离子交换层析、凝胶色谱、离子交换纤维素色谱法

离子交换层析、凝胶色谱、离子交换纤维素色谱法
(2009-07-16 09:26:05)
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分类：生物专业
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杂谈
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离子交换层析（ion exchange chromatography）
离子交换层析（简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。

本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。

50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。

目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。

常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。

带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。

离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。

由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。

因为蛋白质分子在PH高于其等电点的溶液中-COOH会部分解离释放质子从而带负电。

蛋白质带有负电荷时叫做阴离子交换，蛋白质带有正电荷时叫做阳离子交换。

阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。

结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

离子交换层析法分离氨基酸
原理：所用样品为天冬氨酸和组氨酸的混合液，分别属酸性氨基酸(pI2.77)、碱性氨基酸(pI7.59)，用强酸型阳离子交换树脂Dowex50，在一定的洗脱条件下洗脱，将它们分离。

利用氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物进行氨基酸鉴定
1、层析：将Dowex50装柱后，用0.1mol/L NaOH清洗树脂5分钟。

再用pH4.2柠檬酸缓冲液平衡10分钟。

（方法同凝胶层析法）加样8滴。

当样品进入树脂后，加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集，每管收集3ml（控制流速15滴/分钟）。

当第一峰一出现，换用0.1mol/L NaOH作洗脱液，直至第二峰收集完毕。

用pH4.2缓冲液再平衡10分钟，再生。

2、检测：从第2管起每收集管中加入2ml茚三酮显色液，充分混合，沸水浴15分钟，自来水冷却，观察氨基酸与茚三酮的显色反应，若生成紫色化合物，则说明收集到氨基酸。

凝胶色谱法
凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。

目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。

一、基本理论
（一）分子筛效应
一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。

大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。

小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。

具有多孔的凝胶就是分子筛。

各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。

分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。

两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。

直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。

如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。

因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。

综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。

大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。

对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。

于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。

另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。

分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。

（二）色谱柱的重要参数
⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。

在色谱柱
中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt
表示。

⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常
用Vo表示。

⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，
这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。

不包括固体支持物的体积（Vg）。

⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ve
表示。

当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。

当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。

当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。

二、凝胶的种类及性质
（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）
⑴Sephadex
G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面
的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。

例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。

交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。

因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。

⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。

（二）琼脂糖凝胶：
商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。

琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。

一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。

琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。

（三）聚丙烯酰胺凝胶：
是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。

交联剂越多，孔隙越小。

聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。

（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ，具有大网孔结构，
可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。

三、实验技术
（一）层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。

层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。

此外，
直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。

分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。

分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:1─10:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。

分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。

层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。

在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。

（二）凝胶的选择根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。

一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex
G-20的吸水量为20，1 克Sephadex
G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。

凝胶的粒度也可影响层析分离效果。

粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。

一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex G-200效果好，脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。

（三）凝胶的制备
商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。

为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。

特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。

这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。

（四）样品溶液的处理样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。

样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。

上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。

分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30％。

分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。

（五）防止微生物的污染交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有:
⑴叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。

叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。

⑵可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02％。

在微酸性溶液中它
的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。

⑶乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01％。

在微酸性
溶液中最为有效。

重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。

⑷苯基汞代盐
在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％。

在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。

离子交换纤维素色谱法
Sober和Peterson于1956年首次将离子交换基团结合到纤维素上，制成了离子交换纤维素，成功地应用于蛋白质的分离。

从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。

离子交换基团不但可结合到纤维上，还可结合到交联葡聚糖（S-ephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）上。

近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核
苷酸、病毒、噬菌体和多糖的分离和纯化。

它们的优点是:⑴具有开放性支持骨架，大分子
可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大。

⑵具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件使可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活。

⑶多孔性，表面积大、交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。

一、基本理论
离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解离的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。

虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正方向进行，直至完全。

因此可以把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来，同理，当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而波度逐减少，因此也可以全部被交换并吸附在树脂上。

如果有两种以上的成分被交换吸着在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，在被洗脱的能力则决定于各自洗反应的平衡常数。

蛋白质的离子交换过程有两个阶段──吸附和解吸附。

吸附在离子交换剂上的蛋白质可以通过改变pH使吸附的蛋白质失去电
荷而达到解离但更多的是通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。

不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。

二、离子交换的分类及常见种类
（一）分类
离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂。

各类交换剂根据其解离性大
小，还可分为强、弱两种，即强酸剂阳离子交换剂弱酸剂强硷型阴离子交换剂弱硷型。

1.阳离子交换剂
阳离子交换剂中的可解离基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和酚羟基（-OH）等酸性基。

某些交换剂在交换时反应如下：
强酸性：R-SO3-H+＋Na+ R-SO3- Na+H+
弱酸性：R-COOH＋Na+ R-COONa＋H+
国产树脂中强酸1×7（上海树脂＃732）和国外产品Dowex 50、Zerolit 225等都于强酸型离子交换剂。

2.阴离子交换剂
阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺[N-（CH3）2]和季胺[-N（CH3）2]等硷性基团。

某些交换反应如下：
强硷性：R-N+（CH3）2 H·OH-＋Cl R-N+（CH3）2 Cl＋OH-
弱硷性：R-N+（CH3）2 H·OH-＋Cl R-N+（CH3）2 HCl＋OH-
强硷性＃201号国产树脂和国外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都属于强硷型阴离子交换剂。

（二）种类
1.纤维素离子交换剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维纱（DESE-纤维素）。

2.交联葡聚糖离子交换剂：是将交换基因连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。

常用的Sephadex 离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。

阴离子交换剂有DEAE-Sephadex A-25，A-50和QAE- Sephadex A25，A50；阳离子交换剂有CM-Sephaetx C-50，C-50和Sephadex C-25，C-50。

阴离子交换剂用英文字头A，阳离子交换剂的英文字头是C。

英文字后面的数字表示Sephadex型号。

3.琼脂糖离子交换剂：是将DESE-或CM-基团附着在Sepharose CL-6B上形成，
DEAE-Sephades（阴离子）和CM-Sepharose（阳离子），具有硬度大，性质稳定，凝胶后的流速好，分离能力强等优点。

三、实验操作
（一）交换剂的处理，再生与转型
新出厂的树脂是干树脂，要用水浸透使之充分吸水膨胀。

因其含有政绩一些杂质，所要要用水、酸、硷洗涤。

一般手续如下：新出厂干树脂用水浸泡2小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水后加4倍量2N HCl搅抖4小时，除去酸液，水洗到中性，再加4倍量2N NaOH搅抖4小时，除硷液，水洗到中性备用。

将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。

如希望阳树脂带Na+，则用4倍量NaOH搅拌浸泡2小时以上；如希望树脂带H+，可用HCl处理。

阴树脂转型也同样，若希望带Cl-则用HCl，希望带OH-则用NaOH。

用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。

并非每次再一都用酸、硷液洗涤，往往只要转型处理就行了。

（二）柱上操作
⑴交换剂装柱最简单的交换层析柱可用硷式滴定管代替。

处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。

交换剂在柱内必须分布均匀。

⑵上样向层析柱内倾入样品液
⑶洗脱与收集
不同样品选用的洗脱液不同。

原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。

由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。