C2C12细胞的生长特性

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lncRNAGPRC5D-AS1对地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞肌萎缩及铁死亡相关蛋白的影响演示稿

03
地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞肌萎缩模型
地塞米松能够抑制小鼠C2C12细胞的增殖，导致细胞数量减少。
抑制细胞增殖
诱导细胞凋亡
改变细胞形态
地塞米松可以诱导C2C12细胞发生凋亡，导致细胞死亡。
地塞米松处理后的C2C12细胞形态变小，呈现出肌萎缩的特征。
03
02
01
肌萎缩时，肌肉组织中的蛋白质合成减少，导致肌肉质量下降。
lncRNA GPRC5D-AS1对铁死亡相关蛋白的影响：研究进一步发现，lncRNA GPRC5D-AS1能够调控铁死亡相关蛋白的表达。在地塞米松诱导的肌萎缩过程中，lncRNA GPRC5D-AS1可能通过调节铁死亡相关蛋白的表达，影响细胞的生存状态。
lncRNA GPRC5D-AS1的作用机制：研究揭示了lncRNA GPRC5D-AS1可能通过与某些关键基因的相互作用，影响其表达，进而影响肌萎缩和铁死亡相关蛋白的表达。这为理解肌萎缩和铁死亡的分子机制提供了新的视角。
详细描述
VS
lncRNAGPRC5D-AS1可能通过改变细胞形态，影响地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞肌萎缩过程。
详细描述
在肌萎缩过程中，lncRNAGPRC5D-AS1可能通过调控细胞骨架蛋白、细胞膜蛋白等，改变细胞形态，使其呈现肌萎缩的特征性变化，如细胞体积减小、细胞核变小等。
总结词
05
lncRNAGPRC5D-AS1对地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞铁死亡相关蛋白的影响
铁死亡相关蛋白是一类在细胞铁死亡过程中发挥重要作用的蛋白质，它们参与了细胞内氧化应激反应、脂质代谢和细胞凋亡等过程。
这些蛋白通过调节细胞内铁离子的平衡、活性氧簇的产生以及脂质过氧化的程度等，影响细胞的生存和死亡。

C2C12成肌细胞体外诱导分化为肌管的实验

Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】ＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔｏｆＣ２Ｃ１２ｍｙｏｂｌａｓｔｓｉｎｔｏｍａｔｕｒｅｍｙｏｃｙｔｅｓａｎｄｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｍｙｏｔｕｂｅｓ，ｅｘｐｌｏｒｉｎｇａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｍｍｉｔｔｅｄｍｙｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】ＴｈｅＣ２Ｃ１２ｍｙｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＤＭＥＭｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍ，ｔｈｅｎｈａｒｖｅｓｔｅｄａｎｄｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｐｈａｓｅｃｏｎｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｆｏｒｔｈｅａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒａｐｐｅａｒａｎｃｅ，ａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｆｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｏｆｍｕｓｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｓｂｙｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＲＴ－ＰＣＲａｓｓａｙｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】（１）Ｂｏｔｈ２０ｍＬ／Ｌａｎｄ５０ｍＬ／ＬｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｃａｐａｂｌｅｏｆｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｍｙｏｔｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＣ２Ｃ１２ｍｙｏｂｌａｓｔｓ，ｏｆｗｈｉｃｈｔｈｅ２０ｍＬ／Ｌｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｒｉｎｄｕｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔ（ｏｎｄａｙ７，ｔｈｅｒａｔｉｏｓｏｆｍｙｏｔｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｂｏｔｈｇｒｏｕｐｓａｒｅ３１．４％ ±２．１％ａｎｄ１９．０％ ±１．６％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，Ｐ＜０．０００１）．（２）Ｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈ２０ｍＬ／Ｌｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍｆｏｒ３－４ｄａｙｓ，ｍｙｏｔｕｂｅｓｓｔａｒｔｅｄｔｏｆｏｒｍ．Ｌａｔｅｒｏｎ，ｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅｍｙｏｔｕｂｅｓａｐｐｅａｒ，ａｎｄａｔｔｈｅｐｅａｋｏｎ８－９ｄａｙｓ（ｄａｙ９，ｔｈｅｍｙｏｔｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｉｏｗａｓ４０．２％ ±１．３％）．Ａｆｔｅｒｔｈａｔ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｇｒａｄｕａｌｌｙｇｏｔｓｅｎｉｌｅａｎｄｅｎｄｉｎ

KLF4过表达对RAW264.7巨噬细胞和C2C12肌原细胞增殖的影响

Ｃ２２ｌＣ１Ｃｅｌｓ
ＬＵＭｅ — ｏｇＩｎＩｕ — ｅ，ＷＡＮＧＫａｇｋｉＩｉｎ，ＬＵＹｉｇ，ＬＵＪｎｗｆｄｔｎ — ａ，ＸＩａ —ｈｎＡＯＸｉｎｚｏｇ
（ｅａｔｅｔｆＰｔｏｈｓｌｙＸａｇａＭｅｉｌｏｌｅＣｎｒｌｏｔｎｖｒｔ，ｈｎｓａ４０７，ｎｎｈｎ）Ｄｐｒｎｏａｈｐｙｉｏ，ｉｙｄａｌｇ，ｅｔｕｈＵｉｓｙＣａｇｈ１０８Ｈｕａ，ＣｉａｍｏｇｎｃＣｅａＳｅｉ
维普资讯
第１１卷第３期
２００７年９月
生命科学研究
ＬｆｉｎｃｓａｃｉｅＳｃｅｅＲｅｅｒｈ
Ｖ１ｌＮｏ３ｏ．１．
Ｓｐ．２ｅ００７
ＫＬ４过表达对ＲＦＡＷ２４７巨噬细胞和ＣＣｌ肌原６．２２细胞增殖的影响
Ａｂｔａｔ：ｏｉｖｓｇｔｔｅｅｅｔｆｖｒｘｒｓｉｎｏｒｐｅｌｅｆｃｏ（Ｌ４ｏｅｐｏｆｒｔｎｓｒｃＴｅｔａｅｈｆｃｏｅ— ｐｅｓｆｔｐｌｉｔ４ＫＦ）ｎｔｒｌｅａｉｎｉｆｏｅｏＫｉ —ｋａｒｈｉｏ
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壳聚糖水凝胶的研制及其与C2C12细胞粘附、支持作用的实验研究

ＤｅｅｏｍｅｔｏｉｏａｄｏｅｎｖｌｐｎｆＣｈｔｓｎＨｙｒｇｌａｄｔｅＥｆｅｔｏｈｆｃｆＣ２Ｃ１ｈｓｏｎｕｏｔ２ＡｄｅｉｎａｄＳｐｐｒ
ＸＵｎＤＵＡＢｉＩＮＣｕｍｉ，Ｏｏｇ，ｈａｇｏＷＡｉＨＡＴｎＬＵＳｕｎｈｎ，ｇＮＧａｇｏＣｈｎｙｎｇ
ｄｔｒｎｄｕｄｒｄｆｒｎｅｅａｕｅａｄｔｅｐａｔｉｏｉｄｔｅｔｆｓｌｉｃｔｎａ７ｅｅｍｉｅｎｅｉｅｔｔｅｍｐｒｔｒｌｉｖｓｓｔａｉｏｏｉｆａｉｔ３ ℃ ｏｅｃｉｓｙｒｇｌｗｒｓｎｈｓｃｃｙｎｈｍｅｄｉｏｆｔｈｔａｈｄｏｅｅａｏｈｏｎｅｌ
结构，通过ＣＣ２２１细胞在其表面上的粘附与生长情况，判定该材料是否具有良好的细胞相容性。结果表明：
该材料具有温度敏感性，室温下为液态，７即３ ℃变为固态。当壳聚糖溶液浓度为２％时，加入４％ｊ５３一甘油磷
酸钠溶液后的成胶作用时间最短，约为１ｉ。ＣＣ２细胞在壳聚糖水凝胶材料上的粘附与生长情况良好。５Байду номын сангаас ｎ２１
，
（．ｅａｍｎｏｉｕｎｉｅｎｅａｈ，ｓｔｅｏａｉＭｅｉｌｃｎｅＡａｅｙｏＭｉｔｙＭｅｉｉｅ，ｅｎ０８０Ｃｉ１ＤｐｒｅｔｆＴｓＥｇｎｒｇＲｓｒＩｔｕｔｓｅｅｉｅｃｎｉｔｆＢｓｄａｉｃ，ｃｄｍｃｃＳｅｆｌｒｄａＳｅｓＢｌｇ１０５，ｈａ；ｉａｃｃｎｌｃｉｔｎ２ＩｔｕＧｒｔｃＣｄｌｙｏＣｉｓＬｎｒｌｏｉｌＢｉｎ０８３．ｎｉｔｏｅｉｒａｉｏｈｎｅ４ＧｅａＨｓｔ，ｅｉ１０５）ｓｔｅｆａｉｒｏｇｆｅＰｅｐａｊｇ

cxcl12分子量

cxcl12分子量全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：CXCL12分子量是多少?CXCL12是指半胱氨酸-半胱氨酸间隙接头蛋白趋化因子12，也被称为糖皮质激素亲和素，其分子量约为8.3kDa。

CXCL12是一种重要的趋化因子，对造血干细胞、淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞具有极强的趋化作用，能够引导这些细胞定向迁移。

CXCL12通过结合其受体CXCR4，在免疫细胞的趋化活动中发挥着重要作用。

CXCL12在机体中具有多种重要的生理功能。

他是造血干细胞开发及迁移的重要刺激因子，可以引导干细胞在骨髓中的定向迁移，维持机体的正常造血功能。

CXCL12在淋巴器官和外周淋巴细胞聚集中也发挥着重要作用，可以调节免疫细胞的迁移和聚集，促进机体对外界病原微生物的免疫应答。

CXCL12还在神经系统的发育和修复中发挥作用，能够引导神经前体细胞在中枢神经系统中的迁移和定位。

CXCL12通过结合其受体CXCR4在细胞膜表面发挥生物学功能。

当CXCL12与CXCR4结合时，可以激活细胞内信号转导通路，导致细胞的趋化、增殖、存活和分化等生物学活性。

CXCL12还通过结合另一种受体CCR7，在淋巴细胞的迁移和定位中发挥作用，参与机体的免疫应答。

CXCL12的生物学功能十分多样，对于维持机体的正常功能具有不可或缺的作用。

因其在疾病中的作用，CXCL12及其受体已成为药物研发的热点。

利用CXCL12/CXCR4信号通路的特异性干扰剂或激动剂，可以用于白血病、淋巴瘤、艾滋病、肿瘤等疾病的治疗。

CXCL12及其受体还被作为肿瘤的标志物，用于肿瘤的早期诊断和治疗监测。

虽然CXCL12的分子量较小，但其在机体中的生理功能十分重要，对于疾病的治疗和预防具有重要意义。

CXCL12是一种重要的趋化因子，在免疫细胞的趋化、白血细胞的迁移、神经细胞的发育等生理过程中发挥着重要作用。

通过结合其受体CXCR4及CCR7，能够调控细胞的生物学行为，对于机体的正常功能维持和疾病的治疗具有重要意义。

同源异型框蛋白Msx1的两个新的磷酸化位点的鉴定

同源异型框蛋白Msx1的两个新的磷酸化位点的鉴定程庆灵;王敬强【摘要】Some phosphorylated sites in the homolog Msx2 of the homeoprotein Msx1 has been identified,which plays a crucial biological role. However,the phosphorylated sites in Msx1 are not known yet,thus in order to examine the Msx1 phosphorylated status, we applied bioinformatics analysis to predict phosphorylation sites in Msx1,further used immunoprecipitation and mass spectrometry to experimentally verify the phosphorylation sites in Msx1. Tryptic digests of Msx1 protein complexes purified from C2C12 cells were separated and analyzed by nLC-MS-MS. Two novel phosphorylation sites(Ser152 and Ser160)were identified,moreover,these two sites were highly conserved in mouse and human. Furthermore,the specifically-phosphorylated antibody was prepared targeting these two phosphorylation sites.%同源异型框蛋白Msx1的同系物Msx2中已鉴定出磷酸化修饰位点，并且发挥着重要的生物学功能。

