日化产品抑菌效果快速检测方法
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技术圆桌
中国洗涤用品工业杂志 《工业与公共设施清洁》
日化产品抑菌效果快速检测方法
谷爱军 于 文 （西安开米股份有限公司，陕西 西安，710075）
摘 要：本文论述了以2,3,5-三苯基氯化四氮唑（简称TTC）作为指示剂，避光灭菌后添加到营养琼脂 中制成TTC显色培养基。通过悬液定量法，对大肠埃希菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）进行抑菌试验，仅需24h即可得出结果，比现有标准要求的48h观察结果大大缩短了时间。本研究建 立的方法简便快捷，检测结果稳定可靠。 关键词：氯化三苯基四氮唑；抑菌；快速检测 中图分类号：TQ649.4 文献标识码：Ａ 文章编号：1672—2701（2019）03—60—05
由表1可知：A瓶和B瓶菌落回收数，与营养琼 脂对照组的相对偏差均＜10%，而C瓶外观呈现红褐 色，培养的阳性菌回收菌数与对照组有明显差异。 因此，本实验选择以A瓶显色培养基的制备方法，
三种灭菌方式
营养琼脂对照 A瓶 B瓶 C瓶
表1 不同的灭菌方式对TTC指示剂的影响
大肠埃希菌平均 回收菌数103 相对偏差%
由表2可知：含0.01mg/mL、0.02mg/mL、 0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mLTTC营养琼 脂培养基都对大肠杆菌均无抑制现象；但对金黄色 葡萄球菌显色均敏感，当TTC浓度大于0.02mg/mL
时，平皿的回收菌数与营养琼脂对照组比较相对偏 差略大，有一定的抑制现象，而且浓度越高，抑菌 作用越明显。可能与革兰氏阳性菌细胞壁上肽聚糖 和磷壁酸含量高，而革兰氏阴性菌肽聚糖和磷壁 酸含量少，此外，还有脂蛋白、外膜、脂多糖等 结构的不同而导致对TCC敏感性不同[4]。 最终选择 0.02mg/mL的TTC作为显色剂，既保证菌落良好的 显色效果，且不抑制细菌的生长。 2.5 不同色素对含0.02mg /mL TTC显色培养基的 影响
配制含TTC系列梯度的营养琼脂5瓶，各瓶 含TTC的浓度依次为0.01mg /mL、0.02mg /mL、 0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL。吸取0.1mL 菌悬液，加入到含5.0mLPBS的试管中，迅速混匀； 取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS试管中，吸取样液 1mL置于灭菌平板内（做适当稀释后，取其中2～3 个稀释度的稀释液），分别用含TTC系列梯度的营 养琼脂倾注5个平皿，充分混合均匀，待琼脂凝固后 翻转平皿，置 36℃±1℃培养箱内培养 48h±2h， 同时做不加TTC的营养琼脂对照及空白对照，以 30～300 cfu/mL菌落生长数计数平板，各组测得的 回收菌数见表2。
2.2 测试方法 按照QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果
的评价方法》抑菌率检测方法进行测试，计算回收 菌落数。 2.3 不同的灭菌方式对TTC的影响
配制0.1%TTC溶液500mL，分装于螺口玻璃 瓶中。A瓶：TTC溶液单独避光高压灭菌后，吸取 1.0mL，加入至已灭菌并冷却至50℃左右的100mL 营养琼脂中，混合；B瓶：TTC溶液采用0.45mm微 孔滤膜过滤除菌，吸取1.0mL，加入至已灭菌并冷 却至50℃左右的100mL营养琼脂中，混合；C瓶： 吸取1.0mL TTC溶液，于100m琼脂中混匀后121℃ 高压灭菌15min。
研究无色、无味的氯化三苯四氮唑（简称TTC）作 为指示剂，应用在抑菌试验测试中，期望能建立快 速测定日化产品抑菌效果评价的方法，以提高配方 开发的效率。
1 实验试剂及设备 1.1 主要试剂
2,3,5—三苯基氯化四氮唑，又称氯化三苯基四 氮唑 [ triphenyltet 2razolium chloride (TTC) ]、红四
试验菌株为金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、 大肠埃希菌（ATCC 25922），中国普通微生物菌种 保藏管理中心。 1.2 实验设备
恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；涡旋 仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；恒温生化 培养箱，上海一恒科技仪器有限公司；TYJ-2A菌落 计数器，上海宏汇电器厂；生物安全柜，型号BSC1100II A2-x，济南鑫贝西生物技术有限公司。 1.3 试验用日化产品
