),见图3A ㊁B ㊂与对照组比较,D A P A 组AM P K 磷酸化水平明显增加,差异有统计学意义(P <0.05);D A P A+C C 组AM P K 磷酸化水平及M yH C 表达水平均明显低于D A P A 组,差异均有统计学意义(P <0.05),见图3C ㊁D㊂A :相差显微镜观察细胞形态(比例尺=20μm );B :分化指数柱状图;C :C K 活性测定;a:P <0.05,与D A P A 0μm o l /L 组比较㊂图1 D A P A 促进C 2C 12细胞分化A :实时荧光定量P C R 分析m R N A 表达水平,以G A P D H 为内参;B :W e s t e r n b l o t 分析蛋白表达水平;C :灰度分析柱状图;对照组:未给予D A P A 分化7d 的C 2C 12细胞㊂图2 D A P A 使C 2C 12细胞M y o D ㊁肌管细胞㊁M yH C 表达水平上调9163重庆医学2021年11月第50卷第21期Copyright©博看网 . All Rights Reserved.A:相差显微镜观察细胞形态(比例尺=20μm);B:分化指数柱状图;C:W e s t e r n b l o t分析蛋白表达水平;D:灰度分析柱状图;对照组:未给予D A P A分化7d的C2C12细胞㊂图3 D A P A通过增加AM P K磷酸化水平促进C2C12细胞分化3讨论随着生活方式的改变,肥胖及其相关代谢综合征的发生日趋普遍㊂骨骼肌是全身最大的代谢器官,对维持机体代谢稳态发挥着重要作用㊂骨骼肌再生是保护骨骼肌结构及功能完整的关键㊂骨骼肌再生分为4个阶段,包括卫星细胞增殖㊁分化㊁融合及生长㊂有研究表明,肥胖导致骨骼肌细胞分化障碍[10]㊂而在诸多调控卫星细胞分化的转录因子及信号分子中生肌调控因子(包括生肌因子5㊁M y o D㊁M y o g e n i n和生肌调节因子4)最为重要[11]㊂首先,生肌因子5在卫星细胞分化初始阶段表达持续增加,随之激活其他生肌调控因子㊂随着M y o D高表达,卫星细胞正式进入分化阶段㊂M y o D㊁M y o g e n i n相互交叉激活,与启动子或增强子区域的E-b o x元件结合,诱导一系列生肌相关基因的表达㊂有研究发现,下调M y o D或M y o-g e n i n会直接抑制骨骼肌细胞分化[12]㊂因此,M y o D㊁M y o g e n i n在调节骨骼肌细胞分化中至关重要㊂新型口服降糖药D A P A因具有独立于降糖作用以外的诸多优势备受关注㊂有研究表明,D A P A具有明显抗炎作用,对诸多脏器具有保护作用,如心脏㊁肝脏㊁肾脏及脑[13-16]㊂本研究采用D A P A作用于C2C12细胞,诱导分化,通过相差显微镜观察发现,D A P A可促进C2C12细胞分化㊂同时,D A P A使C2C12细胞中生肌调控因子M y o D㊁M y o g e n i n及卫星细胞分化标志物M y H C表达增加,肌管特异性标志物C K活性增加㊂有研究表明,肥胖抑制AM P K磷酸化,导致骨骼肌再生障碍[17]㊂而AM P K磷酸化是骨骼肌细胞分化的重要调控因子[18-19]㊂有研究表明,D A P A在许多组织中可促进AM P K磷酸化[7,20-21]㊂本研究结果显示, D A P A作用于C2C12细胞后AM P K磷酸化明显增加㊂而在加入C C干预后通过相差显微镜观察发现, D A P A促进C2C12细胞分化的作用消失,M y H C表达明显减低,说明D A P A通过增加AM P K磷酸化促进C2C12细胞分化㊂综上所述,D A P A在小鼠成肌细胞系C2C12细胞中促进AM P K磷酸化,进而促进C2C12细胞分化㊂尽管如此,但D A P A在小鼠骨骼肌再生中的作用仍需进一步探究㊂本研究证实了D A P A在骨骼肌损伤后再生中可能存在潜在的价值,为临床肌病的治疗提供了新的思路㊂参考文献[1]M I K O L A S E V I C I,P A V I C T,K A N I Z A J T F,e t a l.N o n a l c o h o l i cf a t t y l i v e r d i s e a s e a n d s a r-c o p e n i a:w h e r ed o we s t a n d?[J].C a n J G a s t r o-e n t e r o l H e p a t o l,2020,2020:8859719.