基于C2C12_细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第4期2023年8月V ol.18,No.4Aug.2023㊀㊀基金项目:国家自然科学基金面上项目(21976201);国家自然科学基金重点项目(21836004);国家重点研发计划项目(2018YFA0901100)㊀㊀第一作者:郝迪(1998 ),女,硕士研究生,研究方向为分子环境毒理学,E -mail:********************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:**************.cnDOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230411001郝迪,谢群慧,杨广磊,等.基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应[J].生态毒理学报,2023,18(4):293-303Hao D,Xie Q H,Yang G L,et al.Toxicity of 2,7-dibromo -9H -carbazole on myogenesis based on C2C12cells [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(4):293-303(in Chinese)基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应郝迪1,2,3,谢群慧1,*,杨广磊1,陈旸升1,李云平4,夏英杰5,徐丽1,赵斌1,2,3,41.中国科学院生态环境研究中心,环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京1000852.中国科学院大学中丹学院,北京1001903.中国科学院大学,北京1000494.国科大杭州高等研究院环境学院,杭州3100245.香港科技大学生命科学学院,香港999077收稿日期:2023-04-11㊀㊀录用日期:2023-05-22摘要:肌肉有执行机体运动和能量代谢的重要作用㊂据报道二噁英暴露可严重影响肌肉发育㊂但目前与多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzofurans,PCDFs)结构相似的卤代咔唑(polyhalogenated carbazoles,PHCZs)的肌肉发育毒性尚不明确㊂本研究旨在探究2,7-二溴咔唑(2,7-dibromo -9H -carbazole,27-BCZ)的肌肉发育毒性效应㊂应用C2C12细胞成肌分化模型,在细胞水平上通过苏木素-伊红染色法检测融合指数和单条肌管内细胞核数2个指标评价细胞形态的变化,在分子水平上通过qRT -PCR 来测定肌细胞分化调节分子和分化标志物的基因表达,探究27-BCZ 对肌发育的影响及其分子机制㊂细胞水平实验结果显示,与对照组相比,27-BCZ 10-7mol ㊃L -1暴露3d 后,肌管数量减少㊁形态变细变短,且分布杂乱;单条肌管内细胞核数减少㊁参与肌管融合的细胞核比例(融合指数)降低;27-BCZ 10-9~10-7mol ㊃L -1暴露6d 后,虽然单条肌管内细胞核数没有显著变化,但融合指数显著降低㊂分子水平实验结果显示,27-BCZ 10-7mol ㊃L -1在分化末期对肌纤维结构蛋白肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的2个编码基因Myh3和Myh4的表达具有显著抑制作用㊂另外,27-BCZ 还影响肌生成调节因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)基因的表达,包括显著抑制分化早期调节因子MyoD 和末期调节因子Mrf4的mRNA 表达,显著促进Myogenin mRNA 表达㊂此外,27-BCZ 暴露能显著促进芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)信号通路下游基因cyp1a1和cyp1b1的mRNA 表达,提示27-BCZ 在肌分化模型中具有类二噁英活性㊂总结上述结果,我们发现,在肌生成过程中,27-BCZ 表现出与二噁英类似的AhR 活性和肌发育干扰效应,为27-BCZ 肌肉发育相关健康效应和AhR 相关毒理机制研究提供了基础数据㊂关键词:2,7-二溴咔唑;C2C12小鼠成肌细胞;肌肉发育毒性;肌生成调节因子家族文章编号:1673-5897(2023)4-293-11㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AToxicity of 2,7-dibromo-9H-carbazole on Myogenesis Based on C2C12CellsHao Di 1,2,3,Xie Qunhui 1,*,Yang Guanglei 1,Chen Yangsheng 1,Li Yunping 4,Xia Yingjie 5,Xu Li 1,Zhao Bin 1,2,3,41.State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology,Research Center for Eco -Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085,China2.Sino -Danish College,University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China294㊀生态毒理学报第18卷4.College of Environment,Hangzhou Institute for Advanced Study,Hangzhou310024,China5.Division of Life Science,The Hong Kong University of Science and Technology,Hong Kong999077,ChinaReceived11April2023㊀㊀accepted22May2023Abstract:Muscles play an important role in executing body movements and energy metabolism.It has been repor-ted that exposure to dioxins can affect muscle development seriously.However,the muscle developmental toxicity of polyhalogenated carbazoles(PHCZs),which are structurally similar to polychlorinated dibenzofurans,is currently unclear.This study aimed to investigate the muscular developmental toxicity of2,7-dibromo-9H-carbazole(27-BCZ).We applied the C2C12cell myogenic differentiation model and evaluated the changes in cell morphology by using hematoxylin eosin staining.Fusion index and the number of nuclei in a single muscle tube was used as main parameters for monitoring the myotube formation.At the molecular level,we used qRT-PCR to determine the gene expression of muscle cell differentiation regulatory molecules and differentiation markers,and explore the effects and molecular mechanisms of27-BCZ on muscle development.The results at cell level showed that after3days of exposure to27-BCZ at10-7mol㊃L-1,the myotubes formed were fewer,thinner,shorter and less organized than those of control group.The number of nuclei in the myotube and the fusion index were decreased.After6days of exposure to27-BCZ at10-9~10-7mol㊃L-1,although there was no significant change in the number of nuclei in the myotubes,the fusion index was significantly decreased.Moreover,27-BCZ at10-7mol㊃L-1significantly inhibi-ted the expression of Myh3and Myh4,two encoding genes of myosin heavy chain(MyHC),at the end stage of differentiation.Furthermore,27-BCZ disturbed the expression of myogenic regulatory factors(MRFs),which play important roles in regulating the process of muscle differentiation.We found significantly down-regulation of the mRNA expression of the early differentiation MRF MyoD and the late differentiation MRF Mrf4,while promoting the expression of Myogenin.In addition,we found that27-BCZ treatment can significantly induce the expression of cyp1a1and cyp1b1,two classical downstream genes of aryl hydrocarbon receptor(AhR).These results indicate that27-BCZ may have dioxin-like AhR activity during muscle differentiation.In summary,we found that27-BCZ exhibited AhR activity and myogenesis interference effects similar to dioxins in C2C12cells,providing fundamen-tal data for further studies of27-BCZ on muscle development-related health effects and AhR-related toxicological mechanisms.Keywords:2,7-dibromo-9H-carbazole;C2C12cells;muscular developmental toxicity;myogenic regulatory factors (MRFs)㊀㊀污染物的毒性表现在许多方面㊂近年来,越来越多的研究发现,肌肉是污染物运动神经系统毒性的重要靶点[1]㊂了解污染物影响肌发生过程的毒理机制在评估污染物的潜在毒理风险和人类避免污染物伤害方面有重要意义㊂由于二噁英暴露可造成唇腭裂畸形,其肌肉发育毒性逐渐受到关注[2-3]㊂细胞学实验发现,10-10mol㊃L-1的2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)处理可通过干扰融合过程和抑制肌管结构蛋白表达来抑制C2C12细胞的肌管形成[4]㊂但对具有一定类二噁英毒性的卤代咔唑(polyhalogenated carbazoles, PHCZs)的肌发育毒性研究还十分有限㊂2,7-二溴咔唑(2,7-dibromo-9H-carbazole,27-BCZ)是近年来检出频次较高一种卤代咔唑(polyhalogenated carbazoles, PHCZs)[5-6],其在土壤中的半衰期为120d,在环境中具有累积性[7]㊂目前,27-BCZ的部分毒理学效应已被阐明,包括胚胎发育毒性[8]㊁心脏毒性[9]㊁内分泌干扰毒性[10]等㊂有研究采用野生型斑马鱼胚胎探究了多种PHCZs的急性毒性,发现其中只有27-BCZ 表现出强毒性,可能会对胚胎早期发育构成重大风险[11],因此,27-BCZ的环境健康风险值得关注㊂另有研究发现,27-BCZ具有心脏致畸效应,转录组学分析发现暴露于27-BCZ的斑马鱼有90个基因表达改变,且许多通路与芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)的激活有关[11]㊂Fang等[9]发现在0.03 mmol㊃L-127-BCZ暴露后,斑马鱼胚胎开始显示严第4期郝迪等:基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应295㊀重的心脏畸形,且微摩尔数量级的PHCZs浓度暴露即可诱导心脏细胞色素P450酶1A1(cytochrome P4501A1,cyp1a1)基因表达和蛋白合成,推测27-BCZ可能具有类二噁英的毒性效应㊂以上研究表明,27-BCZ暴露可能影响生物体正常发育,其毒性效应可能与其类似二噁英的化学结构以及AhR 信号通路有关,因此27-BCZ的健康风险值得我们关注㊂肌肉发育过程的调控机制严格而复杂,受到多种调控因素和多种信号的共同作用[12]㊂本文首先从细胞层面探究27-BCZ是否对肌源性分化有TCDD 样的干扰作用;并进一步从分子层面探究27-BCZ 在分化过程中对发育效应分子Myh3和Myh4表达及分化调控分子肌生成调节因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)的影响,旨在明确新型污染物27-BCZ的肌肉发育毒性效应,并为PHCZs类污染物的风险评估提供理论依据㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀材料和仪器小鼠成肌细胞C2C12购于北京协和细胞资源中心㊂27-BCZ(CAS:136630-39-2)购自Wellington Laboratory公司(加拿大)㊂二甲基亚砜(dimethyl sul-foxide,DMSO)购自Sigma公司(美国)㊂磷酸缓冲液(PBS)㊁Cell Counting Kit-8(CCK-8)㊁H&E染色试剂盒购自Solarbio公司(中国)㊂青霉素/链霉素(P/S)㊁胰蛋白酶㊁Dulbecco s Modified Eagles(DMEM)培养基㊁马血清(HS)购自Gibco公司(美国)㊂胎牛血清(FBS)购自Biological Industries公司(美国)㊂Gene-JET®RNA Purification Kit㊁RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo Fisher Scientific公司(美国);GoTaq®qPCR Master Mix Kit购自Pro-mega公司(美国)㊂以上试剂均为分析纯㊂细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific,Thermo 311,美国);光学显微镜(中国上海光学仪器厂,OLYMPUS CKX41,日本);显微镜照相机(Can-on,DS12631,日本);超净工作台(上海力康,HFsafe-1200,中国);超微量分光光度计(Thermo,Nanodrop 2000,美国);普通PCR仪(BIO-RAD,BIO-RAD T100TM Thermal Cycler,美国);滤光片型多功能酶标仪(Tecan,Infinite F200Pro,瑞士);实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher Scientific,Roche Light Cycle 480,美国)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀细胞培养本实验基于小鼠成肌细胞C2C12,采用逐级血清饥饿法,诱导C2C12细胞融合分化成梭形肌管,构建肌肉分化发育模型[4]㊂C2C12细胞采用含20% FBS和1%P/S的DMEM培养基(Growth Medium, GM)进行培养㊂细胞正常传代3代以上,观察到梭形的细胞均匀贴壁生长,无大面积成团且生长速度稳定,此时将细胞接种到6孔板中准备诱导分化,细胞密度为105个㊃mL-1,每孔2mL培养基㊂当细胞在GM中生长到密度为80%左右时,更换为含10% FBS和1%P/S的DMEM培养基,以控制细胞的增殖速度,使细胞充分融合,防止因增长过快导致细胞成团贴壁生长从而影响分化㊂当细胞达到完全融合状态时,改用含2%HS和1%P/S的DMEM培养基(Differentiation Medium,DM)进行诱导分化[13]㊂培养条件为37ħ㊁5%CO2㊂之后每天换液,在DM 中生长到第2天时应观察到细胞更紧密整齐地规则排列,并且有已经融合的较短的梭形肌管出现;在第3天时应明显观察到大部分肌管发生融合,此时肌管生长旺盛;到第6天时大多数细胞分化为成熟的梭形肌管,肌管形成基本完毕㊂本研究选择分化过程3个有代表性的时间节点:第1天(day1),代表分化前期(尚未开始分化,绝大部分细胞为单核圆形);第3天(day3),代表分化中期(大部分单核细胞融合成多核的梭形肌管);第6天(day6),代表分化末期(肌管成熟)进行实验研究㊂1.2.2㊀化合物暴露本实验所用27-BCZ以DMSO为溶剂,母液浓度为10-4mol㊃L-1㊂CCK-8测增殖毒性实验中27-BCZ处理浓度为10-14~10-7mol㊃L-1,以DMSO (0.1%)为溶剂对照,从分化第0天(day0)开始连续27-BCZ处理,测定处理24㊁48㊁144h后的细胞活力㊂在形态学实验和基因表达测定中,采用4种27-BCZ处理浓度,分别为10-10㊁10-9㊁10-8㊁10-7mol㊃L-1,从分化day0开始持续处理细胞,收集分化day1㊁day3㊁day6的细胞进行后续实验㊂1.2.3㊀CCK-8法测定细胞毒性效应参考CCK-8试剂盒说明书测定27-BCZ对细胞增殖的影响㊂细胞按照每孔104个的密度接种在96孔板中,37ħ培养24h后去除原培养基进行化合物暴露㊂27-BCZ的浓度为10-14~10-7mol㊃L-1,每组6个平行复孔㊂分别暴露24h(day1)㊁48h(day2)㊁296㊀生态毒理学报第18卷144h(day6)后,每孔加入10μL CCK -8试剂,在培养箱中孵育1~4h ,使用酶标仪(Infinite F200Pro ,Te -can)测定在450nm 波长下的吸光度㊂细胞活力计算公式为:细胞存活率=(A 处理组-A 空白对照)/(A 阴性对照-A 空白对照)式中:处理组指溶剂对照组和27-BCZ 处理组;空白对照指培养基(DM)对照;阴性对照指不加任何化合物下正常生长的细胞㊂1.2.4㊀细胞苏木素-伊红染色(Hematoxylin -Eosin staining ,H&E 染色)㊀㊀本研究采用H&E 染色对分化的细胞进行形态学分析㊂C2C12细胞以每孔106个细胞的密度接种于6孔板后,取分化day1㊁day3和day6的细胞进行H&E 染色㊂具体步骤参考试剂盒说明㊂染色结束后显微镜下观察并拍照:6孔板中每个孔随机取3个视野进行拍照记录,结果使用ImageJ 1.51k 软件(Media Cybernetics,USA)进行分析,记录每条肌管内细胞核数㊁视野内细胞核总数㊂本研究使用2个评价指标来评估肌发育过程:细胞融合指数和单条肌管内细胞核数㊂细胞融合指数为融合进肌管内的细胞核总数比视野内总细胞核数的比值,反映了C2C12参与分化的效率㊂单条肌管内细胞核数为每个处理组中,每条肌管内的细胞核的数量,反映了肌管成熟的程度㊂单条肌管内细胞核数越多,代表该条肌管发育越成熟㊂使用小提琴图来呈现单条肌管内细胞核数的分布情况,以此评估分化效果㊂小提琴图中,对应Y 轴的范围表示肌管内细胞核数量的分布的范围,每个小提琴最宽处对应的Y 轴值代表该处理组中绝大多数肌管内细胞核数目㊂1.2.5㊀实时荧光定量PCR(qRT -PCR)法检测基因表达水平㊀㊀C2C12细胞接种于6孔板中,接种密度为每孔106个㊂收集诱导分化day1㊁day3和day6的细胞㊂吸去培养基,1ˑPBS 冲洗2遍㊂使用GeneJET ®RNA 纯化试剂盒(Thermo)提取细胞总RNA ㊂利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)将RNA 逆转录为cDNA ㊂然后,使用QuantStudi -on TM 6Flex 实时PCR 系统(Thermo)以及GoTaq ®qPCR Master Mix (Promega,Madison,WI,USA)进行实时荧光定量PCR 检测㊂所选基因包括MyoD ㊁Myogenin ㊁Mrf4㊁Myh3㊁Myh4㊁cyp1a1㊁cyp1b1㊁甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh )㊂引物由Primer Premier 6(Premier,Biosoft)设计(序列见表1),由生工生物技术(上海,中国)合成㊂所有样本均进行3次独立重复实验,并采用2-ΔΔC T 方法[14]分析mRNA 表达水平㊂表1　引物序列Table 1㊀Primer sequences used in qRT -PCR study基因Gene基因ID Gene ID 特异性引物序列(5 ~3 )Specific primer sequence (5 ~3 )目的片段长度/bp Destination fragment length/bpMyoD17927(F)AGCACTACAGTGGCGACTCA (R)GCTCCACTATGCTGGACAGG 201Myogenin 17928(F)AGGCTGGGTGTGCATGTGA (R)TTAAAAGCCCCCTGCTACAGAAG 70Mrf417878(F)GCTAAGGAAGGAGGAGCAAA (R)GAAGAAAGGCGCTGAAGACT 62Myh317883(F)AAGGCCAAAAAGGCCATC (R)TCTTCTGCTCCCCTTCCA 235Myh417884(F)TTGAAAAGACGAAGCAGCGAC (R)AGAGAGCGGGACTCCTCCTG 190cyp1a113076(F)GACCCTTACAAGTATTTGGTCGT (R)GGTATCCAGAGCCAGTAACCT 145cyp1b113078(F)TCCTCTTTACCAGATACCCGGAT (R)AAAAGCTGGAGAATCGCATT 153gapdh 14433(F)AGCTCACTGGCATGGCCTTC (R)ACGCCTGCTTCACCACCTTC117第4期郝迪等:基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应297㊀1.2.6㊀数据统计分析数据统计和分析使用GraphPad Prism 软件(版本6,La Jolla,CA ,美国)进行统计分析和绘制图形㊂实验结果表示为均值ʃ标准差(n =3),进行3次独立重复实验㊂统计学检验采用单因素方差分析或双因素方差分析,采用Bonferroni 方法进行多重比较校正㊂P <0.05表示差异有统计学意义㊂2㊀结果(Results )2.1㊀27-BCZ 对细胞增殖的影响首先采用CCK -8实验明确27-BCZ 处理对细胞活力的影响㊂结果表明,经过24h(图1(a))或48h 27-BCZ(图1(b))处理后,细胞活力与对照组相比无明显变化,说明10-10~10-7mol ㊃L -1浓度范围内的27-BCZ 无增殖毒性㊂但10-8mol ㊃L -1和10-7mol ㊃L -1的27-BCZ 处理144h(图1(c))后,细胞活力与对照组相比增加,且差异有统计学意义(P <0.05),提示高浓度27-BCZ 可能对细胞增殖有促进作用㊂2.2㊀27-BCZ 抑制C2C12细胞分化过程中肌管的形成㊀㊀为探究27-BCZ 暴露对肌发育的影响,选择对细胞增殖无毒性的浓度范围(10-10~10-7mol ㊃L -1)的27-BCZ 连续处理C2C12细胞,并选择肌管形成的中期(day3)和肌管形成末期(day6)作为时间节点,通过H&E 染色,观察27-BCZ 对肌管形成产生的影响㊂10-7mol ㊃L -127-BCZ 处理对分化的抑制作用在day3较为明显(图2(a))㊂从肌管day3的H&E 染色图观察到,10-7mol ㊃L -127-BCZ 处理组中,分化的C2C12细胞的数量明显少于溶剂对照组,并且每个肌管中的细胞核数量较少(图2(a))㊂从小提琴图中观察到,10-7mol ㊃L -127-BCZ 处理组day3的细胞核数量大部分约为5个,处理组单条肌管内融合的细胞核平均数量比对照组少3个,小提琴形状扁平,表明数据集中分布在较低水平(图2(b))㊂在分化末期图1㊀27-BCZ 对细胞活力的影响注:27-BCZ 处理浓度为10-14~10-7mol ㊃L -1,DMSO(0.1%)用作溶剂对照;27-BCZ 从第0天开始持续处理;处理24h(a)㊁48h(b)和144h(c)的细胞通过CCK -8法测定细胞活力;具体实验步骤见材料与方法的相关内容;数据为对照组的倍数,用平均值ʃ标准差(n =3)表示,进行3次独立重复实验;统计分析方法为单因素方差分析和Bonferroni 多重比较(*表示27-BCZ 与对照组之间差异有统计学意义,显著性水平设为P <0.05,****代表P <0.0001)㊂Fig.1㊀Effect of 27-BCZ on C2C12cell viability during differentiationNote:The treatment concentration of 27-BCZ were 10-14~10-7mol ㊃L -1;DMSO (0.1%)served as the solvent control;27-BCZ wascontinuously treated from day0;cells treated for 24h (a),48h (b)and 144h (c)were subjected to determine cell viability by CCK -8method;see the relevant contents of Materials and Methods for specific experimental steps;the data are folds of control group and expressed as mean ʃSD (n =3);all samples were measured in three independent experiments;statistical analysis methods were one -way ANOV A and Bonferroni multiple comparison (*indicates a statistically significant difference between the 27-BCZ treatment and control;the level of significance was set at P <0.05;****represents P <0.0001).298㊀生态毒理学报第18卷图2㊀27-BCZ 处理后C2C12的形态学变化注:27-BCZ 的处理浓度为10-10~10-7mol ㊃L -1,DMSO 的处理浓度为0.1%,连续27-BCZ 处理从第0天开始;收集在分化day3和day6的细胞进行H&E 染色;每个处理浓度选取3个随机视野(n =3),统计肌管内细胞核数;(a)每个时间点的不同浓度处理组选取的代表性图片,比例尺=50μm ;(b)27-BCZ 处理后肌管中细胞数量的小提琴图;统计分析方法为单因素方差分析和Bonferroni 多重比较(*表示27-BCZ 处理组与对照组(day3和day6)的平均值的差异有统计学意义;显著性水平设定为P <0.05;*代表P <0.05,****代表P <0.0001)㊂Fig.2㊀Morphological changes after 27-BCZ treatmentNote:The treatment concentrations of 27-BCZ were 10-10~10-7mol ㊃L -1,and that of DMSO solvent was 0.1%;the continuous 27-BCZ treatment started from day0;cells were collected on differentiation day3and day6for H&E staining;select three random fields (n =3)for each treatment concentration and count the number of nuclei in the myotubes;(a)One of the representative pictures of each treatment group at each timepoint is shown;scale bar =50μm;(b)Violin plot of the number of nuclei in myotubes after treatment with 27-BCZ;statistical analysis methods were one -way ANOV A and Bonferroni multiple comparison (*indicates a statistically significant difference between the 27-BCZ treatment and control (day3and day6)in the mean value of nuclei inmyotubes;the level of significance was set at P <0.05;*represents P <0.05,****represents P <0.0001).day6,从染色结果可以观察到,随着处理浓度升高,形成的肌管形状更细,肌管内细胞核数略有降低(图2(a)),但单条肌管内融合的细胞核平均数量与对照组相比差异无统计学意义(图2(b))㊂为了进一步表征C2C12细胞肌管形成的效率,我们通过计算融合肌管中的细胞核总数(肌管内细胞核不少于2个)与在每个选定视野中观察到的细胞核总数的比率来量化融合指数㊂结果表明,27-BCZ 处理组的融合指数以浓度依赖的方式降低(图3)㊂结果表明,在分化中期day3,高浓度27-BCZ 不仅降低肌管的细胞核容量(图2(b)),肌管形成的效率下降,最高浓度处理组的细胞融合指数下降33.97%(图3),且与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)㊂在分化末期day6,27-BCZ 10-7mol ㊃L -1处理组细胞融合指数与对照组相比降低32.55%(图3)㊂结合肌管内细胞核数和融合指数,我们发现在分化末期,虽然27-BCZ 对肌管内细胞核容量与对照组相比差异无统计学意义(P >0.05),但是C2C12细胞参与融合形成多核肌管的效率变低(图2(b)和图3)㊂2.3㊀27-BCZ 降低肌管成熟标记基因Myh3和Myh4的表达㊀㊀肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)是肌管的重要结构蛋白,本研究使用其编码基因Myh3和Myh4作为分化成熟的标志分子㊂27-BCZ 处理抑制了肌管形成中期和末期C2C12细胞中Myh3和Myh4的表达,且大多数抑制作用呈浓度依赖性第4期郝迪等:基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应299㊀(图4(a)和图4(b))㊂如图4所示,在对照组中,Myh3基因的表达在day3已经达到较高水平,day6基本没有明显的变化(图4(a))㊂27-BCZ对Myh3的抑制效果在分化中期day3开始体现,在day3时,10-9 mol㊃L-1和10-7mol㊃L-127-BCZ处理组的Myh3比对照组分别下降了34.16%和38.88%;在day6时10-7mol㊃L-127-BCZ处理组Myh3比对照组下降了37.97%(图4(a))㊂正常成肌分化(对照组)状态下,Myh4的表达量随时间持续增加,在day6时达到最高值(图4(b))㊂图3㊀27-BCZ暴露抑制分化到day3和day6的细胞融合指数注:将C2C12细胞接种到6个孔板中以诱导分化,收集分化到day3和day6的细胞进行H&E染色统计;27-BCZ的处理浓度为10-10~10-7mol㊃L-1,DMSO(0.1%)用作溶剂对照;融合指数,代表参与融合形成肌管的细胞核数与细胞核总数之比;具体实验步骤见材料与方法的相关内容;数据为平均值ʃ标准差(n=3),进行3次独立重复实验;统计分析方法为单因素方差分析和Bonferroni 多重比较(*表示27-BCZ处理组与对照组之间差异有统计学意义;显著性水平设置为P<0.05,*代表P<0.05,**代表P<0.01)㊂Fig.3㊀27-BCZ reduced the fusion index in day3and day6of C2C12differentiationNote:C2C12cells were seeded into six well plates to induce differentiation,and cells were collected at day3and day6of differentiation forH&E staining;the treatment concentration of27-BCZ were10-10~10-7mol㊃L-1;DMSO(0.1%)served as the solvent control;fusion index, representing the proportion of total nuclei found in myotubes;see the relevant contents of Materials and Methods for specific experimental steps;the data is meanʃSD(n=3);all samples were measured in three independent experiments;statistical analysis methods were two-way ANOV A and Bonferroni multiple comparison(*indicates a statistically significant difference between the27-BCZ treatment and control;the level of significance was set at P<0.05;*represents P<0.05,**represents P<0.01).图4㊀27-BCZ对Myh3和Myh4基因表达的影响注:从day0到day6,用10-10~10-7mol㊃L-1的27-BCZ或溶剂对照(DMSO,0.1%)连续处理C2C12细胞,并在day1㊁day3和day6收集;通过qRT-PCR测定Myh3(a)和Myh4(b)的mRNA表达水平,通过gapdh进行定量标准化;数值为相比于day0对照组表达量倍数,并表示为平均值ʃ标准差(n=3),进行3次独立重复实验;统计分析方法为双因素方差分析和Bonferroni多重比较(*表示在同一时间点与对照组相比差异有统计学意义;显著性水平设置为P<0.05;**代表P<0.01,***代表P<0.001,****代表P<0.0001)㊂Fig.4㊀Effect of27-BCZ on gene expression of Myh3and Myh4Note:C2C12cells were continuously treated with27-BCZ at10-10to10-7mol㊃L-1,or solvent control(DMSO,0.1%)from day0to day6,and collected on day1,day3and day6;the mRNA expression levels of Myh3(a)and Myh4(b)were determined by qRT-PCR,quantified by normalization to internal control gapdh;values are fold of basal level obtained on day0,and expressed as meanʃSD(n=3);each independent sample was tested in triplicate;statistical analysis methods were two-way ANOV A and Bonferroni multiple comparison (*indicates statistically significant difference compared with the control group in the same time point;the levelof significance was set at P<0.05;**represents P<0.01,***represents P<0.001,****represents P<0.0001).300㊀生态毒理学报第18卷在分化前期和中期,即day1和day3,27-BCZ暴露浓度增加对Myh4的表达量具有一定促进作用,但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(图4(b))㊂在day6,与对照组相比,10-10mol㊃L-127-BCZ处理组中Myh4的表达量提高17.75%,10-8mol㊃L-1和10-7mol㊃L-127-BCZ处理组中Myh4的表达量分别降低了16.12%和32.69%,表达量与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)(图4(b))㊂在day6,随27-BCZ暴露浓度增加,Myh4表达量呈现低浓度促进表达和高浓度抑制表达的结果(图4(b))㊂2.4㊀27-BCZ暴露干扰肌发育调节基因MRFs的表达MyoD和Myogenin被认为是肌生成的2个最终分化驱动因素[15]㊂在对照组中,MyoD的mRNA 表达在分化期间先增加,然后减少,在day3达到最高表达水平(图5(a))㊂27-BCZ处理存在时间和浓度依赖性抑制MyoD的mRNA表达(图5(a))㊂最高浓度的27-BCZ处理后,MyoD基因的表达从分化day1到day6与对照组相比降低,且差异有统计学意义(P<0.05),在day6达到最高抑制率(34.64%);而对于10-8mol㊃L-1处理组,在后期(day3和day6)观察到显著的影响;然而,在10-10mol㊃L-1和10-9mol㊃L-127-BCZ处理组中均未检测到显著影响(图5(a))㊂作为三者中低剂量即产生效应的最敏感的MRF,与对照组相比,MyoD基因表达随时间变化的曲线也发生了变化,即在10-8mol㊃L-1处理时,表达稍早达到峰值水平,在10-7mol㊃L-1处理6d后,与对照组相比表达急剧下降(降低34.64%)(图5(a))㊂关于另一种早中期的MRF,Myogenin仅在第3天以10-9 mol㊃L-1处理后与对照组相比差异才有统计学意义(P<0.05),整个分化期的表达谱没有变化(图5(c))㊂如图5(b)所示,分化前期和中期Mrf4表达水平较低,直到day6,所有处理组才观察到Mrf4的mRNA 表达,与day6的对照组相比,在10-9mol㊃L-1和10-7 mol㊃L-1的27-BCZ处理后,Mrf4表达受到抑制,分图5㊀27-BCZ对MRF基因表达的影响注:从day0到day6,用10-10~10-7mol㊃L-1的27-BCZ或溶剂对照(DMSO,0.1%)连续处理C2C12细胞,并在day1㊁day3和day6收集;通过qRT-PCR测定(a)MyoD㊁(b)Myogenin㊁(c)Mrf4的mRNA表达水平,通过管家基因gapdh进行定量;数值为第0天获得的基础水平的倍数,并表示为平均值ʃ标准差(n=3),进行3次独立重复实验;统计分析方法为双因素方差分析和Bonferroni多重比较(*表示在同一时间点与对照组相比差异有统计学意义;显著性水平设置为P<0.05,*代表P<0.05,***代表P<0.001,****代表P<0.0001)㊂Fig.5㊀Effects of27-BCZ on the gene expression of MRFsNote:C2C12cells were continuously treated with27-BCZ at10-10to10-7mol㊃L-1,or solvent control(DMSO,0.1%)from day0to day6,and collected on day1,day3and day6;the mRNA expression levels of(a)MyoD,(b)Myogenin,(c)Mrf4were determined by qRT-PCR, quantified by normalization to internal control gapdh;values are fold of basal level obtained on day0,and expressed as meanʃSD(n=3);each independent sample was tested in triplicate;statistical analysis methods were two-way ANOV A and Bonferroni multiple comparison (*indicates a statistically significant difference compared with the control group in the same time point;the level of significance was set at P<0.05;*represents P<0.05,***represents P<0.001,****represents P<0.0001).第4期郝迪等:基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应301㊀别降低了12.40%和34.71%,且差异有统计学意义㊂2.5㊀27-BCZ 诱导cyp1a1和cyp1b1基因表达cyp1a1和cyp1b1是AhR 通路2个经典的下游靶基因㊂由于先前已经报道,27-BCZ 在小鼠肝癌细胞中激活AhR 效率相对较高[7],我们认为27-BCZ 在C2C12细胞中可能具有类似的AhR 激活能力㊂因此,我们研究了27-BCZ 对AhR 下游2个基因表达的影响,以明确其在我们的研究模型中对激活AhR 的作用㊂结果显示,27-BCZ 以时间和浓度依赖的方式诱导cyp1a1和cyp1b1的mRNA 表达(图6)㊂且cyp1a1基因表达诱导比cyp1b1更有效,cyp1a1和cyp1b1的最大诱导都出现在分化末期day6,与day0对照组相比最高激活倍数分别为9.4倍和6.2倍(图6)㊂图6㊀27-BCZ 对AhR 通路下游基因表达的影响注:从day0到day6,用10-10~10-7mol ㊃L -1的27-BCZ 或溶剂对照(DMSO ,0.1%)连续处理C2C12细胞,并在day1㊁day3和day6收集;通过qRT -PCR 测定cyp1a1(a)和cyp1b1(b)的mRNA 表达水平,通过管家基因gapdh 进行定量;数值为第0天获得的基础水平的倍数,并表示为平均值ʃ标准差(n =3),进行3次独立重复实验;统计分析方法为双因素方差分析和Bonferroni 多重比较(*表示在同一时间点与对照组相比差异有统计学意义;显著性水平设置为P <0.05,*代表P <0.05,**代表P <0.01,***代表P <0.001,****代表P <0.0001)Fig.6㊀Effect of 27-BCZ on the expression of downstream genes of AhR pathwayNote:C2C12cells were continuously treated with 27-BCZ at 10-10to 10-7mol ㊃L -1,or solvent control (DMSO,0.1%)from day0to day6,and collected on day1,day3and day6;the mRNA expression levels of cyp1a1(a)and cyp1b1(b)were determined by qRT -PCR,quantified by normalization to internal control gapdh ;values are fold of basal level obtained on day0,and expressed as mean ʃSD (n =3);each independent sample was tested in triplicate;statistical analysis methods were two -way ANOV A and Bonferroni multiple comparison (*indicates statistically significant difference compared with the control group in the same time point;the level of significance was set at P <0.05;*represents P <0.05,**represents P <0.01,***represents P <0.001,****represents P <0.0001).3㊀讨论(Discussion )本研究检测27-BCZ 暴露后C2C12细胞肌发育形态学和肌生成标志分子和调节分子的变化,实验数据显示27-BCZ 具有与TCDD 类似的肌发育干扰效应㊂27-BCZ 可以在细胞和分子水平上引起肌源性分化的紊乱,影响肌管的形成和成熟,且抑制效应呈剂量㊁时间依赖性㊂在分子水平上,我们发现27-BCZ 暴露影响肌分化调节因子MRFs 的表达,并抑制分化成熟标志分子Myh3和Myh4的表达,与形态学上抑制肌分化表现出一致性㊂另外,27-BCZ 在影响肌发生的同时,还能够激活AhR 下游靶基因cyp1a1和cyp1b1,表现出与二噁英类似的AhR 活性,为进一步机制研究提供方向㊂我们统计细胞融合指数和单条肌管内细胞核数这2个评估分化效果的参数指标的变化,分析27-BCZ 暴露后对肌管形态学的影响㊂结果显示,27-BCZ 在分化中期(day3)可以抑制肌管的形成,表现为细胞融合效率的降低和肌管内细胞核容量的减少㊂而在分化末期day6,27-BCZ 对分化的影响主要表现在降低细胞融合效率㊂且27-BCZ 暴露时间越长,处理浓度越高,对细胞融合效率和肌管内细胞容量的抑制作用越显著㊂这与此前文献报道的TC -DD 抑制肌管生成而导致肌发育毒性结果类似[4]㊂说明27-BCZ 是一种具有类似二噁英肌发育毒性的污染物㊂在CCK -8实验中我们发现在诱导分化的条件下,分化末期高浓度27-BCZ 处理能使细胞活力上升,提示高浓度27-BCZ 可能促进细胞的增殖㊂这与此前报道的肌肉发育过程中,增殖和分化呈现负相关的结果相一致㊂有研究报道肌肉发育是一个高。

