(完整版)细胞克隆形成实验
细胞克隆
概念：
细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克
隆的数量。
贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞
必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两
个重要性状。
基本步骤：
1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散
均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，
空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%
平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
克隆形成实验之欧阳音创编
克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。
所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。
细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。
也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。
代入下式得出细胞密度。
细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。
一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。
细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。
各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。
在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。
二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。
常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。
测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。
骨髓克隆实验报告
一、实验目的本研究旨在通过骨髓克隆实验，探讨骨髓间充质干细胞（hMSC）的克隆形成能力及其在软骨组织工程中的应用可能性。
同时，研究永生化hMSC的致瘤性，为其在临床应用中的安全性提供理论依据。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）骨髓来源：选取健康志愿者，采集骨髓。
（2）试剂与仪器：双层软琼脂培养基、细胞培养皿、流式细胞仪、显微镜、CO2培养箱等。
2. 实验方法（1）骨髓间充质干细胞（hMSC）的分离与培养①骨髓单核细胞分离：将骨髓液注入含有肝素抗凝剂的离心管中，低速离心分离骨髓单个核细胞（BMNC）。
②hMSC培养：将BMNC接种于培养皿中，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于CO2培养箱中培养。
（2）永生化hMSC的建立①永生化hMSC的建立：通过转基因技术，将永生化基因（如SV40 T抗原）转染至hMSC中，建立永生化hMSC。
②永生化hMSC的筛选与培养：筛选出永生化hMSC，将其接种于培养皿中，继续培养。
（3）克隆形成实验①细胞悬液制备：将hMSC和永生化hMSC分别制成细胞悬液。
②双层软琼脂培养：将细胞悬液接种于双层软琼脂培养基中，置于CO2培养箱中培养。
③克隆形成率计算：2周后观察克隆形态，计算克隆形成率。
（4）致瘤性实验①细胞接种：将hMSC和永生化hMSC分别接种于裸鼠背部皮下。
②观察成瘤情况：术后3天、1个月和3个月观察成瘤情况。
三、实验结果1. hMSC表型鉴定通过流式细胞仪检测，hMSC表面抗原CD34、CD45表达阴性，CD73、CD90、CD106表达阳性。
2. 克隆形成实验hMSC未能在软琼脂中形成克隆，永生化hMSC克隆形成率为3%。
3. 致瘤性实验永生化hMSC接种裸鼠后3天，接种部位有细胞聚集的团块，1个月和3个月时均未见肿瘤形成。
四、讨论1. 骨髓间充质干细胞（hMSC）的克隆形成能力本研究结果表明，hMSC在软琼脂中无法形成克隆，而永生化hMSC克隆形成率为3%。
克隆形成实验
克隆形成实验的目的
• 研究细胞生物学：揭示细胞生长、分化和凋亡的机制 • 药物筛选：评估药物对细胞生长和克隆形成的影响 • 基因工程：验证基因功能和筛选转基因细胞
克隆形成实验的操作步骤及注意事项
克隆形成实验的操作步骤
• 细胞接种：将细胞接种到培养皿中 • 培养条件：设置适当的温度、湿度和二氧化碳浓度 • 观察和计数：定期观察细胞生长和克隆形成，统计克隆数量
• 20世纪50年代：基因克隆技术诞生，科学家成功分离DNA分子 • 20世纪70年代：细胞克隆技术取得突破，科学家成功克隆青蛙胚胎 • 20世纪90年代：生物体克隆技术实现，科学家成功克隆绵羊多利
克隆技术的分类及应用领域
克隆技术的分类
• 基因克隆：复制特定基因，用于基因工程和基因治疗 • 细胞克隆：复制细胞群体，用于细胞生物学研究和再生医学 • 生物体克隆：复制整个生物体，用于生物多样性和转基因研究
CREATE TOGETHER
DOCS
DOCS SMART CREATE
克隆形成实验
01
克隆技术的基本概念及应用
克隆技术的定义及发展历程
克隆技术的定义
• 通过复制生物体的基因、细胞或组织，生成具有相同遗传特征的生物体或细胞的 技术 • 克隆技术可以分为基因克隆、细胞克隆和生物体克隆
克隆技术的发展历程
克隆技术的应用领域
• 基因工程：制备基因、基因表达载体和基因编辑技术 • 细胞生物学：研究细胞生长、分化和凋亡等生命过程 • 再生医学：制备干细胞和移植细胞治疗疾病 • 农业科学：培育优良品种和转基因作物 • 生物多样性保护：保护濒危物种和保存遗传资源
克隆技术的优点与局限性