[2]B A G H D A D I M B,T A J B A K H S H S.R e g u l a t i o na n d p h y l o g e n y o f s k e l e t a l m u s c l e r e g e n e r a t i o n[J].D e v B i o l,2018,433(2):200-209. [3]F U J I M A K I S,K UW A B A R A T.D i a b e t e s-i n d u c e d0263重庆医学2021年11月第50卷第21期Copyright©博看网 . All Rights Reserved.d y s f u n c t i o n o f m i t o c h o n d r i a a n d s te m c e l l s i ns k e l e t a l m u s c l e a n d t h e n e r v o u s s y s t e m[J].I n t J M o l S c i,2017,18(10):2147.[4]N G U Y E N M H,C H E N G M,K OH T J.I m-p a i r e d m u s c l e r e g e n e r a t i o n i n o b/o b a n d d b/d bm i c e[J].S c i W o r l d J,2011,11:1525-1535.[5]L U O M,K O N G X,WA N G H,e t a l.E f f e c t o fD a p a g l i f l o z i n o n g l y c e m i c v a r i a b i l i t y i n p a t i e n t sw i t h t y p e2d i a b e t e s u n d e r i n s u l i n g l a r g i n ec o m b i n ed w i t h o t he r o r a l h y p o g l y c e m i c d r u g s[J].J D i a b e t e s R e s,2020,2020:6666403.[6]C H A N G Y K,C HO I H,J E O N G J Y,e t a l.D a p a g l i f l o z i n,S G L T2i n h i b i t o r,a t t e n u a t e s r e n a l i s c h e m i a-r e p e r f u s i o n i n j u r y[J].P L o S O n e,2016,11(7):e0158810.[7]Z HO U J,Z HU J,Y U S J,e t a l.S o d i u m-g l u c o s ec o-t r a n s p o r t e r-2(S G L T-2)i n h i b i t i o n r ed u ce s g l u c o s e u p t a k e t o i n d u c e b r e a s t c a n c e r c e l l g r o w t h a r r e s t t h r o u g h AM P K/m T O R p a t h w a y[J].B i o m e d P h a r m a c o t h e r,2020,132:110821.[8]S A K U S H I M A K,Y O S H I K A W A M,O S A K I T,e ta l.M o d e r a t e h y p o x i a p r o m o t e s s k e l e t a l m u s c l e c e l l g r o w t h a n d h y p e r t r o p h y i n C2C12c e l l s[J].B i o c h e m B i o p h y s R e sC o mm u n,2020,525(4): 921-927.[9]MA J,M E N G X,K A N G S Y,e t a l.R e g u l a t o r ye f f e c t s o f t h e f r u i t e x t r a c t o f L y c i u m c h i n e n s e a n d i t s a c t i v e c o m p o u n d,b e t a i n e,o n m u s c l e d i f-f e r e n t i a t i o n a n d m i t o c h o n d r i a l b i o g e n e s i s i n C2C12c e l l s[J].B i o m e d P h a r m a c o t h e r,2019, 118:109297.[10]G H A N I M H,D H I N D S A S,B A T R A M,e t a l.E f f e c t o f t e s t o s t e r o n e o nFG F2,MR F4a n d m y-o s t a t i n i n h y p o g o n a d o t r o p i c h y p o g o n a d i s m:r e l-e v a n c e t o m u s c l e g r o w t h[J].J C l i n E n d o c r i n o lM e t a b,2019,104(6):2094-2102. 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C2C12 小鼠成肌细胞贴壁培养