稳定表达人ASB12的C2C12细胞系的建立及鉴定

第16卷第4期生命科学研究V01．16 No．4 2012年8月“fe S c ie n c e Research Aug．2012稳定表达人ASBl2的C2C12细胞系的建立及鉴定文斗斗1，周军媚邵，赵明一2，胡维新1，吴秀山2，王跃群妒(1．中南大学生物科学与技术学院，中国湖南长沙410013；2．湖南师范大学心脏发育研究中心，发育生物学教育部重点实验室，中国湖南长沙410081；3．南华大学药学与生命科学学院，中国湖南衡阳421001)摘要：AS Bl2 ho mo s ap ie ns a n ky f i n repe at and SOCS b o x c on ta in in g 121蛋白含有5个ANK f an ky fin repe a t qu en ce)序列和一个保守的SO CS(s up pr es so r of cy tok in e si gnaling)盒结构域，是ASBs human anky ri n re pe ata n d SOCSb ox cont ain in g protei n f am i l y。

A S B family)家族的成员．人类A骝12基因在成体心肌和骨骼肌组织中特异表达，是成肌分化的候选基因．利用阳离子聚合物转染技术将重组表达质粒pCMV．ta92B-ASBl2转染小鼠骨骼肌细胞系C2C12细胞，通过G418筛选、免疫荧光检测、RT．PCR分析、Western blotting检测建立了稳定表达ASBl2的细胞系C2C12．ASBl2，为研究ASBl2在骨骼肌发育及其相关功能提供有用的细胞研究模型．关键词：ASBl2；ANK结构域：SOCS box结构域：C2C12稳定细胞系中图分类号：Q28文献标识码：A文章编号：1007—7847(2012)04．0283．04Establishment and Identification of a Stable HumanASB12-Expressed C2C12Cell LineWEN Dou—doul，ZHOU Jun—mei2'3，ZHAO Ming—yi2，HU Wei—xinl，WU Xiu-shan2，WANG Yue-qun24(1．C oll ege of L乒Sciences and Technology,Central S o ut h University,Changsha410013，Hunan，China；2．Th e C en t er fo rH ea r t Developrncnt，Key Lab ofMOE ofDevele pment al Bio log y,H una n N orma l U n i v e r s i t y,C h a n g s h a 410081，Hu na n，Ch in a,． 3．Coll ege ofPharmacy and L咖Science，University ofSouth Chin a,He ng ya ng 421001，Hunan,吼i嘲Abstract：The human ASB12(Homo sap ie ns ankyrin repeat and SOCS box con ta ini ng 12)protein contains five ANK(ankyfin repea t sequence)domains and a SOCS(suppressor of cytoki ne signaling)box domain，be- lon gin g to the ASBs family．It was repose d that ASBl2especially e xp re ss ed i n skeletal and card iac muscles of adult tissues，which su gg es te d that ASB12 closely associa ted wit h skel eto n muscle development．To c o n．stru ct a stable ASBl2一expressed C2C12cell line，the fusion expres sio n plasmid pCMV—ta92B—ASBl2，which w a s identified by enzyme digesti on and s eq u e n c in g a nal ysi s，wa s transfected in t o C2C12cell by cationicpo ly me r．A ft er s cr e en in g cult ure by G418，the ex pr es sio n of ASB12w a s detected by immunofluoresc；nce，RT-PCR and Western—blotti ng．The C2C12cell line that expr ess in g A SBl2stably w a s establi sh ed successfully，which p rov id e a cell model for studyin g the molecular function of ASB12 in skeleton muscle developm ent．Key words：ASB12；ANK domian；SOCS box domain；C2C12stable cell line(L／fe Science Research，2012，16(4)：283。

温度敏感型可注射水凝胶的性质及应用研究进展

温度敏感型可注射水凝胶的性质及应用研究进展任婷婷;卢清侠;郝慧芳;邓瑞广;张改平【摘要】The temperature-sensitive injectable hydrogels is a new type of material that is sensitive to tem-perature,its physical state could be changed as the temperature changes.This kind of material has been widely applied in the vaccine,drug control-release and tissue support engineering because of this character-istics.Temperature-sensitive injectable hydrogel materials can be divided into 5 types according to their structures,the author analyzed and discussed the thermodynamicmechanism,biocompatibility,toxicity and degradability of these five materials,specified the characteristics of each material,and summarized the pro-gress on the application of each material in the drug and vaccine delivery system and the tissue support en-gineering respectively,provided scientific basis for the application of temperature-sensitive injectable hydro-gel in the field of human and animal medicine,and prospects for its future development were discussed.%温度敏感型可注射水凝胶是一种对温度敏感的新型材料,可以随着温度的变化发生物理状态的变化.由于这种特性,该水凝胶材料近年来被广泛的应用于疫苗和药物控释以及组织支架工程等领域.温度敏感型可注射水凝胶材料根据其结构的不同大致可分为5个种类,论文对这5种材料的温变机制、生物相容性、毒性、可降解性等性质进行了综述,阐述了每种材料的特点,并对各个材料在药物疫苗传递系统和组织支架工程两方面的应用研究进展分别进行了归纳和总结,为温度敏感型可注射水凝胶在人类和动物医学领域的应用提供科学依据,并对其未来发展前景进行展望.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2018(039)001【总页数】5页(P99-103)【关键词】温度敏感型水凝胶;可注射水凝胶;疫苗控释;药物控释;生物医用材料【作者】任婷婷;卢清侠;郝慧芳;邓瑞广;张改平【作者单位】河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S859.1水凝胶是一种在吸水后溶胀但不溶于水的高分子聚合物，呈三维网状结构，可注射水凝胶作为一种新型水凝胶，由于其独特的优势成为研究的热点。

C2C12成肌细胞诱导肌性分化过程中miR-101a的表达

C2C12成肌细胞诱导肌性分化过程中miR-101a的表达李粉;王丽;郑艳艳;陈华群【摘要】以C2C12成肌细胞为模型,在分化培养基中诱导C2C12建立体外肌性细胞分化模型.以poly (A)3′-端加尾和实时定量PCR方法研究miR-101a在C2C12细胞分化过程中的表达情况.结果发现,在细胞转入分化培养基进行肌性分化的1-5 d中,miR-101a的表达量逐渐增加,提示miR-101a可能在肌肉发生中发挥调控作用.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)001【总页数】4页(P116-119)【关键词】C2C12C成肌细胞;实时定量PCR;miR-101a;肌分化【作者】李粉;王丽;郑艳艳;陈华群【作者单位】南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学生物技术重点实验室,南京210046;南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学生物技术重点实验室,南京210046;南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学生物技术重点实验室,南京210046;南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学生物技术重点实验室,南京210046【正文语种】中文在个体发育中，肌肉组织的发育主要表现为肌细胞数量的增加和肌细胞体积的膨胀两个方面，这两方面的完成依赖于细胞的增殖和分化［1］。