克隆技术的优点
• 高效：快速复制遗传特征，提高研究效率 • 可控：通过基因编辑技术，精确控制克隆过程 • 可复制：大量生产相同遗传特征的生物体或细胞，满足 研究和应用需求
细胞克隆形成率实验
目的
▪ 1.了解辐射对细胞增殖的影响 ▪ 2.掌握细胞培养的基本技术 ▪ 3.掌握辐照细胞的方法，细胞克隆技术
博学之，审问之，慎寺之，明辩之，
2
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步骤
▪ 1.取对数生长期的细胞，用PBS洗干净后 胰酶消化，离心。
▪ 2.采用血球计数板计数细胞
▪ 按一定细胞数量（照射0、0.5、1Gy组接 种300个/皿，照射2Gy接种600个/皿，照 射4Gy组接种2×103个/皿，照射8Gy组接 种1×104）接种于60 mm培养皿，每个剂 量组3个皿
▪ 计算出细胞存活率，实验重复3次。
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4
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▪ 照射不同剂量的60Co γ射线
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3
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▪ 细胞贴壁后分别用60Co γ射线照射，置于 37℃ CO2孵箱培养10天；
▪ PBS洗2次，75％乙醇固定30~60min；
▪ 自然晾干后Giemsa染色1h左右，计数细 胞克隆数(计数≥50个细胞的单克隆)；
平板克隆形成实验
平板克隆形成实验
1.平板克隆性形成原理：
细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。
贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
基本步骤：
1、取对数生长期的各组细胞，分别用EDTA+0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、用血球计数板，对细胞进行计数，将约200个细胞接种到10ml含10ml预热DMEM+10%FBS的BD10cm细胞培养皿中轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养10-14d。
3、培养期间适时观察细胞生长状况，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
用5ml甲醇固定细胞15分钟，弃去去固定液，加适量吉姆萨液染染色15-30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%
平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
克隆形成实验
克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。
所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。
细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL ，加入 0.9mL 结晶紫 (或台盼至 )染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。
也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。
代入下式得出细胞密度。
细胞数 /ml=(4 大格细胞数之和/4) ×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。
一般0.5% ～ 1% 的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
此外还可用0.02% 的藻红 B 染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用 0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。
细胞存活百分率= （4 大格活细胞数 /4 大格活细胞 +死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。
各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。
在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于 200 个 /10mm2 或多于 500 个 /10mm2 时，需重制细胞悬液，重新计数。
二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。
常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24 小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。
测定生长曲线的另一种方法是用 96 孔/24 孔细胞培养板，分 7 组，每组 3 孔，培养一周 (7 天 )，期间逐日检测一组，计数，最后把 7 天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。
原代细胞克隆形成实验原理
原代细胞克隆形成实验原理一、引言原代细胞克隆是指通过将原代细胞分离并培养，使其形成与原代细胞相同的克隆细胞群体。
这种技术被广泛应用于生物医学研究、生物工程和农业领域，对于细胞的功能研究、药物筛选和基因改造具有重要意义。
本文将介绍原代细胞克隆形成实验的原理和步骤。
二、原代细胞克隆形成实验原理原代细胞克隆形成实验主要基于细胞的增殖特性和分化能力。
细胞增殖是细胞生命周期中的一个重要过程，通过细胞分裂可以产生两个或更多的细胞。
分化是指细胞在特定条件下转变为特定类型的细胞。
在细胞克隆实验中，我们利用细胞的增殖特性和分化能力，将原代细胞分离并培养，使其形成克隆细胞群体。
