第六章蛋白质的测定
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一、凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、 自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。用凯氏定 氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。
N = N×6.25 = 蛋白质含量
16%
乳制品K=6.38（N=15.7%） 小麦粉K=5.79（N=17.6%） 动物胶K=5.6（N=18.0%） 冰蛋K=6.7（N=14.8%） 大豆制品K=6.0（N=16.7%）
第六章蛋白质的测定
（2）碱化蒸馏 向接收瓶内加入10mL2%硼酸及2滴混合指示剂并使冷
凝管下端插入液面下。 吸取10.0mL样品消化稀释液注入凯氏定氮仪的反应室
中，用10mL蒸馏水冲洗进样入口，再加10mL50% 氢氧化钠溶液，通入蒸汽开始蒸馏，并通过冷凝管 而进入接收瓶内，以第一滴馏液滴下开始计时，蒸 馏5min，取下接收瓶。停止蒸馏。
第六章蛋白质的测定
一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性 食品。例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉 9.5%，兔肉 21%，鸡肉 20%， 牛乳 3.5%， 带鱼 18.0%， 大豆 40%，面粉 9.9%，菠菜 2.4%， 黄瓜 1.0%，苹果 1.4%
测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营 养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、 优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具 有极其重要的意义。
第六章蛋白质的测定
❖ 但是硫酸钾浓度不可以太高，否则温度太高，生成 的硫酸氢铵会分解放出氨，造成氨的损失。 K2SO4和H2SO4的添加比例是：
1g样品中 K2SO4 : H2SO4=7g : 12mL
第六章蛋白质的测定
<2> 加硫酸铜 作为催化剂，还可以做蒸馏时碱性指 示剂。
受热
CuSO4 → Cu2SO4+SO2↑+O2↑ C+ CuSO4 →Cu2SO4+SO2↑+CO2↑ H2SO4 + Cu2SO4 →CuSO4+SO2↑+2H2O↑
第六章 蛋白质和氨基酸的测定
第六章蛋白质的测定
第一节 概述
1. 蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。
主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白 质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。
蛋白质是生命的物质基础，人体11%-13%总热 量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只 是含量及类型不同。蛋白质是食品的最重要质量指 标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味 及其营养。
第六章蛋白质的测定
原理
（1） 消化总反应式 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4 (NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%）
第六章蛋白质的测定
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点， Gunning将消化方法改进，在消化时加入K2SO4使沸 点上升，这样加快分解速度，温度由原来硫酸沸点的 330上升到400℃，提高了67℃，所以速度也就加快了。 随着消化反应过程，水份逸出，硫酸钾浓度增大，使 沸点增加。加速了有机的分解。也可加入硫酸钠，氯 化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。
蛋白质%=总氮%×K K-换称等数： 乳制品K=6.38（N=15.7%） 小麦粉K=5.79（N=17.6%） 动物胶K=5.6（N=18.0%） 冰蛋K=6.7（N=14.8%） 大豆制品K=6.0（16.7%） K=6.25（N=16%）
第六章蛋白质的测定
实验步骤
（3）滴定 用微量酸式滴定管，以0.05mol/L盐酸标准
溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色 为终点。 （4 ）空白试验 同时取10.0mL空白消化稀释液同上操作。
第六章蛋白质的测定
实验步骤
（5）计算 总氮量%= [N(V2-V1)×0.014]/ W × 100 0.014----氮的毫克当量数
<3>氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化 钛。
<4> 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧 化速度。
第六章蛋白质的测定
消化装置
第六章蛋白质的测定
Biblioteka Baidu理
（2）蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。 (NH4)2SO4+NaOH→NH3↑+Na2SO4+H2O
第六章蛋白质的测定
原理
（3）吸收与滴定
用2%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定.
2NH3 + 4H3BO3→ (NH4)2B4O7 + 5H2O
(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4H3BO4
指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合 指示剂）
指示剂 红色
绿色
红色
（酸） 吸收 （碱） 滴定 （酸）
第六章蛋白质的测定
1、原理 整个过程分三步：消化, 蒸馏和吸收, 滴定 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质 分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出， 而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸 铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 用H3BO3吸收后,再以标准HCl溶液滴定。根据标 准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
第六章蛋白质的测定
蛋白质的测定方法分两大类
一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率 等测定蛋白质含量；凯氏定氮法、双缩脲反应、福林酚试剂法、染料结合反应。
一类是利用蛋白质中的特定氨基酸残基、酸性和碱 性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。紫外测定、 酸碱滴定法。
第六章蛋白质的测定
第二节 蛋白质的定量测定
甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂：变色点pH 5.1 酒红色→绿色
第六章蛋白质的测定
2 实验步骤
（1）样品消化 称取适量样品0.1~2g（固体），移入干
燥的消化管中，加入0.2g硫酸铜，3g 硫酸钾及20mL硫酸，轻轻摇匀后进 行消化。 先小火消化，待消化液呈蓝绿色澄清透 明后，再继续大火加热0.5h，至溶液 呈透明淡黄绿色为止。停火冷却后， 将消化液用水定容至100 mL 。 空白对照：取与处理样品相同量的硫酸 铜，硫酸钾，硫酸按同一方法作试剂 空白试验。
第六章蛋白质的测定
❖ 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有 非蛋白质含氮的化合物，如核酸、含氮碳水化合物、 生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素，所以只 能称为粗蛋白的含量。