小鼠C2C12成肌细胞在体外可以模拟肌肉发生过程。

在营养因子丰富的培养基中，C2C12保持增殖状态；当培养基中营养因子缺乏时，则退出细胞周期、停止增殖，分化为肌管细胞并融合为肌纤维［2］。

肌肉发育过程中许多调节因子包括转录因子、细胞信号分子如生肌调节因子、锌指蛋白、Wnt家族成员等在肌细胞的增殖、分化中发挥重要作用［3］。

microRNA （miRNA）是一类大小为22 nt的小分子非编码RNA, 通过其5'端种子序列（seed sequence）与靶基因mRNA 3'端非翻译区（3'-untranslated region, 3'UTR）的互补配对而抑制蛋白质的翻译或促进mRNA的降解，在转录后水平调节蛋白质的表达［4］。

c2c12小鼠细胞免疫荧光染色实验分析

c2c12小鼠细胞免疫荧光染色实验分析间接法免疫荧光组织化学染色步骤1．检测抗原法以单层细胞培养标本为例介绍此法的染色步骤：(1)取出细胞贴附生长的小盖片，用预热的PBS冲洗2次；(2)4％多聚甲醛(或冷丙酮)固定5～10分钟，晾干；(3)0．01MPBS(pH 7．4)漂洗3次，每次5分钟。

(4)0．3％Triton X-100孵育，室温20分钟，PBS漂洗2次(细胞膜抗原可省略此步骤)；(5)非免疫血清(或15％小牛血清)孵育，室温10分钟；(6)滴加特异性一抗(如小鼠抗大鼠波形蛋白单克隆抗体，l：200稀释度)，4℃过夜或37℃孵育30分钟，BS漂洗3次，每次5分钟；(7)滴加与第一抗体种属匹配的荧光素标记二抗(如羊抗小鼠FITC-IgG。

1：100)，37℃避光孵育30分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；(8)Hoechst 333442复染细胞核15～20分钟(不是必需步骤)；(9)甘油磷酸缓冲液封片，荧光显微镜下镜观察；(10)结果分析：波形蛋白免疫反应阳性细胞胞质呈现绿色荧光，如细胞核复染后可呈现亮蓝色荧光。

阴性细胞仅见细胞核为亮蓝色荧光。

荧光免疫细胞化学染色原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞，波形蛋白免疫反应阳性细胞呈绿色荧光（FITC标记二抗)注意事项：①如标本为甲醛固定的组织切片，需增加抗原修复步骤；②对于易脱片的细胞样品在固定后增加晾干时间，可起到防脱片的作用；③如果结果分析显示有非特异性染色，则需在正常血清封闭之后再用5％牛血清白蛋白封闭。

2．检测抗体法(1)切片或涂片固定后，置于染色湿盒内，滴加未标记的特异性抗原于标本表面，37℃孵育30分钟，PBS漂洗2次，每次5分钟。

用吸水纸吸去残留液体；(2)滴加荧光标记抗体37℃孵育30分钟，PBS漂洗同上；(3)甘油磷酸缓冲液或抗淬灭剂封固，荧光显微镜下检测。

右美托咪定对小鼠成肌细胞C2C12增殖、分化的影响

网络出版时间：2020 -8 -21 15 ：08 网络出版地址：htt p s ://kns . enki. netkems/detil/34. 1065. R. 20200820. 1449. 011. html右美托咪定对小鼠成肌细胞C2C12增殖、分化的影响陈燕燕心，徐魏'，向力'，岳静'，李兴元'，王露'，郑飞'，唐俊明3>4，郑敏*22020 -05 -06 接收基金项目：国家自然科学基金（编号：81670272）；湖北省科技厅重大创新专项（编号：2018ACA162）;湖北医药学院创新团队项目（编号:FDFR201601）;湖北医药学院生物医药研究院PI 项目（编号:HBMUPL01807）作者单位:1 4锦州医科大学湖北医药学院研究生培养基地，锦州1210012十堰市人民医院麻醉科（湖北医药学院附属人民医院），十堰4420003湖北医药学院附属十堰市人民医院临床医学研究所，十4420004湖北医药学院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，十堰442000作者简介:陈燕燕，女，硕士研究生；唐俊明，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail:Wn/jm416@ 163 - dm ；郑敏，女，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail ：lhj1286@163 .com摘要目的观察右美托咪定对小鼠成肌细胞C2C12增殖、分化的影响，探究心力衰竭患者骨骼肌病的发病机制。

方法用免疫组化分析C2C12细胞肾上腺素能受体的表达特征。

将C2C12细胞分为6组:对照组和右美托咪定5个浓度梯度组（5、10、20、40、80 mmol/L ）。

CCK-8法检测右美托咪定对C2C12细胞增殖的影响。

用分化培养基诱导C2C12 分化，按单次和连续单次的给药方式给C2C12细胞加药，分化6 d 后，用免疫荧光检测不同分组肌球蛋白重链（MYH ）、肌细胞增强因子2C （ MEF2C ）、肌细胞生成蛋白# MyoG ）的表达水平，并定量分析C2C12细胞分化、融合为含不同细胞核数的肌管数。

关于骨骼肌肌细胞增殖及分化过程中凋亡现象

关于骨骼肌肌细胞增殖及分化过程中凋亡现象【关键词】骨骼肌关键词: 骨骼肌;细胞凋亡;细胞分化摘要:目的对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究. 方法本实验采用体外培养的C2C12肌母细胞分化模型，用流式细胞仪检测肌细胞分化过程中细胞周期的变化，提取细胞基因组DNA进行电泳分析，用原位末端标记法进行了凋亡细胞染色，电子显微镜观察凋亡小体的形成. 结果 C2C12细胞在肌分化诱导24h和48h，检测出凋亡现象;而对照组、肌分化诱导72h组均未检出凋亡现象. 结论在肌肉分化、发育的过程中，某些细胞会按自身程序主动死亡，以凋亡细胞的形式排除，而且具有明显的时间性，终末分化的肌管不易出现凋亡.Keywords:skeletal muscle;cell apoptosis;cell differentia-tionAbstract:AIM To investigate apoptosis in the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells.METHODS Murine C2C12myoblasts differential model was used in this experiment;the changes of cell cycle was tested by flow cy-tometry;genomic DNA was extracted for analysis by elec-trophoresis;in situ end-labeling（ISEL）and electron micro-scope were used to detect the apoptosis.RESULTS After C2C12cells from cultures were incubated for24or48hours in differentiation medium，apoptosis was detected;but no apoptosis was found in control group and C2C12cells from cultures incubated for72hours in differentiation me-dium.CONCLUSION During the differentiation and devel-opment of skeletal muscle，a fraction of cells might be lost through apoptosis automatically，andthis may be related to the time.Differentiated myotubes are possibly resistant to apotosis.0 引言细胞凋亡近年来已成为细胞生物学研究的新领域，它作为一种细胞生理性的死亡方式，在维护机体内环境稳定中起重要作用［1］ .凋亡现象的研究方法很多，形态上表现为细胞固缩、染色体凝集并向核膜靠拢，最终形成新月状小体;其生化学特征则是DNA在核酸电泳时呈梯级格局［2］ .凋亡概念的提出为研究胚胎发生、发展、个体形成、器官的细胞平衡增添了新的内容，指导医学实践.骨骼肌肌母细胞分化发育，首先必须退出细胞增殖周期，在多种因子的调节下，融合成具有多核的肌管结构［3］ .C2C12是小鼠骨骼肌肌母细胞，20mL L-1 胚牛血清的DMEM 培养基可诱导其分化［4］，且骨骼肌细胞分化过程中DNA的合成以及细胞周期发生明显变化［5］ .我们采用C2C12细胞模型，对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究，以阐述机体骨骼肌发生、发育中肌细胞的凋亡作用，从而为进一步研究骨骼肌损伤后再生的调控奠定基础.1 材料和方法1.1 材料 C2C12细胞（澳大利Proton教授惠赠），调整细胞密度至5×10 5 L-1 ，接种于100mL L-1 胚牛血清的DMEM（Hyclone）培养基中，在50mL L-1CO2 孵育箱培养（37℃）.培养至对数期细胞随机分为对照组和实验组，对照组为生长培养基GM（100mL L-1 胚牛血清的DMEM），实验组改变为分化培养基DM（20mL L -1 胚牛血清的DMEM），分别于24，48和72h换为分化培养基的进行实验.1.2 方法1.2.1 流式细胞仪对细胞的检测按文献［6］，分别取4组细胞试验，调整细胞数为1×10 6 mL-1 ，4℃PBS洗涤，700mL L-1 冷乙醇固定，上机前PBS洗涤细胞，加50μg mL-1 碘化丙啶，1mL L -1 Triton X-100，0.1mmol L -1 EDTA （Na）2 ，50μg mL-1 Rnase，4℃染色30min样品300目尼龙膜过滤，488nm氩激光激发，>610nm滤色片检测，对细胞进行分析.1.2.2 TUNEL法按原位细胞凋亡检测盒（德国宝灵曼）程序进行.常规细胞爬片，20μg mL-1 蛋白酶K消化30min，洗3遍，滴加TUNEL反应液，37℃，60min，振洗后加入convert-AP，37℃，60min，最后滴加底物显色液，10min终止反应，封片，光镜下分析.凋亡细胞的胞核呈现紫蓝色，未凋亡细胞的胞核不着色.1.2.3 电镜检测常规方法制作透射电镜标本，用TEM-200EX透射电镜观察.1.2.4 DNA的电泳分析细胞经2.5g L-1 胰酶消化，800min，离心5min收集细胞，48h漂浮细胞直接从培养液中离心收集.随之提取各组细胞基因组DNA做电泳分析，在50V，30mA下，用20g L-1 琼脂糖电泳2h，EB染色30min，紫外灯下观察、拍照记录.2 结果2.1 肌细胞分化过程中细胞周期 C2C12肌细胞分化培养基培养48h的细胞周期分析中，可见凋亡峰，在图中位于单倍体和二倍体峰之间（Fig1）.图1 略2.2 形态学观察和TUNEL法染色光镜下观察，C2C12肌细胞GM培养24h可见少量凋亡细胞，胞核呈紫蓝色，GM诱导48h凋亡细胞数量增多，存活细胞部分开始融合.对照组、GM诱导培养72h组均未见凋亡细胞，后者肌细胞融合形成的肌管增多，肌管内含多个胞核的分化现象（Fig2）.图2 －图3 略2.3 电镜观察 GM诱导培养24h和48h的C2C12肌细胞中，出现凋亡细胞，凋亡细胞核浆比例增大，核片段聚集成块堆聚在核膜周围（Fig3）.2.4 细胞基因组DNA的电泳分析肌细胞于分化培养基培养24h、细胞出现梯状DNA，尤以48h悬浮细胞显著（Fig4）.图4 略3 讨论迄今已发现许多因素都可诱导细胞凋亡，生化机制还不十分明确［6］ .一般认为程序化细胞死亡过程中核DNA的降解是由于一种Ca2+ ，Mg 2+ 依赖性内切酶活化引起的［7，8］ .多细胞有机体的发生、发育有赖于细胞增殖、分化和死亡的精密结合，即细胞周期的正常运行，细胞的增殖和凋亡的平衡.对肌肉细胞凋亡现象的研究将对揭示肌细胞恶变、老化、退变性肌病等的发病机制及其治疗有重要意义.FCM是检测细胞凋亡有效而灵敏的方法，为观察凋亡提供了新的手段［9］ ;凋亡细胞检测技术TUNEL法，是利用凋亡细胞生化特征的先进检测技术，具有很高的灵敏性.本实验中肌细胞分化的特定时期即肌母细胞在分化培养基培养24h和48h，TUNEL法染出了凋亡细胞，此外，DNA凝胶电泳分析出现反映核小体断裂的DNA梯状带.以上结果表明，在肌肉分化、发育的过程中，某些细胞会按自身程序主动死亡，以凋亡细胞的形式排除，这在肌肉组织重建有积极的意义.另外，凋亡的发生具有明显的时间性，分化早期（24h）检测出凋亡细胞数量较少，可能原因是此期间为特异性基因开放期，分子水平反映活跃，形态改变不太显著;分化后期（72h）不再发生凋亡，主要原因在于诱导72h后肌母细胞已经融合形成肌管，肌管是终末分化的肌细胞，不能再进入细胞分裂周期.不过，最近有的学者SV40大抗原引入肌管，终末分化的肌管重新进入细胞周期，出现减数分裂和凋亡，说明肌管仍具有凋亡发生的机制［10］ .细胞凋亡时伴有多种基因转录和蛋白质合成.c-myc是调控细胞增殖的主要基因，c-myc的表达产物是一种转录因子，与细胞增殖分化及癌变有密切关系.Evan 等［11］选用大鼠成纤维细胞Rat1/myc为实验模型研究发现，当有某些因素（低血清浓度，抑制细胞周期因子，抑癌基因）存在时c-myc基因的表达与细胞程序性死亡密切相关.本实验在诱导肌细胞分化时采用20mL L-1 血清的DMEM培养基，c-myc可能在细胞的凋亡方面起了很重要作用，c-myc的调节过程的机制仍很不清楚.总之，肌母细胞分化、发育的过程中出现凋亡现象可能为保证肌肉发育成熟所必须，为清除不再需要的肌细胞提供了一个有效机制，它的研究对于肌肉系统疾病认识将有很大帮助.参考文献［1］Miyashita T，Reed JC.bcl-2oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line ［J］.Blood，1993;8（1）:151-156.［2］Ueda N，Shah SV.Apoptosis ［J］.J Lab Clin Med，1994;124（2）:169-177.［3］Walsh K，Perlman H.Cell cycle exit upin myogenic differentia-tion ［J］.Curr Opin Genet Dev，1997;7（5）:597-602.［4］Qin RF，Gu XM，Zhang H.The affection of fetal bovine serum concentration on the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells in vitro ［J］.Shiyong Kouqiang Yixue Zazhi（J Pract Stomatol），2000;16（1）:14-16.［5］Qin RF，Gu XM，Huang FG，Zhang H.Analysis of cell cycle and DNA synthesis during myocytic differentiation by flow cy-tometry ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med U-niv），2000;21（8）:921-923.［6］Telford WG，King LE，Fraker parative evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associat-ed chromatin degradation by flow cytometry ［J］.Cytometry，1992;13（2）:137-142.［7］Surh CD，Sprent J.T-cell apoptosis detected in situ duringposi-tive and negative selection in the thymus ［J］.Nature，1994;372（6501）:100-103.［8］Zhivotovsky B，Wade D，Nicotera P.Role of nucleases in apop-tosis ［J］.Int Arch Allergy Immunol，1994;105（4）:333-338.［9］Telford WG，King LE，Pamela JF.Rapid quantitation of apop-tosis in pure and heterogeneous cell populations using flow cy-tometry ［J］.J Immunol Methods，1994;172（1）:1-16.［10］Endo T，Nadal GB.Reversal of myogenic terminal differentia-tion by SV40large T antigen results in mitosis and apoptosis ［J］.J Cell Sci，1998;111（pt8）:1081-1093.［11］Evan GI，Wyllie AH，Gilbert CS.Induction of apoptosis in fi-broblasts by c-myc protein ［J］.Cell，1992;69（1）:119-128.。