三、原代细胞分离原代细胞分离是实现细胞克隆的第一步。
通常，我们从动物或植物组织中取得原代细胞，例如从小鼠胚胎中获取胚胎成纤维细胞。
然后，利用消化酶或机械方法将组织分解成单个细胞。
分离后的细胞可通过显微镜观察验证。
四、原代细胞培养原代细胞分离后，需要将其培养在适当的培养基中，提供细胞所需的养分和环境条件。
培养基的选择对于细胞的生长和分化至关重要。
常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640和MEM等。
此外，培养基中还需要添加血清和抗生素等物质，以促进细胞的增殖和防止细菌污染。
五、细胞增殖和分化原代细胞在培养基中经历细胞增殖和分化的过程。
细胞增殖是指细胞通过分裂产生新的细胞，从而形成细胞群体。
细胞分化是指细胞根据特定的信号和环境条件转变为特定类型的细胞，具有特定的功能和形态。
在培养过程中，细胞会不断增殖和分化，形成克隆细胞群体。
六、细胞筛选和传代在细胞克隆形成实验中，为了获取具有相同遗传特性的细胞群体，需要对细胞进行筛选。
常见的筛选方法包括荧光染色和细胞表面标记等。
筛选后的细胞可以进行传代，即将细胞分离并继续培养。
传代可以使细胞持续增殖和分化，保持克隆细胞的稳定性和纯度。
七、应用领域和前景原代细胞克隆形成实验在生物医学研究、生物工程和农业领域有着广泛的应用。
软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)
注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不克不及有细胞团，接种密度不克不及过大。
软琼脂培养法经常使用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
接种细胞的密度每平方厘米不超出35个，正常细胞在悬浮状态下不克不及增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。
1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。
2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。
提前融化血清和双抗。
3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解 1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中坚持。
4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。
5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不克不及发生气泡）。
对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。
6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。
每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。
7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中坚持。
(完整版)细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
平板克隆形成实验步骤
平板克隆形成实验步骤1. 实验目的本实验旨在通过克隆技术，利用平板细胞进行克隆形成，以了解和研究克隆过程中的细胞特性和发育机制。
2. 实验材料与设备•平板细胞培养基•平板细胞培养皿•组织培养箱•显微镜•移液器、离心机等常规实验设备3. 实验步骤步骤一：平板细胞的收集与培养1.将平板组织切割成小块，并用PBS缓冲液清洗去除残存物质。
2.将切割好的平板组织块放入含有酶解消化液的离心管中，放置于37°C恒温水浴中进行消化反应。
消化时间根据平板组织的大小而定，通常为30分钟至1小时。
3.消化结束后，用相同体积的培养基停止消化反应，并通过过滤网过滤掉残留组织块和大颗粒物质。
4.转移过滤后的细胞悬液到新的离心管中，并进行离心操作。
离心速度和时间根据细胞类型和体积而定，通常为1000rpm离心5分钟。
5.弃去上清液，用培养基悬浮细胞沉淀，并将细胞转移到新的培养皿中。
步骤二：平板细胞的克隆形成1.将培养好的平板细胞均匀分散在培养皿中，使其单层附着生长。
2.在培养皿中加入适量的培养基，保持细胞在良好的生长状态。
3.观察平板细胞在培养皿中的生长情况，每隔一段时间使用显微镜观察并记录细胞形态和数量的变化。
步骤三：观察和记录1.使用显微镜观察平板细胞在培养皿中的形态特征和数量变化。
注意观察细胞的形状、大小、颜色等特征，并记录下来。
2.利用显微镜拍摄并保存平板细胞的图像，以备后续分析和比较使用。
步骤四：数据分析和结果讨论1.根据观察和记录的数据，对平板细胞的克隆形成进行分析和比较。
2.统计不同时间点的细胞数量和形态变化情况，并制作图表展示。
3.分析细胞数量和形态变化的趋势，探讨克隆过程中可能存在的发育机制和影响因素。
4. 实验注意事项1.实验过程中需要严格遵守生物安全操作规范，保护自己和他人的安全。
2.使用无菌操作技术，避免细菌、真菌等污染物进入培养皿。
3.实验材料和设备要保持清洁，并进行适当消毒处理。
4.注意培养基的配制和保存，确保培养环境的稳定性和适宜性。
软琼脂克隆形成实验步骤完整版
软琼脂克隆形成实验步骤完整版集团公司文件内部编码：（TTT-UUTT-MMYB-URTTY-ITTLTY-注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。
1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWESTREGULARArgroseG10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。
2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。
提前融化血清和双抗。