国际标准ISO 1871—1975《农产食品—凯氏法测定 氮含量的一般性说明》
❖ 含非蛋白质氮多的食品要单独测 GB/T 21704-2008《乳与乳制品中非蛋白氮含量的测 定》
N = N×6.25 = 蛋白质含量
16%
乳制品K=6.38（N=15.7%） 小麦粉K=5.79（N=17.6%） 动物胶K=5.6（N=18.0%） 冰蛋K=6.7（N=14.8%） 大豆制品K=6.0（N=16.7%）
第六章蛋白质的测定
（2）碱化蒸馏 向接收瓶内加入10mL2%硼酸及2滴混合指示剂并使冷
凝管下端插入液面下。 吸取10.0mL样品消化稀释液注入凯氏定氮仪的反应室
中，用10mL蒸馏水冲洗进样入口，再加10mL50% 氢氧化钠溶液，通入蒸汽开始蒸馏，并通过冷凝管 而进入接收瓶内，以第一滴馏液滴下开始计时，蒸 馏5min，取下接收瓶。停止蒸馏。
第六章蛋白质的测定
一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性 食品。例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉 9.5%，兔肉 21%，鸡肉 20%， 牛乳 3.5%， 带鱼 18.0%， 大豆 40%，面粉 9.9%，菠菜 2.4%， 黄瓜 1.0%，苹果 1.4%
测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营 养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、 优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具 有极其重要的意义。
第六章蛋白质的测定
❖ 但是硫酸钾浓度不可以太高，否则温度太高，生成 的硫酸氢铵会分解放出氨，造成氨的损失。 K2SO4和H2SO4的添加比例是：
1g样品中 K2SO4 : H2SO4=7g : 12mL
第六章蛋白质的测定
<2> 加硫酸铜 作为催化剂，还可以做蒸馏时碱性指 示剂。
受热
CuSO4 → Cu2SO4+SO2↑+O2↑ C+ CuSO4 →Cu2SO4+SO2↑+CO2↑ H2SO4 + Cu2SO4 →CuSO4+SO2↑+2H2O↑
第六章 蛋白质和氨基酸的测定
第六章蛋白质的测定
第一节 概述
1. 蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。
主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白 质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。
蛋白质是生命的物质基础，人体11%-13%总热 量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只 是含量及类型不同。蛋白质是食品的最重要质量指 标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味 及其营养。
第六章蛋白质的测定
原理
（1） 消化总反应式 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4 (NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%）
第六章蛋白质的测定
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点， Gunning将消化方法改进，在消化时加入K2SO4使沸 点上升，这样加快分解速度，温度由原来硫酸沸点的 330上升到400℃，提高了67℃，所以速度也就加快了。 随着消化反应过程，水份逸出，硫酸钾浓度增大，使 沸点增加。加速了有机的分解。也可加入硫酸钠，氯 化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。
蛋白质%=总氮%×K K-换称等数： 乳制品K=6.38（N=15.7%） 小麦粉K=5.79（N=17.6%） 动物胶K=5.6（N=18.0%） 冰蛋K=6.7（N=14.8%） 大豆制品K=6.0（16.7%） K=6.25（N=16%）
第六章蛋白质的测定
实验步骤
（3）滴定 用微量酸式滴定管，以0.05mol/L盐酸标准
溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色 为终点。 （4 ）空白试验 同时取10.0mL空白消化稀释液同上操作。
第六章蛋白质的测定
实验步骤
（5）计算 总氮量%= [N(V2-V1)×0.014]/ W × 100 0.014----氮的毫克当量数
<3>氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化 钛。
<4> 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧 化速度。
第六章蛋白质的测定
消化装置
第六章蛋白质的测定
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（2）蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。 (NH4)2SO4+NaOH→NH3↑+Na2SO4+H2O
第六章蛋白质的测定
原理
（3）吸收与滴定
用2%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定.
2NH3 + 4H3BO3→ (NH4)2B4O7 + 5H2O
(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4H3BO4
指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合 指示剂）
指示剂 红色
绿色
红色
（酸） 吸收 （碱） 滴定 （酸）
第六章蛋白质的测定
1、原理 整个过程分三步：消化, 蒸馏和吸收, 滴定 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质 分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出， 而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸 铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 用H3BO3吸收后,再以标准HCl溶液滴定。根据标 准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
第六章蛋白质的测定
蛋白质的测定方法分两大类
一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率 等测定蛋白质含量；凯氏定氮法、双缩脲反应、福林酚试剂法、染料结合反应。
一类是利用蛋白质中的特定氨基酸残基、酸性和碱 性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。紫外测定、 酸碱滴定法。
第六章蛋白质的测定
第二节 蛋白质的定量测定
甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂：变色点pH 5.1 酒红色→绿色
第六章蛋白质的测定
2 实验步骤
（1）样品消化 称取适量样品0.1~2g（固体），移入干
燥的消化管中，加入0.2g硫酸铜，3g 硫酸钾及20mL硫酸，轻轻摇匀后进 行消化。 先小火消化，待消化液呈蓝绿色澄清透 明后，再继续大火加热0.5h，至溶液 呈透明淡黄绿色为止。停火冷却后， 将消化液用水定容至100 mL 。 空白对照：取与处理样品相同量的硫酸 铜，硫酸钾，硫酸按同一方法作试剂 空白试验。
第六章蛋白质的测定
❖ 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有 非蛋白质含氮的化合物，如核酸、含氮碳水化合物、 生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素，所以只 能称为粗蛋白的含量。
国际标准ISO 1871—1975《农产食品—凯氏法测定 氮含量的一般性说明》
❖ 含非蛋白质氮多的食品要单独测 GB/T 21704-2008《乳与乳制品中非蛋白氮含量的测 定》