MyHC基因在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达

MyHC基因在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达林亚秋;张明;邬杨楠;李瑞文;郑玉才【摘要】以体外培养的C2C12成肌细胞为研究对象,然后利用荧光定量PCR检测肌球蛋白重链(myosin heavy chains,MyHC)的3种亚型MyHCl、MyHC2x和MyHC2b在成肌诱导分化中(0-8 d)中的时序表达规律.结果表明,MyHC1基因在诱导分化的0-4 d表达呈上升趋势,4-8 d又呈下降趋势,在第4d和第6d的表达水平显著高于其他天数(p＜0.05).MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达呈上升趋势,但在第8d又开始下降.MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势,第6d和第8d表达水平显著高于其他天数(p＜0.05).【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(040)003【总页数】4页(P350-353)【关键词】肌球蛋白重链基因;C2C12成肌细胞;时序表达【作者】林亚秋;张明;邬杨楠;李瑞文;郑玉才【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;成都市妇女儿童中心医院生殖与不孕研究所,成都610051;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041【正文语种】中文【中图分类】Q593+.3骨骼肌是机体的重要组成部分, 肌纤维是组成骨骼肌的基本单位, 由成肌细胞分化而来, 其特性直接决定肉的品质, 是动物养殖的重要经济性状. 肌纤维特性主要包括肌纤维的类型、直径、密度及肌纤维生长发育规律等. 其中肌纤维类型的多样性以及复杂的时空分布模式是肌肉功能差异的分子基础, 不同类型的肌纤维在收缩功能、线粒体成分和代谢特性等方面有很大差异[1], 进而导致肌肉之间品质的差别[2]. 研究表明, 肌肉中红肌纤维所占的比例越大, 白肌纤维所占比例越小, 肌肉的品质就越好[3-5]. 1994年, Scohiaffin和Reggiani确定了哺乳动物中与肌纤维类型相对应的肌球蛋白重链MyHC的类型, 即肌球蛋白重链的亚型MyHCI(MyHCslow)、MyHCIIa、MyHCIIx和MyHCIIb分别对应I型、IIa型、IIx型和IIb型肌纤维[6]. 目前肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MyHC)同功型被认为是决定肌纤维快、慢类型的主要决定因素[7], 是区分肌纤维类型和研究肌肉适应性的分子标志. 因此阐明MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达规律具有重要的意义. 本实验以C2C12成肌细胞为研究对象, 利用荧光定量PCR检测MyHC1、MyHC2x和MyHC2b基因在诱导分化的0-8 d成肌细胞中的表达规律, 研究结果为阐明动物肌肉生长及肉品质形成的分子机制提供重要的基本资料.1.1 实验材料和主要试剂实验所用C2C12成肌细胞系由本实验室保存.细胞培养基DMEM/F12、马血清购自Gibco公司; 胰蛋白酶(购自sigma公司), Trizol试剂、SYBR® Premix Ex Taq TM (2×)和pMD-19T载体购自大连TaKaRa公司; 反转录试剂盒和Taq DNA聚合酶购自Fermentas公司;其他均为国产分析纯.1.2 方法1.2.1 C2C12成肌细胞的培养从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存管, 快速放于37 ℃水浴中, 轻摇1 min使其溶解, 然后加入10倍冻存液体积的培养基, 1050 rpm离心4 min, 弃上清, 将细胞接种于含10 %FBS的高糖DMEM培养基中, 在37 ℃, 5 %CO2的培养箱中静臵培养. 待细胞将长至90 %以上的时候进行传代, 在37 ℃、5 %的CO2培养箱中培养24 h, 第2天换为含2 %马血清高糖DMEM培养基诱导分化, 继续培养用于后续研究.1.2.2 细胞总RNA提取与反转录分别收集诱导0、2、4、6、8 d的C2C12成肌细胞, 吸出培养皿中的培养液. 按照Trizol试剂盒说明书提供的方法提取细胞总RNA, 紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量, 然后-80 ℃保存备用.取1 μg总RNA按照反转录试剂盒说明书以Oligo (dT) 为引物合成cDNA第一链.1.2.3 荧光定量PCR根据小鼠MyHC1、2b、2x的mRNA基因序列(登录号分别为BC158018、AJ278733、DQ021871), 应用Primer Premier5.0软件, 设计MyHC1、MyHC2x和MyHC2b基因特异引物(表1), 送交上海生物工程股份有限公司合成. 利用荧光定量PCR检测MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在不同分化时期的C2C12细胞中的表达规律. 反应体系为20 μL: SYBR® Premix Ex Taq TM(2×)PCR 10 μL , 10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL, cDNA 1μL, 灭菌水8 μL. 反应条件为95 °C预变性1 min, 95 °C 30 s, 61 ℃/58 ℃ 30 s, 45个循环, 72 °C 延伸30 s. 荧光定量结果采用2-ΔΔCt方法进行分析[8].1.3 数据分析数据采用SPSS 13.0 软件进行分析, 所得数据用平均值±标准误( mean ± SE) 表示, 采用ANOVA进行显著性检验分析, 当P<0.05 时, 认为差异显著, 当P<0.01 时, 认为差异极显著.2.1 细胞总RNA的鉴定提取的细胞总RNA样品经紫外分光光度计测定, 其OD260/OD280值均在1.8-2.0之间, 表明细胞RNA无蛋白及酚污染. 且总RNA经1 %琼脂糖凝胶电泳显示RNA有28 S, 18 S, 5 S 3条主要区带, 说明样品中的RNA基本没有降解, 可用于后续分析.2.2 MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在C2C12细胞分化过程中的表达变化荧光定量PCR结果显示: MyHC1基因在0-4 d表达呈上升趋势, 在4-8 d又呈下降趋势, 但在第4 d和第6 d的表达水平显著高于其他天数(p<0.05)(图1).MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达是呈上升趋势, 但在第8 d又开始下降(图2).MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势, 第6 d和第8 d表达水平显著高于其他天数(p<0.05)(图3).肌纤维类型及其组成是肌肉生长和肉品质形成的生物学基础, 可直接影响肌肉色泽、嫩度和肌内脂肪含量, 因此备受动物育种工作者的广泛关注. 骨骼肌根据肌纤维的形态、功能和生理生化特性分为两类, 即Ⅰ型(红肌, 慢肌)和Ⅱ型(白肌, 快肌)肌纤维. Ⅰ型含有更多的线粒体和细胞色素, Ⅱ型细胞色素和肌红蛋白含量较少. 后来学者指出MyHC的亚型可决定肌纤维的类型, 是分子水平上的主要检测指标[9]. 本实验以2 %的马血清诱导C2C12细胞分化, 分别收集诱导0-8 d的细胞, 利用荧光定量PCR检测MyHC1、MyHC2x和MyHC2b的表达规律, 结果指出这些基因在分化过程中具有一定的表达规律, MyHC1基因在分化的前期表达呈上升趋势, 在分化后期表达水平开始下降, 在第4 d表达最高(p<0.05); MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达是呈上升趋势, 但在第8 d又开始下降,在第6 d表达水平最高. MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势, 在分化后期表达水平高. 这一实验结果与肌肉本身的生长发育特性、生理变化规律是基本相符的[10,11]. 这与杨晓静等[12]的研究结果相似, 3日龄猪MyHC1和MyHC2x的表达水平显著高于20日龄及以后猪的表达水平,MyHC2b在20日龄猪的表达水平显著高于3日龄猪的表达水平. 总之肌纤维类型的组成在动物生长发育的整个时期受各种外界因素的影响会发生肌纤维类型转化的现象[13-15], 对动物肉品质的形成具有很大的影响, 因此研究肌纤维类型的转化及其调控机制将是一个十分有价值的课题.【相关文献】[1] BERCHTOLD M W, BRINKMEIER H, MUNTENER M. Calcium ion in skeletal muscle: its crucial role for muscle function, plasticity, and disease[J].Physiol Rev, 2000, 80:1215-1265.[2] PICARD B, JURIE C, DURIS M P, et al. Consequences of selection for higher growth rate on muscle fibre development in cattle[J]. Livest Sci, 2006, 102: 107-120.[3] LEFAUCHEUR L, MILAN D, ECOLAN P, et al. Myosin heavy chain composition of different skeletal muscles in Large White and Meishan pigs[J]. J Anim Sci, 2004, 82(7): 1931-1941.[4] MALTIN C A,SINCLAIR K D,WARRISS P D,et al. The effects of age at slaughter,genotype and finishing system on the biochemical properties,muscle fibre type characterist-ics and eating quality of bull beef from suckled calves[J]. Anim Sci,1998,66:341-348.[5] LARZUL C,LEFAUCHEUR L,ECOLAN P,et al.Phenotypic and genetic parameters for longiss im usmuscle fiber characteristics in relation to growth,carcass,and meatquality traits in Large White pigs[J]. Journal of Animal Science,1997,75:3126-3137.[6] SCHIAFFINO S, REGGIANI C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle[J]. J Appl Physiol, 1994, 77(2):493-501.[7] TONIOLO L, MACCATROZZO L, PATRUNO M, et al. Fiber types in canine muscles: myosin isoform expression and functional characterization[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2007, 292(5):C1915-26[8] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR an d the 2−△△Ctmethod[J]. Methods, 2001, 25: 402-408.[9] ZHAO R Q, YANG X J, XU Q F, et al.Expression of GHR and PGC-alpha in association with changes of MyHC isoform types in longissimus muscle of Erhualian and Large White pigs (SUS scrofa) during posmatal growth [J].Animal Science,2004, 79: 203-211．[10] ANDERS H K, RONALD E K, XAVIER F.Skeletal muscle fibres as factors forpork quality [J].Livestock Production Science, 1999, 60(l): 255-269.[11] IMMONEN K, RUUSUNEN M, HISSA K, et al. Bovine muscle glycogen concentration in relation to finishing diet, slaughter and ultimate pH [J]. Meat Sci, 2000, 55: 25-31. [12] 杨晓静, 赵茹茜, 陈杰, 等. 猪背最长肌肌纤维类型的发育性变化及其品种和性别特点[J].中国兽医学报, 2005, 25(1): 89-94.[13] MALTIN C A, WARKUP C C, MATTEWA等 K： R川, 西et 獐al牙. P菜ig 多m糖usc的le提 fi取bre及 c含ha量rac测ter定istics as source of variation in eating quality[J]. Meat Sci,1997,47:237-248.[14] YUAN Y, SHI X E, LIU Y G, et al. FoxO1 regulates muscle fiber-type specification and inhibits calcineurin signaling during C2C12[15] VENHOFF N, LEBRECHT D, PFEIFER D, et al. Muscle-fiber transdifferentiation in an experimental model of respiratory chain myopathy[J]. Arthritis Res Ther, 2012, 29, 14(5): R233. myoblast differentiation[J]. Mol Cell Biochem, 2011, 34 8(1-2) :77-87.。

