代谢工程

6、直接克隆抗生素产生菌DNA大片段 到非产生菌中
•
完整的放线紫红素生物合成基因克隆到 一个非产生菌小小链霉菌，结果小小链霉菌 产生了放线紫红素。红霉素，土霉素的生物 合成基因也用此法克隆成功。
七、利用已克隆的生物合成基因为探针 克隆同源基因
•
如用此策略克隆了milbemycin的生物合成 基因。首先用actⅢ基因为探针与milbemycin 和榴菌素产生菌的基因文库杂交，获得了 actIII的同源基因，将这些来自milbemycin和 榴菌素产生菌的同源DNA片段转入天蓝色链
• 七十年代末在专性好氧菌透明颤菌中发现了血红蛋白 （VHb）。对VHb的功能研究表明，它作为一个氧气携带者， 能促进氧气扩散到细胞未端氧化酶上，使细胞在贫氧状态下 也能很好生长。
•
人们试图从中克隆血红蛋白基因Vgb并研究它对其它微 生物生长的影响。研究Vgb基因的导入对重组蛋白表达量和 微生物发酵代谢产物产量的影响。
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2、阻断支路代谢，增加有效组份含量
•
结合诱变育种，原生质体融合和基因 工程技术对已知抗生素产生菌的遗传操作， 以提高有效组份的含量，抑制无效成份的 产生，一个最成功的例子是抗虫抗生素阿 弗米丁基因工程菌的构建。
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3、引入血红蛋白基因增加抗生素产量
•
• •
• 克隆土霉素的抗性基因（OTCr）： •
将土霉素产生菌Streptomgces rimosces M15883染色 体DNA的PstI和BgIII片段分别克隆到载体质粒pRF212和 pRF234的PstI和BgIII位点，转化OTCS突变株，筛选后获 得了2个OTCr基因（OtrA,OtrB）,以这两个OTCr基因为探针 去检测基因库，分别获得了一个阳性菌落，从中分离的 DNA片段能与几个土霉素阻断突变株互补。该法克隆到的 生物合成基因还包括红霉素，二丙胺磷，嘌呤霉素等。
3 代谢流量分析技术的发展
代谢流量分析（ metabolic flux analysis）
是一种研究胞内代谢的方法，根据已有的代 谢网络的信息建立胞内主要反应的化学计量 模型和胞内代谢产物的质量平衡，以实际测 得的分泌到胞外的代谢中间产物的浓度，来
推算代谢流量。
3 代谢流定量分析技术的发展
这种分析方法的基础是拟稳态假设，
1996
第一届代谢工程大会，“代谢 工程——让细胞为人类工作”
进一步确立地位 和研究方向
二、代谢工程的理论基础
（一）基本概念
（二）代谢工程要解决的问题
（三）代谢工程的研究对象、目标与依据
（四）代谢工程的实质
（五）代谢工程理论涉及的内容
（一）基本概念 1. 微生物细胞能为其自身提供代谢能
每个微生物细胞都具有能量转换机构，这种机 构可把其它形式的能量转换成能被其自身直接 使用的能量 （ 如 ATP，GTP 和储存在膜上的 质子运动势 ΔP ），暂且把它们称为代谢能。
即假设在产物形成速率最大的阶段各种代 谢中间物的胞内浓度变化速率为零。根据 质量平衡，由 n 个中间代谢物即可得到 n 个关于速率的方程，通过测定胞外代谢 产物的浓度，计算未知途径的流量。
4 生化工程在线检测和建模方法的发展 色谱、质谱、红外等在线检测手段， 以及生物传感技术的发展，可为发酵在 线检测和反馈提供可靠的原始数据。建 模方法也有发展。
微生物生理学、遗传育种学和生物化学的
发展，使得人类可以用代谢途径操作的手段来
改造微生物以获得期望的性质，如在氨基酸 （谷氨酸）、抗生素、溶剂和维生素的发酵法 生产中，都可以找到采用这个路子实现人类理 想的一些突出的例子。代谢控制发酵和育种得
以出现和发展。
这些方法主要依赖于用化学诱变剂处
理微生物，并用进行设计的筛选技术来检
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2.基因工程在生产生物小分子中的应用
维生素、氨基酸 抗生素
维生素C、苏氨酸、 组氨酸、精氨酸、异 亮氨酸
头孢菌素C、新霉素、 卡那霉素、阿维菌素、
• 第二节、抗生素合成基因的克隆 • （菌株未测序，基因功能不清） • 链霉菌的基因组大约8×106bp。第一次成 功地利用链霉菌的载体宿主系统克隆到抗 生素生物合成基因以来，现已成功克隆到 至少50个抗生素生物合成基因。 • 发现：抗生素的生物合成基因成簇，抗性 基因通常是基因簇的一部分；一些相关生 物合成途径的基因相互杂交，显示出很强 的同源性
•
这一方法可能对低产菌株有效，而对工业高产菌株改良 意义不大。 调节基因在抗生素的生物合成中也起很重要作用，增
加调节基因的基因量也能大幅度提高抗生素产量。
第八章
代谢工程
