细胞生长曲线

一细胞生长曲线：

A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。

B、背景知识

细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。

原理（选填项目）：

细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

C、材料

（一）仪器

1. 净化工作台

2. 离心机

3. 恒温水浴箱

4. 冰箱（4℃、-20℃）

5. 倒置相差显微镜

6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）

（二）玻璃器皿

1. 吸管（弯头）

2. 培养瓶

3. 玻璃瓶（250ml、100ml）

4. 废液缸

（三）塑料器皿

1. 吸头

2. 枪头

3. 24培养板

4. 胶塞

（四）其他物品

1. 微量加样枪

2. 红血球计数板

（五）试剂

1. D-Hanks液

2. 小牛血清

3. RPMI1640

4. 双抗（青霉素、链霉素）

5. 0.08%胰酶

（四）、操作步骤

1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；

2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。

3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养3～5d常要给未计数的细胞换液。

4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。

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（五）、注意事项

1．细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。

2．现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。

3．标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。

4．在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。

二、四唑盐试验（MTT）比色试验

（一）、目的

学习四唑盐比色试验，检测细胞存活和生长情况。

（二）、原理和背景。

四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。

（三）、材料

A、仪器

1. 净化工作台

2. 离心机

3. 恒温水浴箱

4. 冰箱（4℃）

5. 倒置相差显微镜

6. CO2培养箱

7. 振荡混合仪

8. 酶联免疫检测仪

9. 移液枪

10. 电磁力搅拌机

11. 微孔滤器

B、玻璃器皿

1. 吸管

2. 小烧杯（100ml）

3. 废液缸

C、塑料器皿

1. 吸头

2. 枪头

3. 96孔培养板

4. 15ml离心管

5. 50ml离心管

6. 胶塞

D、其他物品

1. 微量加样枪

2. 红血球计数板

F、试剂

1. D-Hanks液

2. 小牛血清

3. RPMI1640

4. 双抗（青霉素、链霉素）

5. 0.08%胰酶

6. 二甲基亚砜（DMSO）

7. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。

（四）、操作步骤

1. 接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。

2. 培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。（培养时间取决于实验目的和要求）

3. 呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，37℃孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心（1000rpm，5min），然后弃去孔内培养液。每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。

4. 比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。

（五）、注意事项

1．选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。

2．避免血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。

3．设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。

四唑蓝(MTT)法测定细胞生长曲线及生长速度：MTT法绘制3组细胞的生长曲线，分别将细胞用无血清培养液配制成单细胞悬液,计数后接种于96孔板(1×104)/孔，设立空白组培养7 d,每天每组细胞各取6孔,每孔加入MTT溶液0.5 g/L,37℃继续培养4 h,弃去培养上清液,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl,振荡使结晶物充分溶解,选择492 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔波长吸光度(A)值的差值,以时间为横轴, A值为纵轴绘制生长曲线。