细胞因子检测

细胞因子检测

细胞因子就是由免疫细胞与某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌得一类生物活性物质分泌得蛋白质,在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞得增殖与凋亡等重要生理活动,•在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用、某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病得发病及病理过程。

1、免疫学检测法其基本原理就是将细胞因子作为抗原进行定量检测。•如免疫斑点法、ELISA法、ＲIＡ法与免疫印迹法等均已用于细胞因子得检测。

2。、生物学测定法其原理就是根据细胞因子对特定得依赖性细胞株(即靶细胞)•得促增殖作用,以增殖细胞中得DNA得合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子得活性单位,如对IＬ-1、ＩL-2等细胞因子活性得检测。亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞得杀伤效应或对病毒得抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素得生物活性测定。

3、分子生物学测定法目前采用得技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交与ＰCＲ等。通过检测细胞内细胞因子得基因组成或mRNA量,推算出细胞因子得合成量、

一、IL-1得检测(生物活性测定)

产生IL—1得细胞种类很多,其中最主要得为单核－巨噬细胞、ＩL—1可分为IL —１α(•也称酸性IL—１,pI=5。0)与IL－1β(中性ＩL－1,pI=7。0)、两者得分子量与生物活性相似,•只能用抗体检测方法才能区别,常用得生物学测定法对两者都适用。ＩＬ-1•得生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10Ｇ4、1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。ＩL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdＲ或125I—ＵdR得ＤＮA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。本试验介绍Ｌ929细胞增殖MTT比色法、

(一)IＬ-1得诱生

体外试验可用ＬPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用P3８

8D1(鼠),TＨP-1(人)细胞株制备ＩL－1、本试验以小鼠巨噬细胞制备IL—１。

1、取6~１0周龄BALB/c或Ｃ5７ＢL/６小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒、

2、用带9号针头得5ml注射器腹腔注入5ml冷得含5％小牛血清得Hａｎｋs 液(５•％•NＢS—ＨBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体(内含腹腔细胞),反复抽吸几次。

3、1500ｒ/min离心8mｉn,洗细胞2次、

4、将腹腔细胞用含10％小牛血清得RＰMＩ-16４0液(10％NＢS—RPMI-1６40)配成２×1０6/ml,加到24孔平底培养板,１ml/孔,置5％CＯ2,37℃温箱孵育2h。

5、每孔用5% NBS—HBSＳ洗3次,弃去未粘附细胞,贴壁细胞为巨噬细胞单层、

６、将LＰS(１0μg/ml)加入巨噬细胞单层,每孔1mｌ,培养4h;加入10％NBS－１６40 •1ml继续培养至48ｈ,收集上清液,置-20℃冰箱保存,待测ＩL－1活性及含量。

(二)L929细胞增殖MTＴ比色法

MTT比色分析法得原理就是利用四甲基偶氮唑盐[3—(4.5—dimetｈｙlthｉa ｚol－２－y1)－•2,5—ｄｉphｅnｙl tetrａzoliｕｍbromidｅ,MＴT)在活细胞线粒体得琥珀酸脱氢酶作用下,被还原成兰黑色得ＭＴT－甲,形成ＭTＴ－

甲得量与细胞增殖程度呈正相关。•故通过测定细胞形成ＭTT—甲量,可间接定量分析细胞得增殖情况,具体步骤如下:

1、将生长成单层得Ｌ９29细胞用0。2５%胰酶消化2~3min。除去消化液后,用１0% FCＳ得ＲＰMI-1640将L929细胞配成1×105／ｍl,加入９6孔细胞培养板中,每孔10０μl。

2、取1０0μl不同稀释度得IＬ—１标准品与待测品,分别加入各孔中,每孔设3个复孔•,置37℃,5% ＣO2温箱孵育５６h。

3、用ＰBS溶解MTT为5mｇ/mｌ,用0。2２μm膜滤器除菌及杂质。

４、上述培养体系取出后,每孔加入10μｌＭＴＴ(５mg／ml),37℃继续培养４h。

5、从每孔吸出100μl上清弃去,加酸化异丙醇或加DMSＯ1０0μl/孔,•充分混匀以溶解底物、酸性条件使培养液中酚红指示剂变为黄色,以利于对MTT-甲转化物得测定。

6、将微量测定板置室温数分钟,保证转变得底物结晶被溶解。

7、用酶标光度计以检测波长为570nm,参考波长为6３0nm分别测量OD值、测定应在酸化异丙醇加入后1h内完成。ＯD５7０ｎｍ-ＯＤ63０ｎm,再减去培养液对照得OD值。

8、用IＬ－１标准品各稀释度IL－１含量(Ｘ)与各稀释度对应得OＤ值(Y)作直线回归,按上述概率单位分析法计算待测样品ＩL—2得活性单位(u/mｌ)、

(三)注意事项

1、IＬ-1诱生剂得浓度,培养条件与细胞浓度对结果均有明显影响,•应进行预试验以确定最佳实验条件、

2、培养器皿与研磨条件:２4孔培养板培养细胞活率较高,但生长稍慢。玻璃瓶培养有时会因玻璃质量与清洗不净引起细胞死亡,故应注意采取相应措施。•大量培养时用大容量瓶比较方便,可减少操作中得污染、研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网。

二、TNF得检测(免疫学测定法,双抗体ＥLＩSA夹心法)

(一)原理选用两种针对rHuTＮF—α分子不同表位得单克隆抗体,一种单克隆抗体作为包被抗体,另一种单克隆抗体作为酶标抗体,如果待测样品中含有TNF—α,则形成抗体－TＮF-α-酶标抗体复合物,通过酶催化底物显色,亦可根据标准品OD值绘制标准曲线,•从标准曲线上查出待检标本中ＴNF-α得含量。

(二)材料与试剂

１、包被抗体: 使用时用包被缓冲液作适当稀释。

2、酶标抗体: 使用时用稀释液作适当稀释、

3、标准品: ｒHｕTNＦ-α(10ng／mｌ),使用时用稀释液作倍比稀释、

4、阴性对照液(未免疫鼠Ｉg)。

5、ＡBＴＳ底物:2,２'—Azino－bis-(３—ehtylbｅｎzthioｚoliｎe 6-sulfon ｉｃacid)•,•２,2'-连氮基—双(3-乙基苯并噻吡咯呆-6磺酸)。

6、9６孔ＥLISA板。

７、0.１5mｏl/L,pH7、４PBＳ:配其它液体用、

８、包被缓冲液: 0、０5mol/Ｌ,pH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液。

9、洗涤液: 0。0５％Ｔwｅeｎ20－PＢS、

10、稀释液:4％PＥG-洗涤液(用于稀释标准品与酶标抗体)。

１1、底物缓冲液:０.1mol/L,pH5、０柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。

1２、3％H２O2。

13、血清、枸缘酸盐或EDTA抗酸血浆、其它体液及细胞培养上清均可检测,•后者应作适当稀释。