3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。
4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。
5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。
对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。
6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。
每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。
克隆形成实验原理及步骤
克隆形成实验原理及步骤嘿，咱今儿就来讲讲克隆形成实验的那些事儿！你知道吗，这克隆形成实验就像是一场细胞的奇妙冒险之旅。
先来说说原理哈。
这就好比是让细胞们去参加一场“克隆大赛”，看谁能繁衍出最多的“子孙后代”。
细胞们在合适的环境里，就会开始分裂、增殖，形成一个个小小的克隆群体。
这就像是星星之火，可以燎原一样，一个小小的细胞也能发展成一大片呢！那具体步骤是咋样的呢？首先得准备好细胞啦，就像给运动员们准备好比赛场地一样。
把细胞小心翼翼地种在培养皿里，给它们提供舒适的“家”。
然后呢，就是耐心等待啦，看着它们一点点地生长、分裂。
这过程可不简单哦，就像看着小树苗慢慢长大，得时刻关注着，可不能出啥岔子。
接着，经过一段时间后，就可以看到培养皿里出现了一个个的小克隆啦！哇，那感觉就像是看到自己精心培育的花朵终于绽放了一样惊喜。
这时候，就得给这些小克隆们“拍照留念”啦，用合适的方法把它们标记出来，记录下它们的样子和数量。
你说这是不是很神奇？就这么一个小小的实验，能让我们看到细胞的强大生命力和繁殖能力。
这就像是打开了一扇通往微观世界的大门，让我们对生命的奥秘有了更深的了解。
想想看，如果没有这样的实验，我们怎么能知道细胞是怎么工作的呢？怎么能找到治疗疾病的新方法呢？所以说啊，这克隆形成实验可真是太重要啦！在做这个实验的时候，可得细心再细心哦，就像照顾小宝宝一样，不能有一点马虎。
每一个步骤都得做到位，不然可就得不到准确的结果啦。
这就好比搭积木，一块没放好，可能整个城堡就垮啦！总之呢，克隆形成实验是生物学研究中非常重要的一部分。
它让我们能更好地了解细胞的特性和行为，为医学、生物学等领域的发展做出贡献。
所以啊，大家可得好好了解了解它，说不定哪天你也能亲自去尝试一下呢！你难道不想去探索一下这个神奇的细胞世界吗？。
正常细胞克隆实验报告
一、实验目的1. 了解正常细胞克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握细胞克隆实验技术，包括细胞培养、传代、冻存等。
3. 观察正常细胞克隆的生长过程，了解细胞克隆的特性。
二、实验原理细胞克隆是指从一个单细胞分裂繁殖而来的细胞群体，具有相同的遗传特性。
细胞克隆实验是研究细胞生物学、遗传学等领域的重要手段。
本实验通过细胞培养、传代、冻存等步骤，使细胞克隆生长并繁殖，观察其生长过程和特性。
三、实验材料1. 细胞：人胚肾细胞系HEK293T。
2. 培养基：DMEM培养基。
3. 胎牛血清：FBS。
4. 细胞培养瓶：25cm²、75cm²、150cm²。
5. 细胞计数板：血细胞计数板。
6. 离心机：高速离心机。
7. 冻存管：无菌冻存管。
8. 冷冻箱：-80℃冰箱。
9. 灭菌器：高压蒸汽灭菌器。
四、实验步骤1. 细胞复苏：将冻存的细胞复苏，置于37℃水浴中，待细胞完全溶解后，用移液器移入含有胎牛血清的培养基中，放入培养箱中培养。
2. 细胞传代：待细胞生长至约80%融合时，用胰酶消化细胞，用移液器将细胞悬液移入新的培养瓶中，加入新鲜培养基，放入培养箱中培养。
3. 细胞克隆：将传代后的细胞悬液用移液器吸取适量，加入预先准备好的培养皿中，放入培养箱中培养。
4. 观察与记录：每天观察细胞克隆的生长情况，记录细胞克隆的生长速度、形态、颜色等特征。
5. 细胞冻存：将生长良好的细胞克隆用移液器移入无菌冻存管中，加入冻存保护剂，放入-80℃冰箱中冻存。
五、实验结果1. 细胞复苏：复苏后的细胞在37℃水浴中溶解，加入新鲜培养基后，细胞生长良好。
2. 细胞传代：传代后的细胞生长速度较快，形态正常。
3. 细胞克隆：细胞克隆生长迅速，呈扇形、圆形等不同形态，颜色鲜亮。
4. 细胞冻存：冻存后的细胞在复苏后仍能正常生长。
六、实验结论通过本实验，我们掌握了正常细胞克隆实验的基本原理和操作步骤，成功培养了细胞克隆，并观察了其生长过程和特性。
如何做好细胞克隆形成
如何做好细胞克隆形成(⼀) 实验⽬的通过细胞在细胞培养板上的克隆形成能⼒来提⽰细胞的增殖能⼒。
(⼆) 实验原理克隆形成是测定细胞增殖能⼒的有效⽅法之⼀。
单个细胞在体外持续6代以上，其后代所组成的细胞群称为克隆。
这时每个克隆含有50个以上的细胞，⼤⼩在0.3-1.0 mm之间，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜⼒做定量分析，了解细胞的增殖能⼒和独⽴⽣存能⼒。
(三) 实验流程(四) 实验材料⽣物安全柜、荧光显微镜、离⼼机、倒置显微镜、CO2培养箱；完全培养基、胰酶、PBS、结晶紫、4%多聚甲醛(五) 实验步骤1. 准备感染后细胞[如果是克隆形成预实验，直接⽤空细胞进⾏实验] ：将处于对数⽣长期的各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数。
吸弃培养基PBS清洗加⼊胰酶终⽌消化收集细胞离⼼获取沉淀细胞计数2. 细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种500-1000个细胞/孔[正常增殖速度为1:5-1:10传代，3天长满细胞，可以接种500个细胞，其余增殖缓慢细胞，可以接种800-1000；接种时注意梯度稀释细胞悬液，观察细胞密度，以免因计数不准确导致实验结果偏差] ，每个实验组设3个复孔，培养基为含30%FBS的完全培养基；铺板铺板后摇匀3. 将接种好的细胞摇匀后轻放于培养箱中继续培养，每隔3 天进⾏换液并观察细胞状态，显微镜下观察克隆⼤⼩[3复孔之间克隆⼤⼩应相似] ，待单个克隆⽣长到⼤⼩不超过图⽚视野时可以进⾏拍照；4. 拍完照之后的将6孔板放⼊培养箱中继续培养，待孔中⼤多数单个克隆中细胞数⼤于50为⽌，弃上清，PBS洗涤细胞1次。