C2C12小鼠成肌细胞贴壁培养
细胞名称：C2C12；小鼠成肌细胞
形态特性：成纤维细胞样
生长特性：贴壁生长
培养条件：DMEM(H)；10%FBS；
传代方法：1:2-1:3传代；
传代情况：C5
冻存条件：基础培养基+8%DMSO+20%FBS
特征特性：该细胞株是Yaffe D,Saxel O建立的小鼠成肌细胞系的亚株。
该细胞分化较快，可形成能收缩的微管，产生特异的肌肉蛋白。
在骨形态形成蛋白（BMP-2）的作用下，该细胞可由成肌细胞分化为成骨细胞。
检测发现该细胞鼠痘病毒阴性。
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。
3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。
C2C12成肌细胞诱导肌性分化过程中miR-101a的表达
C2C12成肌细胞诱导肌性分化过程中miR-101a的表达李粉;王丽;郑艳艳;陈华群【摘要】以C2C12成肌细胞为模型,在分化培养基中诱导C2C12建立体外肌性细胞分化模型.以poly (A)3′-端加尾和实时定量PCR方法研究miR-101a在C2C12细胞分化过程中的表达情况.结果发现,在细胞转入分化培养基进行肌性分化的1-5 d中,miR-101a的表达量逐渐增加,提示miR-101a可能在肌肉发生中发挥调控作用.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)001【总页数】4页(P116-119)【关键词】C2C12C成肌细胞;实时定量PCR;miR-101a;肌分化【作者】李粉;王丽;郑艳艳;陈华群【作者单位】南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学生物技术重点实验室,南京210046;南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学生物技术重点实验室,南京210046;南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学生物技术重点实验室,南京210046;南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学生物技术重点实验室,南京210046【正文语种】中文在个体发育中，肌肉组织的发育主要表现为肌细胞数量的增加和肌细胞体积的膨胀两个方面，这两方面的完成依赖于细胞的增殖和分化［1］。
小鼠C2C12成肌细胞在体外可以模拟肌肉发生过程。
在营养因子丰富的培养基中，C2C12保持增殖状态；当培养基中营养因子缺乏时，则退出细胞周期、停止增殖，分化为肌管细胞并融合为肌纤维［2］。
肌肉发育过程中许多调节因子包括转录因子、细胞信号分子如生肌调节因子、锌指蛋白、Wnt家族成员等在肌细胞的增殖、分化中发挥重要作用［3］。
microRNA （miRNA）是一类大小为22 nt的小分子非编码RNA, 通过其5'端种子序列（seed sequence）与靶基因mRNA 3'端非翻译区（3'-untranslated region, 3'UTR）的互补配对而抑制蛋白质的翻译或促进mRNA的降解，在转录后水平调节蛋白质的表达［4］。
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成肌细胞是骨骼肌的前体细胞，是一种正常情况下位于成熟肌纤维表面的肌源性细胞，具有很强的增殖和分化能力。
小鼠成肌细胞系C2C12细胞由Yaffe等[[83]克隆建立，体外培养的C2C 12细胞能在低血清诱导条件下分化为多核的肌管，并表达myosin和myogenin等成熟骨骼肌的各种标志蛋白。
因此，C2C12细胞通常成为体外研究成肌细胞增殖和分化的首选模型。
C2C12细胞的生长特性
相差倒置显微镜下，刚传代的C2C12细胞呈球形或椭圆形，有折光性，30 min后开始贴壁，8h后贴壁完全。
贴壁后的C2C12细胞呈梭形，单核，位于细胞中央。
起始4.0×104了个细胞接种于直径为35 mm的细胞培养皿，3d后达80%左右汇合，4d后几乎占据培养皿所有细胞生长表面，继续培养则相邻细胞变长并相互融合，肌小管形成增多。
（80%）
待细胞在完全生长培养液(DMEM/10% FBS/S/P)生长至80%左右汇合时，换成分化培养液(DMEM/2% HSISJP)后，大量细胞开始融合成肌管，分化培养3d后，肌管大量形成，之后肌管进一步增长增粗。