几种光合固氮微生物固氮能力的比较

探究沱江河中自生固氮藻类的分离

初2018级11班岳劲洋、高2018级9班岳家星辅导教师岳捷

研究背景:空气中含有大量的氮气,其化学性质不是很活泼,很难直接被农作物利用,但是在自然界中存在固氮微生物,它们能够把大气中的氮气还原成氨,氨再被氧化成亚硝酸盐或硝酸盐,就可以被农作物直接利用,从而减少含氮化肥的施用.不同的固氮微生物固氮能力是不同的,但是如何分离固氮微生物,并选择出固氮能力强的微生物并在农业生产实践进行应用.

研究的主要内容:1.光合固氮微生物的分离与培养.

2.念珠藻、鱼腥藻的分离与培养.

3. 念珠藻、鱼腥藻固氮能力的测定.

4.念珠藻、鱼腥藻的实践应用

研究的具体过程:一、光合固氮微生物的分离与培养

1.收集样品从内江沱桥沱江河边用烘干的收集瓶分别采集水下20---30厘米的水样,盖好瓶盖,带回学校生物实验室,置于散射光下.

2.浓缩细胞的浓度.⑴将样本分装到10个5ml离心管中, 每管5mL，每次离心5管，设置转速为10000r/min室温离心10min。

⑵除去上清液，每管加入1mL培养液（培养基不能加入凝固剂如琼脂）重悬，将5管合成一管。再进行离心,10000r/min室温离心10min。

⑶除去上清液，加入1mL培养液重悬，贴上标签待用。用牛皮纸包扎好，置于恒温4℃保存。

二、单细胞藻类的培养

我和姐姐经过上网查资料,讨论决定使用稀释分离的方法进行单细胞藻类的培养，什么是稀释分离法?是把混杂有其他生物又含有需要分离的藻类的水样，取其一定量，用特定培养液按照一定的倍率进行稀释。当稀释到一定程度时，再涂布特定的培养基上,单细胞藻类进行增殖从而形成特定的单细胞藻类细胞群落,最终把原混杂生物进行单个分离培养的一种方法。

⑴材料准备：待用培养液重悬, 记号笔，涂布器，灭菌2mL离心管，移液枪和移液管，

灭菌枪头，装有灭菌培养液的锥形瓶以及装有灭菌培养液的试管，灭菌平板培养基，酒精灯，打火机,牛皮纸等.

⑵实验过程：

①将准备的所有材料全部放置在超净台上，然后打开超净台上的紫外线灭菌开关，进

行灭菌20--25min。紫外线灭菌提示灯自动关闭后，打开超净台上的排风机开关。

②打开酒精灯，用体积面百分数为70%的酒精擦拭移液枪,超净工作台的台面和手。

③制备呈浓度梯度的样品。取10个2mL离心管，贴上标签并注明稀释倍率。每个离心

管中先加入0.9mL液体培养基。用移液枪从待用培养液重悬取0.1mL藻液（使用前将细菌悬浮），加入第1个装有培养液的离心管中，用移液枪吹打均匀,这样0.1mL 藻液就稀释了10倍。再从第1个离心管中取0.1mL藻液，加入第2个装有0.9mL培养液的离心管中，用移液枪吹打均匀,原始的藻液就稀释了100倍;依次完成10个。

④固体培养基的制备。打开牛皮纸包好的灭菌培养皿，贴上浓度标签。打开装有灭菌

不含N培养液的锥形瓶，在每个培养皿中倒入等量不含N培养液20mL和适量的凝固剂琼脂，加热煮沸然后冷却到44℃后倒平板,静置培养皿待培养液冷却凝固，4℃保存。

⑤用移液管从浓度梯度离心管中分别取出50μL菌液，加入制备好的编号为1—10号

的固体培养基中。涂布器先用体积面百分数为70%的酒精擦拭，然后在酒精灯的外焰上灼烧，待其冷却（以免烧伤离心管中的藻类），在酒精灯的旁边将藻液均匀涂到整个培养皿中。依次完成以下10个。做2个对照组，对照组不加藻液。放在带玻璃门的恒温培养箱中调到20℃并进行光照培养一段时间。

⑥挑选藻斑培养

观察培养皿中单细胞藻类的生长状况，对照组不长藻落，选取实验组长出单细胞藻落的培养皿进行挑取藻斑。挑选藻斑是进行纯种培养中非常关键的环节，挑选出的藻类活性高。

材料准备：酒精灯，灭菌枪头，移液枪，装有灭菌培养液的试管，长好藻斑的培养皿,打火机，记号笔,摇床。

具体操作步骤：

第一,将准备材料全部放在超净工作台上，打开超净工作台上的紫外线开关，灭菌20--25min。当灭菌结束后，再打开超净工作台上的排风机。

第二, 打开酒精灯，用体积面百分数为70%的酒精擦拭移液枪,超净工作台的台面和手。

第三,用记号笔在长藻的培养皿的底部将藻斑圈出，并作好记号。

第四,用装好枪头的移液枪伸入到有藻斑的培养皿中，在藻斑上轻点，粘取单细胞藻类的细胞群体。注意枪头不要取下，直接将移液枪在灭菌培养液中进行吹打,是将单细胞藻类分散到液体培养基中。

第五,将接好的藻类的试管拿到摇床上摇，准备待用。

三、单细胞藻类的检验及显微镜观察

形态差异极大，有球状、杆状和丝状等形态。有单细胞体、群体类型。群体由一条或多条单细胞排列成串的或丝状体构成，其中有的为单条不分枝，有的具假分枝，有的具多分枝，还有的许多菌丝共同包埋在胶质包被中，形成胶群体。

蓝细菌的细胞壁含有纤维素，细胞内进行光合作用的部位称类囊体，类囊体膜上含有叶绿素a、β-胡萝卜素以及与光合电子传递链有关的组分。藻胆蛋白为类囊体所特有，其功能是吸收光能，并把它转移到光系统Ⅱ中，光合色素为叶绿素a，存在于丰富的内膜系统上，在光系统Ⅰ中发挥作用。与光合细菌的光合色素不同。蓝细菌体内没有叶绿体。

许多水生种类细胞质中有气泡，使菌体漂浮，保持在光线最充足的地方，以利光合作用。无鞭毛，但能在固体表面滑行，趋光性。

分泌粘液层、荚膜或形成鞘衣，因此具有强的抗干旱能力。

因此,使用显微镜观察蓝藻的形态。

1.蓝藻的检验

具体操作步骤：

⑴将准备材料全部超净台上，打开超净台紫外线，灭菌20min。灭菌结束后，打开超净

台排风机。

⑵打开酒精灯，用酒精擦拭移液枪,超净台台面,手。

⑶制备固体培养基。打开报纸包好的灭菌好的培养皿，做好标签。打开灭菌培养液（锥

形瓶），在每个培养皿中倒入5mL培养液，静置培养皿待培养液冷却凝固。多倒的培养基用封口胶封好，4℃保存。

⑷用移液枪从挑斑培养的液态菌中取50μL菌液，加入制备好的固体培养基中。涂布

棒用酒精擦拭，然后在酒精灯上灼烧，放入培养皿中靠上盖待其冷却（以免烧伤刚加入培养皿中的菌），将菌液均匀涂到整个培养皿中。做3个实验组，做2个对照组，对照组不加菌液。

⑸放在带玻璃门的培养箱中36℃光照培养，观察。