铺板后第三天铺板后第六天铺板后第九天5. 每孔加⼊1 mL 4%多聚甲醛[有毒，注意在安全柜中操作] ，4度冰箱固定细胞60min，PBS洗涤细胞1次。
6. 每孔加⼊洁净、⽆杂质结晶紫染液1000 µL，染细胞2min。
7. ddH2O洗涤细胞数次，晾⼲，数码相机拍照整，克隆计数。
克隆形成实验
克隆形成实验
在科学领域中，克隆技术一直是备受关注的话题之一。
克隆形成实验是一种重要的科学方法，通过实验过程可以获取有关生物复制和发展的重要信息。
下面将介绍克隆形成实验的基本原理和实施方法。
原理
克隆形成实验的原理主要基于生物复制过程中的细胞分裂和遗传物质传递。
在实验中，研究人员通常会选择一个成熟的细胞，将其核移植到一个去除了细胞核的受体细胞中。
这个过程类似于自然界中的受精过程，新的细胞会继续遵循原细胞的遗传信息发展成为一个克隆体。
实施方法
1.细胞采集：首先需要从一个成熟的细胞中提取细胞核。
2.受体细胞准备：准备一个去除了细胞核的受体细胞，通常为卵母细
胞。
3.细胞核移植：将第一步中提取的细胞核移植到受体细胞中。
4.培养：将形成的新细胞培养至一定阶段，确保其正常发育。
这种方法虽然看似简单，但实际操作中却需要高超的技术和精密的操作，因为任何一丝差错都可能导致实验失败。
应用与影响
克隆形成实验在生物学研究和医学领域中具有重要的应用价值。
通过克隆形成实验，科学家们可以更好地研究细胞分裂、遗传物质传递等生物基本过程，为后续的研究工作奠定基础。
此外，克隆技术还在医学领域具有潜在的应用前景，比如用于治疗某些疾病或生成器官。
总的来说，克隆形成实验是一项挑战性的科学实验，它不仅推动了生物学研究的发展，也为医学领域的创新带来了新的可能性。
在未来，随着技术的不断进步，相信克隆形成实验将会在更多领域展现出其重要性和价值。
克隆形成实验
克隆形成实验之五兆芳芳创作细胞生长状况有关指标的检测办法一、细胞计数这是细胞培养中经常使用的根本技巧之一.所用资料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜. 细胞计数的根本步调：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，参加0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不过溢为宜.也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜不雅察计数四角大分格中的细胞数.代入下式得出细胞密度.细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计较出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率.一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色.此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成白色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成玄色. 细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述办法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大范围细胞计数任务使用.各类型号的计数操纵不尽相同，可按照使用说明进行操纵. 在进行细胞计数操纵时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分离良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数.二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最根本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁衍根本纪律经常使用的简洁办法.经常使用的办法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不合时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反响出细胞生长的动态. 测定生长曲线的另一种办法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线. 也可采取MTT法来进行生长曲线测定，较上述办法简洁. 尺度的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所削减，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期和生长稳定，最后衰老.细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度，经一个生长周期达到最大活细胞浓度的比率.生长倍数=培养后最大活细胞浓度/接种时的活细胞浓度三、细胞割裂指数细胞割裂指数是暗示细胞增殖旺盛程度的指标.它以被测1000个细胞中的割裂细胞数来计较.其办法为：用秋水仙素将细胞处理1～2小时后，按染色体制片法制片并染色，计较1000个细胞中割裂相的数目，重复4次取平均值，用百分比暗示. 根本步调：(1)细胞准备用盖片(支持物)培养法.(2)每24小时取出一个小玻片，按常规办法进行固定，吉姆萨或HE染色，封片，制成永久标本.(3)显微镜下选择细胞密度适中的区域不雅察割裂细胞并计数.逐个视野进行，对每一时间组的玻片各取细胞多、中、少3个区域各一区，共数1000个细胞，计较出平均割裂相值所占百分比.不雅察时要掌握好割裂相尺度，主要是确定好划分间期和前期，末期和间期等的界限，以削减误差. 细胞割裂指数=细胞割裂相数/细胞总数(1000)×1000 四、细胞接种存活率细胞接种存活率又称细胞贴壁率.它是细胞被制成分离的悬液后，以低密度(2～5个细胞/cm2)被接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群(克隆)的细胞百分数值，用以暗示细胞的生存能力和细胞群的活气. 