C2C12成肌细胞体外诱导分化为肌管的实验

复杂，许多因素都可能起影响，研究设计要尽量标准化。
关键词：成肌细胞；肌细胞；肌管；定向分化；基因表达
中图分类号：Ｑ８１
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７２－３５５４（２００８）０１－００１０－０６
ＩｎＶｉｔｒｏＩｎｄｕｃｅｍｅｎｔｏｆＣ２Ｃ１２ＭｙｏｂｌａｓｔｓｉｎｔｏＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＭｙｏｔｕｂｅｓ
渐增强（未刺激时分别约为４９．６％ ±１．１％、２３．４％ ±１．１％、４．８％ ±１．６％和２．６％ ±１．５％；第６天时分别提高为
８０．４％ ±１．８％、８５．４％ ±１．１％、２２．２％ ±１．１％和２６．０％ ±１．６％；Ｐ＜０．００１）；ｄｅｓｍｉｎ、ＭｙｏＤ和ｍｙｏｇｅｎｉｎ相应的
ＣＨＥＮＹｏｎｇ－ｌｅ１，ＺＨＯＵＧｕａｎｇ－ｑｉａｎ２，ＤＥＮＧＹｕ－ｂｉｎ１，ＺＨＩＷｅｉ２，ＸＩＥＨｕｉ－ｑｉ２，ＤＥＮＧＬｉ２，ＹＡＮＧＺｈｉ－ｍｉｎｇ２，ＷＡＮＧＹａ－ｚｈｕ１
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＳＵＮＹａｔ－ｓｅｎＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，ＳＵＮＹａｔ－ｓｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００８９，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｔｅｍＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｕａｘｉＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】ＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔｏｆＣ２Ｃ１２ｍｙｏｂｌａｓｔｓｉｎｔｏｍａｔｕｒｅｍｙｏｃｙｔｅｓａｎｄｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｍｙｏｔｕｂｅｓ，ｅｘｐｌｏｒｉｎｇａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｍｍｉｔｔｅｄｍｙｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】ＴｈｅＣ２Ｃ１２ｍｙｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＤＭＥＭｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍ，ｔｈｅｎｈａｒｖｅｓｔｅｄａｎｄｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｐｈａｓｅｃｏｎｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｆｏｒｔｈｅａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒａｐｐｅａｒａｎｃｅ，ａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｆｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｏｆｍｕｓｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｓｂｙｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＲＴ－ＰＣＲａｓｓａｙｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】（１）Ｂｏｔｈ２０ｍＬ／Ｌａｎｄ５０ｍＬ／ＬｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｃａｐａｂｌｅｏｆｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｍｙｏｔｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＣ２Ｃ１２ｍｙｏｂｌａｓｔｓ，ｏｆｗｈｉｃｈｔｈｅ２０ｍＬ／Ｌｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｒｉｎｄｕｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔ（ｏｎｄａｙ７，ｔｈｅｒａｔｉｏｓｏｆｍｙｏｔｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｂｏｔｈｇｒｏｕｐｓａｒｅ３１．４％ ±２．１％ａｎｄ１９．０％ ±１．６％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，Ｐ＜０．０００１）．（２）Ｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈ２０ｍＬ／Ｌｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍｆｏｒ３－４ｄａｙｓ，ｍｙｏｔｕｂｅｓｓｔａｒｔｅｄｔｏｆｏｒｍ．Ｌａｔｅｒｏｎ，ｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅｍｙｏｔｕｂｅｓａｐｐｅａｒ，ａｎｄａｔｔｈｅｐｅａｋｏｎ８－９ｄａｙｓ（ｄａｙ９，ｔｈｅｍｙｏｔｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｉｏｗａｓ４０．２％ ±１．３％）．Ａｆｔｅｒｔｈａｔ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｇｒａｄｕａｌｌｙｇｏｔｓｅｎｉｌｅａｎｄｅｎｄｉｎ