吸取0.1mL菌悬液，加入到含5.0mL PBS的试管 中，迅速混匀后，取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS 试管中（做适当稀释，取其中2～3个稀释度的稀释 液），吸取0.5mL置于灭菌平板内，分别倾注A瓶、 B瓶、C瓶及营养琼脂培养基各2个平皿，摇匀待冷 却后翻转平皿至36℃±1℃培养48h，以营养琼脂培 养的回收菌数作为对照，以平板菌落数在30～300 计数，各组测得的回收菌数见表1。
采购于大型超市，标贴宣称具有抑菌功能的洗 手液、洗衣液、餐具净等产品。
2 实验部分 2.1 菌悬液的配制
按照QB/T 2738-2012方法，无菌操作取金黄 色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠埃希菌（ATCC 25922）五代的24h新鲜培养物，分别制备阳性菌悬 液， 要求浓度为：取0.1mL滴入5.0mL PBS液内， 回收菌数在1×104～9×104cfu/mL [3]。
金黄色葡
54.5
0.92
46
52
3.7
42
38
29.63
34
相对偏差%
/ 0 8.69 26.09
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即TTC经单独高压灭菌再与50℃营养琼脂混匀的方 式进行后续试验。 2.4 不同浓度TTC对阳性菌的影响
目前，洗涤剂抑菌性能测试方法主要为GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》、 QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价 方法》和卫法监发[2002]282号 《消毒技术规范》 [2002年版]。采用悬液法对金黄色葡萄球菌和大肠 杆菌进行抑菌性能测定时，三种方法均需在35℃± 2℃培养48h。《化妆品安全技术规范》（2015版） 菌落总数的检验方法中，可在每100mL卵磷脂吐温 80营养琼脂中加入1mL 0.5%TTC溶液[1]。笔者通过
60 2019年第3期
2019年第3期
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唑等，化学式C19H15ClN4[2]，分析纯，国药集团化学 试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS，0.03mol/L， pH7.2），自配；标准硬水（硬度342mg/L），自 配；营养琼脂培养基，生化试剂，北京路桥技术有 限公司。
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谷爱军 于 文 （西安开米股份有限公司，陕西 西安，710075）
摘 要：本文论述了以2,3,5-三苯基氯化四氮唑（简称TTC）作为指示剂，避光灭菌后添加到营养琼脂 中制成TTC显色培养基。通过悬液定量法，对大肠埃希菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）进行抑菌试验，仅需24h即可得出结果，比现有标准要求的48h观察结果大大缩短了时间。本研究建 立的方法简便快捷，检测结果稳定可靠。 关键词：氯化三苯基四氮唑；抑菌；快速检测 中图分类号：TQ649.4 文献标识码：Ａ 文章编号：1672—2701（2019）03—60—05
由表1可知：A瓶和B瓶菌落回收数，与营养琼 脂对照组的相对偏差均＜10%，而C瓶外观呈现红褐 色，培养的阳性菌回收菌数与对照组有明显差异。 因此，本实验选择以A瓶显色培养基的制备方法，
三种灭菌方式
营养琼脂对照 A瓶 B瓶 C瓶
表1 不同的灭菌方式对TTC指示剂的影响
大肠埃希菌平均 回收菌数103 相对偏差%
由表2可知：含0.01mg/mL、0.02mg/mL、 0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mLTTC营养琼 脂培养基都对大肠杆菌均无抑制现象；但对金黄色 葡萄球菌显色均敏感，当TTC浓度大于0.02mg/mL
时，平皿的回收菌数与营养琼脂对照组比较相对偏 差略大，有一定的抑制现象，而且浓度越高，抑菌 作用越明显。可能与革兰氏阳性菌细胞壁上肽聚糖 和磷壁酸含量高，而革兰氏阴性菌肽聚糖和磷壁 酸含量少，此外，还有脂蛋白、外膜、脂多糖等 结构的不同而导致对TCC敏感性不同[4]。 最终选择 0.02mg/mL的TTC作为显色剂，既保证菌落良好的 显色效果，且不抑制细菌的生长。 2.5 不同色素对含0.02mg /mL TTC显色培养基的 影响