根本步调：（1）取对生长期细胞，用消化法制成细胞悬液，计数后按检测细胞生长曲线的接种细胞的原则，将细胞接种于培养瓶(浓度相对高些).接种12～15瓶. （2）每2小时取出一瓶细胞，倒掉培养液，然后参加胰酶消化已贴壁细胞，计数已贴壁细胞，用下面公式逐个计较每个时间上的贴壁率.每2小时一次，共不雅察24小时即12. 接种存活率%(贴壁率)=(贴壁存活细胞数/接种细胞数)×100% 五、克隆形成率细胞接种存活率只暗示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆.而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活气的细胞.克隆形成率反应细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状.由于细胞生物学性状不合，细胞克隆形成率不同也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强.并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分离成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时查抄，到细胞形成克隆时终止培养.1、平板克隆形成试验根本步调：(1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用.(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(按照增殖能力)接种于培养皿中.一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度辨别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分离均匀.置37℃5% CO2及饱和湿度的情况下，静置培养2～3周.(3)经常不雅察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养.弃去上清液，用PBS小心浸洗2次.加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟.然后去固定液，加适量Giemsa 应用染色液染10～30分钟，然后用流水迟缓洗去染色液，空气枯燥.(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数.最后计较克隆形成率.克隆数克隆形成率= —————×100%接种细胞数平板克隆形成试验办法复杂，适用于贴壁生长的细胞.适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿.试验成功的关头是细胞悬液的制备和接种密度.细胞一定要分离得好，不克不及有细胞团，接种密度不克不及过大.2、软琼脂培养克隆形成试验根本步调：(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L.然后按照实验要求作梯度倍数稀释.(2)用蒸馏水辨别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固.(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混杂后，取3mL混杂液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用.(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中参加0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有 1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层.待上层琼脂凝固后，置入37℃5%CO2温箱中培养10～14天.(5)把平皿放置在倒置显微镜下，不雅察细胞克隆数.计较形成率. 软琼脂培养法经常使用检测肿瘤细胞和转化细胞系.试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超出40℃.接种细胞的密度每平方厘米不超出35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞.正常细胞在悬浮状态下不克不及增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验.。
克隆形成实验
克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。
所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。
细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL ，加入0.9mL 结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。
也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。
代入下式得出细胞密度。
细胞数/ml=(4 大格细胞数之和/4) ×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。
一般0.5% ～1% 的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
此外还可用0.02% 的藻红 B 染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05% 的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。
细胞存活百分率=（4 大格活细胞数/4 大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。
各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。