达格列净促进小鼠骨骼肌细胞系C2C12分化的作用及机制的研究

论著㊃基础研究 d o i :10.3969/j.i s s n .1671-8348.2021.21.004网络首发 h t t ps ://k n s .c n k i .n e t /k c m s /d e t a i l /50.1097.r .20210918.0837.014.h t m l (2021-09-22)达格列净促进小鼠骨骼肌细胞系C 2C 12分化的作用及机制的研究*何廉旗1,任智超1,徐丹2,张翠丽3,宋占春1ә(1.辽宁省抚顺市中心医院心血管内科 113006;2.辽宁省抚顺市中心医院科教部 113006;3.大连医科大学基础医学院,辽宁大连116044) [摘要] 目的探讨达格列净(D A P A )在促进骨骼肌细胞分化中的作用及机制㊂方法将小鼠成肌细胞系C 2C 12分为未分化组以及分化组(D A P A 0㊁5㊁10㊁50μm o l /L )㊂使用含2%马血清分化培养基诱导C 2C 12细胞分化,观察肌管形成情况,计算细胞分化指数,测定肌酸激酶(C K )活性㊂采用实时荧光定量聚合酶链反应检测生肌决定因子1(M y o D )㊁生肌素(M y o g e n i n )㊁肌球蛋白重链(M y H C )㊁腺苷酸活化蛋白激酶(AM P K )及p -AM P K m R N A 表达水平,W e s t e r n b l o t 检测M y o D ㊁M y o g e n i n ㊁M yH C ㊁AM P K 及p -AM P K 蛋白表达水平㊂结果随D A P A 浓度增加,C 2C 12细胞分化指数明显增加,C K 活性也明显增加;但D A P A 50μm o l /L 组C 2C 12细胞分化指数㊁C K 活性与D A P A 10μm o l /L 组比较,差异均无统计学意义(P >0.05);C 2C 12细胞分化过程中D A P A (10μm o l /L )使M y o D ㊁M y o g e n i n ㊁M yH C 在m R N A 和蛋白水平表达均明显上调,差异均有统计学意义(P <0.05)㊂D A P A 促进C 2C 12细胞AM P K 磷酸化,而AM P K 抑制剂 C o m po u n d C 可阻断D A P A 对C 2C 12细胞的促分化作用㊂结论 D A P A 可通过激活C 2C 12细胞AM P K 活性,促进细胞分化㊂[关键词] 达格列净;骨骼肌细胞;分化;代谢综合征[中图法分类号] Q 291[文献标识码] A[文章编号] 1671-8348(2021)21-3617-05S t u d y o n e f f e c t a n d m e c h a n i s m o f d a p a g l i f l o z i n i n p r o m i t n g di f f e r e n t i a t i o n o f m o u s e s k e l e t a l m u s c l e c e l l l i n e C 2C 12*H E L i a n qi 1,R E N Z h i c h a o 1,X U D a n 2,Z HA N G C u i l i 3,S O N G Z h a n c h u n 1ә(1.D e p a r t m e n t o f C a r d i o v a s c u l a r M e d i c i n e ,F u s h u n M u n i c i p a l C e n t r a l H o s p i t a l ,F u s h u n ,L i a o n i n g 113006,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f S c i e n c e a n d E d u c a t i o n ,F u s h u n M u n i c i pa l C e n t r a l H o s p i t a l ,F u s h u n ,L i a o n i n g 113006,C h i n a ;3.B a s i c M e d i c a l S c h o o l ,D a l i a n M e d i c a l U n i v e r s i t y ,D a l i a n ,L i a o n i n g 116044,C h i n a ) [A b s t r a c t ] O b je c t i v e T o e x p l o r e t h e r o l e a n d m e c h a n i s m of d a p ag l i f l o z i n (D A P A )i n p r o m o t i n g th e di f f e r e n t i a t i o n o f s k e l e t a l m u s c l e c e l l s .M e t h o d s T h e m o u s e m yo b l a s t c e l l l i n e C 2C 12w a s d i v i d e d i n t o 5g r o u p s :u n d i f f e r e n t i a t e d g r o u p a n d d i f f e r e n t i a t e d g r o u ps (D A P A 0,5,10,50μm o l /L ).T h e d i f f e r e n t i a t i o n m e -d i u m c o n t a i n i n g 2%h o r s e s e r u m w a s u s e d t o i n d u c e t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f C 2C 12c e l l s .T h e f o r m a t i o n o f m yo -t u b e s w a s o b s e r v e d ,t h e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n d e x w a s c a l c u l a t e d ,a n d t h e C K a c t i v i t y wa s m e a s u r e d .T h e r e a l -t i m e f l u o r e s c e n t q u a n t i t a t i v e P C R w a s u s e d t o d e t e c t m y o g e n i c d e t e r m i n a t i o n f a c t o r 1(M y o D ),m y o ge n i n ,m y o s i n h e a v y c h a i n (M y H C ),a n d a d e n y l a t e -a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e (AM P K )a n d p -AM P K m R N A e x pr e s -s i o n l e v e l s ;t h e W e s t e r n b l o t w a s u s e d t o d e t e c t t h e p r o t e i n e x p r e s s i o n l e v e l s o f M y o D ,M y o g e n i n ,M yH C ,AM P K a n d p -AM P K.R e s u l t s W i t h t h e i n c r e a s e o f D A P A c o n c e n t r a t i o n ,t h e C 2C 12c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n d e xa n d C K a c t i v i t y w e r e i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ;h o w e v e r ,c o m p a r e d w i t h t h e D A P A 10μm o l /L g r o u p,t h e d i f f e r -e n c e i n t h e C 2C 12c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n d e x a n d C K a c t i v i t y o f t h e D A P A 50μm o l /L g r o u p h a d n o s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05);D A P A (10μm o l /L )s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d t h e e x p r e s s i o n o f M y o D ,M y o ge -n i n a n d M y H C a t t h e m R N A l e v e l a n d p r o t e i n l e v e l d u r i n g th e d i f f e r e n t i a t i o n o f C 2C 12c e l l s ,a n d t h e d i f f e r -e n c e w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t (P <0.05).D A P A p r o m o t e d t h e p h o s p h o r yl a t i o n o f AM P K i n C 2C 12c e l l s ,w h i l e t h e AM P K i n h i b i t o r C o m p o u n d C c o u l d b l o c k t h e d i f f e r e n t i a t i o n -p r o m o t i n g ef f e c t o f D A P A o n C 2C 127163重庆医学2021年11月第50卷第21期*基金项目:辽宁省自然科学基金博士启动基金项目(2020-B S -284)㊂作者简介:何廉旗(1984-),主治医师,博士,主要从事代谢性心血管病的研究㊂ ә 通信作者,E -m a i l :s z c c l s z c c l @163.c o m ㊂Copyright©博看网 . All Rights Reserved.c e l l s.C o n c l u s i o n D A P A c a n p r o m o t e t h e c e l ld i f fe r e n t i a t i o n b y a c t i v a t i n g t h e AM P K a c t i v i t y of C2C12c e l l s.[K e y w o r d s]d a p a g l i f l o z i n;s k e l e t a l m u s c l e c e l l s;d i f f e r e n t i a t i o n;m e t a b o l i c s y n d r o m e糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病㊂而骨骼肌占人体重量的40%,是人体最大的代谢器官,因此,骨骼肌功能完整对维持机体代谢稳态至关重要[1]㊂骨骼肌的肌纤维表面的卫星细胞是一种干细胞,当骨骼肌受到损伤(包括运动导致的牵拉伤㊁物理创伤㊁化学损伤等)时,静止的卫星细胞被激活,进行增殖㊁分化㊁融合,最终生长为成熟肌纤维,完成对受损骨骼肌的修复[2]㊂有研究表明,糖尿病患者骨骼肌卫星细胞分化能力明显降低,导致骨骼肌再生能力下降[3-4]㊂新型口服降糖药达格列净(d a p a g l i f l o z i n, D A P A)通过抑制钠-葡萄糖共转运蛋白2活性,促进尿糖排泄,降低血糖水平[5]㊂有研究表明,D A P A对腺苷酸活化蛋白激酶(a d e n y l a t e-a c t i v a t e d p r o t e i n k i-n a s e,AM P K)具有激活作用[6-7]㊂而AM P K是骨骼肌细胞分化的重要的调控因子,可通过激活一系列下游分子促进骨骼肌细胞分化[8-9]㊂尽管如此,D A P A 在骨骼肌细胞分化中的作用尚少见相关文献报道㊂本研究采用小鼠成肌细胞系C2C12细胞作为研究对象,拟明确D A P A在C2C12细胞分化中的作用,并初步阐明其分子机制㊂1材料与方法1.1材料小鼠成肌细胞系C2C12细胞购自美国A T C C公司,D A P A购自美国M C E公司,胎牛血清及马血清均购自美国G i b c o公司,AM P K抑制剂C o m p o u n d C (C C)㊁小鼠抗生肌素(m y o g e n i n)抗体(a b1835)及小鼠抗肌球蛋白重链(m y o s i n h e a v y c h a i n,M y H C)抗体(a b51263)均购自美国A b c a m公司,肌酸激酶(c r e a-t i n e k i n a s e,C K)活性测定试剂盒及小鼠抗β-t u b u l i n (S A B4200732)抗体均购自美国S i g m a公司,小鼠抗生肌决定因子1(m y o g e n i c d e t e r m i n a t i o n f a c t o r1, M y o D)抗体(s c_32758)购自美国S a n t a C r u z公司,兔抗AM P Kα抗体(2532s)及兔抗p-AM P K抗体(2537s)均购自美国C S T公司㊂1.2方法1.2.1细胞培养将C2C12细胞接种于100mm培养皿中,使用含10%胎牛血清杜氏改良E a g l e培养基(D u l b e c c o's m o d i f i e d E a g l e m e d i u m,D M E M)培养基(生长培养基),于37ħ㊁含5%C O2培养箱中进行培养,待细胞密度达到80%~90%融合时按1ʒ3进行细胞传代㊂传代细胞仍按上述培养条件继续培养,以备后续实验使用㊂1.2.2细胞分化体系的建立及形态学观察在生长培养基中待C2C12细胞融合至80%左右时将培养基更换为含2%马血清的D M E M培养基(分化培养基)继续培养,每隔1d换液1次,诱导分化7 d,使用相差显微镜观察分化后肌管形态并采集图像,计算细胞分化指数(融合2个或2个以上细胞核的细胞的百分比)㊂药物干预即在基础培养基基础上加入不同浓度D A P A(终浓度为0㊁5㊁10㊁50μm o l/L)及C C(终浓度为10μm o l/L)㊂1.2.3 C K活性测定使用细胞刮分别从培养皿刮下1.2.2项各组细胞㊂采用适量冰缓冲液(50mm o l/L磷酸钾)对细胞进行匀浆处理,4ħ㊁10000g离心15m i n,留取沉淀待测㊂按照C K测定试剂盒说明书于96孔板中单孔加入10μL标本及100μL反应试剂体系(缓冲液100μL,底物溶液10μL,酶混合物1μL),轻敲,混匀㊂37ħ孵育20m i n,340n m波长检测吸光度(A340)i n i t i a l㊂37ħ继续孵育20m i n,340n m波长检测吸光度(A340)f i n a l㊂按照公式计算C K活性:C K活性(u n i s t/L)=(A340)f i n a l-(A340)i n i t i a l(A340)-(A340)㊂1.2.4 W e s t e r n b l o t检测蛋白表达水平收集1.2.2项各组细胞,加入蛋白裂解液于冰上放置30m i n,4ħ㊁10000g离心10m i n,上清液为细胞总蛋白㊂采用蛋白定量(B C A)法测定蛋白浓度㊂50μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺电泳㊂湿转法转膜后于5%脱脂牛奶中封闭1h㊂加入一抗(稀释比均为1ʒ1000),4ħ封闭过夜㊂次日,二抗(稀释比均为1ʒ5000)孵育45m i n后进行电化学发光(E C L)显色㊂采用I m a g e J1.51软件对W e s t e r nb l o t带进行灰度分析㊂1.2.5实时荧光定量聚合酶链反应(p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n,P C R)收集1.2.2项各组细胞,使用北京普洛麦格公司R N A提取试剂盒提取细胞总R N A,并测定其浓度及纯度㊂使用日本T A K A R A公司逆转录试剂盒获取细胞c D N A㊂从N C B I网站下载小鼠M y o D㊁M y o g e-n i n㊁M y H C及G A P D H基因D N A及m R N A序列㊂采用p r i m e r3.0软件设计引物,M y o D-正向:C A A-G A C C A C C A A C G C T G A T C,M y o D-反向:C A G A C-C T T C G A T G T A G C G G A;M y o g e n i n-正向:A T C T G-C A C T C C C T T A C G T C C,M y o g e n i n-反向:G A C A G C-C C C A C T T A A A A G C C;M y H C-正向:A G C T T-G A A A A C G A G G T G G A A,M y H C-反向:C C T C C T-C A G C C T G T C T C T T G;G A P D H-正向:A G T-G T T T C C T C G T C C C G T A G,G A P D H-反向:G C C G T-8163重庆医学2021年11月第50卷第21期Copyright©博看网 . All Rights Reserved.G A G T G G A G T C A T A C T ㊂采用实时荧光定量法测定上述基因循环数(c yc l e t h r e s h o ld ,C t )值,反应条件:95ħ30s ,95ħ5s ,60ħ31s ,共40个循环㊂通过2-ΔΔC T 计算m R N A 相对表达水平㊂1.3 统计学处理采用S P S S 20.0统计软件进行数据分析,计量资料采用x ʃs 表示,组间比较采用独立样本t 检验㊂以P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结果2.1 D A P A 促进C 2C 12细胞分化D A P A 以浓度依赖方式促进C 2C 12细胞分化,同时,细胞C K 活性增加,见图1㊂D A P A 50μm o l /L 组C 2C 12细胞分化指数㊁C K 活性与D A P A 10μm o l /L 组比较,差异均无统计学意义(P >0.05),故选用D A P A 浓度为10μm o l /L 进行后续实验㊂2.2 D A P A 在m R N A 水平及蛋白水平上调C 2C 12细胞M y o D ㊁M y o g e n i n ㊁M yH C 的表达D A P A 上调C 2C 12细胞M y o D ㊁M y o g e n i n ㊁M y -H C 的表达,差异均有统计学意义(P <0.05),见图2㊂2.3 D A P A 通过上调AM P K 磷酸化水平促进C 2C 12细胞分化㊂与D A P A 组细胞分化程度比较,D A P A+C C 组分化明显减低,差异有统计学意义(P <0.01),见图3A ㊁B ㊂与对照组比较,D A P A 组AM P K 磷酸化水平明显增加,差异有统计学意义(P <0.05);D A P A+C C 组AM P K 磷酸化水平及M yH C 表达水平均明显低于D A P A 组,差异均有统计学意义(P <0.05),见图3C ㊁D㊂A :相差显微镜观察细胞形态(比例尺=20μm );B :分化指数柱状图;C :C K 活性测定;a:P <0.05,与D A P A 0μm o l /L 组比较㊂图1 D A P A 促进C 2C 12细胞分化A :实时荧光定量P C R 分析m R N A 表达水平,以G A P D H 为内参;B :W e s t e r n b l o t 分析蛋白表达水平;C :灰度分析柱状图;对照组:未给予D A P A 分化7d 的C 2C 12细胞㊂图2 D A P A 使C 2C 12细胞M y o D ㊁肌管细胞㊁M yH C 表达水平上调9163重庆医学2021年11月第50卷第21期Copyright©博看网 . All Rights Reserved.A:相差显微镜观察细胞形态(比例尺=20μm);B:分化指数柱状图;C:W e s t e r n b l o t分析蛋白表达水平;D:灰度分析柱状图;对照组:未给予D A P A分化7d的C2C12细胞㊂图3 D A P A通过增加AM P K磷酸化水平促进C2C12细胞分化3讨论随着生活方式的改变,肥胖及其相关代谢综合征的发生日趋普遍㊂骨骼肌是全身最大的代谢器官,对维持机体代谢稳态发挥着重要作用㊂骨骼肌再生是保护骨骼肌结构及功能完整的关键㊂骨骼肌再生分为4个阶段,包括卫星细胞增殖㊁分化㊁融合及生长㊂有研究表明,肥胖导致骨骼肌细胞分化障碍[10]㊂而在诸多调控卫星细胞分化的转录因子及信号分子中生肌调控因子(包括生肌因子5㊁M y o D㊁M y o g e n i n和生肌调节因子4)最为重要[11]㊂首先,生肌因子5在卫星细胞分化初始阶段表达持续增加,随之激活其他生肌调控因子㊂随着M y o D高表达,卫星细胞正式进入分化阶段㊂M y o D㊁M y o g e n i n相互交叉激活,与启动子或增强子区域的E-b o x元件结合,诱导一系列生肌相关基因的表达㊂有研究发现,下调M y o D或M y o-g e n i n会直接抑制骨骼肌细胞分化[12]㊂因此,M y o D㊁M y o g e n i n在调节骨骼肌细胞分化中至关重要㊂新型口服降糖药D A P A因具有独立于降糖作用以外的诸多优势备受关注㊂有研究表明,D A P A具有明显抗炎作用,对诸多脏器具有保护作用,如心脏㊁肝脏㊁肾脏及脑[13-16]㊂本研究采用D A P A作用于C2C12细胞,诱导分化,通过相差显微镜观察发现,D A P A可促进C2C12细胞分化㊂同时,D A P A使C2C12细胞中生肌调控因子M y o D㊁M y o g e n i n及卫星细胞分化标志物M y H C表达增加,肌管特异性标志物C K活性增加㊂有研究表明,肥胖抑制AM P K磷酸化,导致骨骼肌再生障碍[17]㊂而AM P K磷酸化是骨骼肌细胞分化的重要调控因子[18-19]㊂有研究表明,D A P A在许多组织中可促进AM P K磷酸化[7,20-21]㊂本研究结果显示, D A P A作用于C2C12细胞后AM P K磷酸化明显增加㊂而在加入C C干预后通过相差显微镜观察发现, D A P A促进C2C12细胞分化的作用消失,M y H C表达明显减低,说明D A P A通过增加AM P K磷酸化促进C2C12细胞分化㊂综上所述,D A P A在小鼠成肌细胞系C2C12细胞中促进AM P K磷酸化,进而促进C2C12细胞分化㊂尽管如此,但D A P A在小鼠骨骼肌再生中的作用仍需进一步探究㊂本研究证实了D A P A在骨骼肌损伤后再生中可能存在潜在的价值,为临床肌病的治疗提供了新的思路㊂参考文献[1]M I K O L A S E V I C I,P A V I C T,K A N I Z A J T F,e t a l.N o n a l c o h o l i cf a t t y l i v e r d i s e a s e a n d s a r-c o p e n i a:w h e r ed o we s t a n d?[J].C a n J G a s t r o-e n t e r o l H e p a t o l,2020,2020:8859719.[2]B A G H D A D I M B,T A J B A K H S H S.R e g u l a t i o na n d p h y l o g e n y o f s k e l e t a l m u s c l e r e g e n e r a t i o n[J].D e v B i o l,2018,433(2):200-209. [3]F U J I M A K I S,K UW A B A R A T.D i a b e t e s-i n d u c e d0263重庆医学2021年11月第50卷第21期Copyright©博看网 . All Rights Reserved.d y s f u n c t i o n o f m i t o c h o n d r i a a n d s te m c e l l s i ns k e l e t a l m u s c l e a n d t h e n e r v o u s s y s t e m[J].I n t J M o l S c i,2017,18(10):2147.[4]N G U Y E N M H,C H E N G M,K OH T J.I m-p a i r e d m u s c l e r e g e n e r a t i o n i n o b/o b a n d d b/d bm i c e[J].S c i W o r l d J,2011,11:1525-1535.[5]L U O M,K O N G X,WA N G H,e t a l.E f f e c t o fD a p a g l i f l o z i n o n g l y c e m i c v a r i a b i l i t y i n p a t i e n t sw i t h t y p e2d i a b e t e s u n d e r i n s u l i n g l a r g i n ec o m b i n ed w i t h o t he r o r a l h y p o g l y c e m i c d r u g s[J].J D i a b e t e s R e s,2020,2020:6666403.[6]C H A N G Y K,C HO I H,J E O N G J Y,e t a l.D a p a g l i f l o z i n,S G L T2i n h i b i t o r,a t t e n u a t e s r e n a l i s c h e m i a-r e p e r f u s i o n i n j u r y[J].P L o S O n e,2016,11(7):e0158810.[7]Z HO U J,Z HU J,Y U S J,e t a l.S o d i u m-g l u c o s ec o-t r a n s p o r t e r-2(S G L T-2)i n h i b i t i o n r ed u ce s g l u c o s e u p t a k e t o i n d u c e b r e a s t c a n c e r c e l l g r o w t h a r r e s t t h r o u g h AM P K/m T O R p a t h w a y[J].B i o m e d P h a r m a c o t h e r,2020,132:110821.[8]S A K U S H I M A K,Y O S H I K A W A M,O S A K I T,e ta l.M o d e r a t e h y p o x i a p r o m o t e s s k e l e t a l m u s c l e c e l l g r o w t h a n d h y p e r t r o p h y i n C2C12c e l l s[J].B i o c h e m B i o p h y s R e sC o mm u n,2020,525(4): 921-927.[9]MA J,M E N G X,K A N G S Y,e t a l.R e g u l a t o r ye f f e c t s o f t h e f r u i t e x t r a c t o f L y c i u m c h i n e n s e a n d i t s a c t i v e c o m p o u n d,b e t a i n e,o n m u s c l e d i f-f e r e n t i a t i o n a n d m i t o c h o n d r i a l b i o g e n e s i s i n C2C12c e l l s[J].B i o m e d P h a r m a c o t h e r,2019, 118:109297.[10]G H A N I M H,D H I N D S A S,B A T R A M,e t a l.E f f e c t o f t e s t o s t e r o n e o nFG F2,MR F4a n d m y-o s t a t i n i n h y p o g o n a d o t r o p i c h y p o g o n a d i s m:r e l-e v a n c e t o m u s c l e g r o w t h[J].J C l i n E n d o c r i n o lM e t a b,2019,104(6):2094-2102. 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猪MEF2C基因慢病毒表达载体构建及C2C12细胞转染条件的优化

猪MEF2C基因慢病毒表达载体构建及C2C12细胞转染条件的优化朱弘焱;杨卉新;田玉民;苏玉虹【摘要】MEF2C基因能够控制肌细胞分化过程中的基因转录,特别在骨骼肌、心肌和平滑肌中介导细胞的分化。

本研究将猪 MEF2C 基因化学合成后经 Bam HI 和Asc I 双酶切后克隆到慢病毒表达载体 pLen-ti6.3_MCS_IRES2-EGFP中，获得的重组质粒用限制性内切酶酶切分析和测序鉴定；利用慢病毒阴性对照侵染靶细胞C2C12来确定最佳MOI值以及靶细胞最适抗生素Blasticidin剂量。

结果显示猪MEF2C基因成功克隆到慢病毒表达载体中；该重组质粒侵染靶细胞C2C12的最佳MOI值为300；靶细胞抗生素的筛选剂量为4μg/mL，维持剂量为3μg/mL上述试验为建立MEF2C稳定过表达细胞系提供了前期工作基础。

%MEF2C gene can control the genetic transcription during the differentiation of myo-cyte, especially can mediate cell differentiation in skeletal, cardiac and smooth muscle. The che-mosynthesized MEF2C gene was digested with the double restriction enzymes Bam HI and Asc I. The ob-tained MEF2C gene was inserted into the lentiviral expression vector pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP. The recombinant plasmid was identified by restriction enzymes digestion analysis and DNA sequencing. We used a negative control of the lentivirus to infect the target C2C12 cells in order to deter-mine the best MOI value and the optimal dose of antibiotics of the target cells. The results showed that the MEF2C gene expression vector was constructed successfully. The optimal MOI value of target cells was 300. The Blasticidin screening doseof target cells was 4 μg/mL and the sus-taining dose was 3 μg/mL.Theabove-mentioned researches provided a foundation for the further study to establish stable overexpressed cell lines.【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】4页(P1-4)【关键词】猪;MEF2C基因;慢病毒表达载体;C2C12细胞【作者】朱弘焱;杨卉新;田玉民;苏玉虹【作者单位】辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州 121001;南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095;辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州 121001;辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州 121001【正文语种】中文【中图分类】S858.91肌细胞增强因子MEF2（myocyte speci fic-enhancer factor 2），属于MADS 框转录因子家族，是肌肉特异基因激活的重要转录因子，在肌肉发生过程中起着非常重要的调节作用。