配制含TTC系列梯度的营养琼脂5瓶，各瓶 含TTC的浓度依次为0.01mg /mL、0.02mg /mL、 0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL。吸取0.1mL 菌悬液，加入到含5.0mLPBS的试管中，迅速混匀； 取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS试管中，吸取样液 1mL置于灭菌平板内（做适当稀释后，取其中2～3 个稀释度的稀释液），分别用含TTC系列梯度的营 养琼脂倾注5个平皿，充分混合均匀，待琼脂凝固后 翻转平皿，置 36℃±1℃培养箱内培养 48h±2h， 同时做不加TTC的营养琼脂对照及空白对照，以 30～300 cfu/mL菌落生长数计数平板，各组测得的 回收菌数见表2。
2.2 测试方法 按照QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果
的评价方法》抑菌率检测方法进行测试，计算回收 菌落数。 2.3 不同的灭菌方式对TTC的影响
配制0.1%TTC溶液500mL，分装于螺口玻璃 瓶中。A瓶：TTC溶液单独避光高压灭菌后，吸取 1.0mL，加入至已灭菌并冷却至50℃左右的100mL 营养琼脂中，混合；B瓶：TTC溶液采用0.45mm微 孔滤膜过滤除菌，吸取1.0mL，加入至已灭菌并冷 却至50℃左右的100mL营养琼脂中，混合；C瓶： 吸取1.0mL TTC溶液，于100m琼脂中混匀后121℃ 高压灭菌15min。
研究无色、无味的氯化三苯四氮唑（简称TTC）作 为指示剂，应用在抑菌试验测试中，期望能建立快 速测定日化产品抑菌效果评价的方法，以提高配方 开发的效率。
1 实验试剂及设备 1.1 主要试剂
2,3,5—三苯基氯化四氮唑，又称氯化三苯基四 氮唑 [ triphenyltet 2razolium chloride (TTC) ]、红四
试验菌株为金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、 大肠埃希菌（ATCC 25922），中国普通微生物菌种 保藏管理中心。 1.2 实验设备
恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；涡旋 仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；恒温生化 培养箱，上海一恒科技仪器有限公司；TYJ-2A菌落 计数器，上海宏汇电器厂；生物安全柜，型号BSC1100II A2-x，济南鑫贝西生物技术有限公司。 1.3 试验用日化产品
吸取0.1mL菌悬液，加入到含5.0mL PBS的试管 中，迅速混匀后，取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS 试管中（做适当稀释，取其中2～3个稀释度的稀释 液），吸取0.5mL置于灭菌平板内，分别倾注A瓶、 B瓶、C瓶及营养琼脂培养基各2个平皿，摇匀待冷 却后翻转平皿至36℃±1℃培养48h，以营养琼脂培 养的回收菌数作为对照，以平板菌落数在30～300 计数，各组测得的回收菌数见表1。
采购于大型超市，标贴宣称具有抑菌功能的洗 手液、洗衣液、餐具净等产品。
2 实验部分 2.1 菌悬液的配制
按照QB/T 2738-2012方法，无菌操作取金黄 色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠埃希菌（ATCC 25922）五代的24h新鲜培养物，分别制备阳性菌悬 液， 要求浓度为：取0.1mL滴入5.0mL PBS液内， 回收菌数在1×104～9×104cfu/mL [3]。
金黄色葡
54.5
0.92
46
52
3.7
42
38
29.63
34
相对偏差%
/ 0 8.69 26.09
中国洗涤用品工业杂志《工业与公共设施清洁》 61
技术圆桌
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即TTC经单独高压灭菌再与50℃营养琼脂混匀的方 式进行后续试验。 2.4 不同浓度TTC对阳性菌的影响
目前，洗涤剂抑菌性能测试方法主要为GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》、 QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价 方法》和卫法监发[2002]282号 《消毒技术规范》 [2002年版]。采用悬液法对金黄色葡萄球菌和大肠 杆菌进行抑菌性能测定时，三种方法均需在35℃± 2℃培养48h。《化妆品安全技术规范》（2015版） 菌落总数的检验方法中，可在每100mL卵磷脂吐温 80营养琼脂中加入1mL 0.5%TTC溶液[1]。笔者通过
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唑等，化学式C19H15ClN4[2]，分析纯，国药集团化学 试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS，0.03mol/L， pH7.2），自配；标准硬水（硬度342mg/L），自 配；营养琼脂培养基，生化试剂，北京路桥技术有 限公司。