在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200 个/10mm2 或多于500 个/10mm2 时，需重制细胞悬液，重新计数。
二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。
常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24 小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。
测定生长曲线的另一种方法是用96 孔/24 孔细胞培养板，分7 组，每组 3 孔，培养一周(7 天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7 天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。
体细胞克隆实验报告
体细胞克隆实验报告
在生物科技领域中，体细胞克隆技术一直备受关注。
本实验旨在探
究体细胞克隆的原理与方法，通过实验操作验证体细胞克隆的可行性
及效果。
以下为本次体细胞克隆实验的详细报告。
实验材料与方法：
1. 实验材料：本实验中使用小鼠作为实验对象，提取小鼠体细胞作
为克隆材料，克隆载体，细胞培养基等。
2. 实验方法：
a. 提取小鼠体细胞：从小鼠身体中提取皮肤细胞或其他体细胞。
b. 载体制备：准备用于克隆的载体，包括质粒载体、病毒载体等。
c. 细胞核移植：将提取的体细胞核注入到空载体中。
d. 体细胞克隆：在体外环境中培育克隆胚胎，等待克隆胚胎的发育。
e. 移植实验：将发育良好的克隆胚胎移植到母体中，观察克隆胚
胎的存活情况。
实验结果：
通过实验操作，成功克隆了多个小鼠胚胎，并将其移植到母体中进
行孕育。
经过观察发现，部分克隆胚胎成功发育成小鼠幼仔，说明体
细胞克隆技术在实验条件下取得一定的成功率。
实验结论：
体细胞克隆技术是一种重要的生物技术手段，通过细胞核移植实现了对体细胞的重新编程，可以复制出与体细胞同源的个体。
但实验结果也表明，体细胞克隆的成功率受到多种因素的影响，包括克隆材料的质量、操作技术的熟练程度等。
需要进一步优化实验方法，提高体细胞克隆技术的成功率。
综上所述，体细胞克隆实验为我们提供了一个深入了解细胞克隆技术的机会，同时也为生物科技领域的发展探索了新的可能性。
希望通过不断的探索与实践，能够进一步完善体细胞克隆技术，为科学研究和医学应用提供更多有益的帮助。
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细胞克隆形成实验
当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：
一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：
平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验
(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞
(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：
1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%
平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不
能有细胞团，接种密度不能过大。
平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：
(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。
然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。
待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。
(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。
计算形成率。
软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。
接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。
正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。
软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆)
将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备0.6％的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000 个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well)，混匀，室温凝固。
置于37℃，5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。
注意事项
1.接种时细胞密度适度，不可过高。
2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞；
3.琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。
因此高压灭菌后应进行分装；
4.细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响；
5.细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。
因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。
6.细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。