一、代谢工程的产生及沿革 二、代谢工程的理论基础 三、代谢工程的研究概要 四、代谢工程的研究技术与工具 五、代谢工程的研究策略 六、代谢工程的重要应用和发展前景
霉菌的actIII突变株，产生了类似或同样的放
线紫红素色素。
•
第三节、利用基因工程技术改良微生物 药物生产菌种
• 1、解除限速步骤，提高抗生素产量 • 控制这种限速步骤的酶基因克隆出来，然后通过合适的 载体克隆到原产生菌中，获得限速步骤酶水平的增加而提 高产量。 • 生物合成头霉素C的研究过程中发现，控制从初级代 谢产物赖氨酸转向次级代谢中间产物，即头霉素C的前体 α-氨基己二酸的流通量的赖氨酸ε-氨基转移酶的活力，则 必定能提高α-氨基己二酸合成前体的流通量。基于以上设 想，摇瓶中的抗生素产量为受体株的5倍。
The function of Bacillus subtilis glnA gene in Escherichia coli
基 因 工 程 的 局 限 Fig. 1 Results of recombinant strain trans formed products(3h and7h) and the enzyme transformed products (15min and 30min)
在代谢能的直接支撑下，活细胞才能维持其高
度有序的状态。
能量转换机构
细胞质膜 线粒体内膜
电子传递链和ATP酶
能量产生
载体系统
跨膜的质子回路
NADH，FADH2
2.生化反应途径和代谢途径
一系列按序进行的生物化学反应
构成生化反应途径；若这条途径在活
细胞里运行，则为代谢途径。
3.生化反应网络和代谢网络
3、利用突变克隆分析生物合成基因族
• 突变克隆技术是指外源基因借助载体进入 抗生素的产生菌中，如果外源基因与抗生 素产生菌的生物合成基因有同源性，就有 可能与产生菌的转录单位杂交，造成该基 因的转录中断而影响其表达，以此确定克 隆基因的性质。
4、克隆抗性基因并分析连锁的生物合成基因
•
对已经克隆到的生物合成基因研究表明， 生物合成基因成簇并与抗性基因连锁，为人 们提供了这样一种设想：即用敏感菌株（标 准菌或产生菌突变株）为宿主，克隆抗性基 因 大片段 分析与之连锁的生物合成基因 小片段 可利用它为探针来克隆同源的 DNA片段。
第七章 基因工程
• 第一节 微生物工程菌的构建及应用
微生物工程菌的构建
基因工程在生产生物小分子中的应用
1. 微生物工程菌的构建
目的基因 表达载体的 构建与筛选
基因 重组
DNA连接方式： 粘性末端 平末端 人工接头 同聚物加尾 影响连接的因素： 连接酶的量 作用温度与时间 底物浓度
转化、筛 选和鉴定
代谢工程重要事件纪录
时间 1956 事件 用野生的生物素缺陷型菌株发 酵生产谷氨酸 意义 代谢控制发酵得 以出现和发展 代谢工程技术的 第一应用实例 代谢工程作为一 门确定的独立学 科发展的转折点
恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌 1974 中引入稳定质粒，提高降解樟 脑和萘等有机物能力 发表“Toward a Science of 1991 Metabolic Engineering”，第一次 用代谢工程这一术语
通过表达载体导入
外源基因不带间 隔序列 利用原核细胞的 基因文库的建立和基 强启动子和SD序 因分离 列等调控元件 基因的化学合成 连接后形成正确 的开放阅读框架 PCR或RT-PCR 利用宿主菌的调 控系统 非融合型pBV220 融合型pGEX系统 分泌型pinβ系统 鸟枪法分离基因
重组基因导入宿 主细胞：氯化钙 转化法和电穿孔 法 转化子的筛选与 鉴定：抗药性； a-互补；限制性 内切酶酶切图谱； PCR法；核苷酸 序列测定等
一、代谢工程的产生及沿革
1 半个多世纪微生物生理与育种知识的累积 2 基因工程理论和技术的成熟 3 代谢流定量分析技术的发展 4 生化工程在线检测和建模方法的发展
代谢控制 发酵
基因工程理 论和技术
代谢工程 基础
代谢流定量 分析技术
生化工程在 线检测和建 模方法
1 微生物生理与育种知识的指导
半个多世纪微生物生理与育种知识的累积
1、将目的基因克隆到标准宿主菌中，然后检测个 别基因产物
• 优：不需要了解抗生素生物合成途径的遗 传信息。
2、克隆与阻断突变株互补的基因
抗生素生物合成途径通常涉及到10~30个酶反应 骤，如果通过诱变方法使其中的一个酶失活，而使 其不能合成最终产物，这种突变株称为阻断突变 株。
• 成功条件：①获得抗生素生物合成途径被阻 断的一系列突变株。 • ②建立以阻断突变株为宿主的载体 宿主系统。
Fig.4 glnA gene expression in the strain containing glnA was 238 folds higher than that of the strain with empty pMD19 plasmid.
Fig.5. SDS-PAGE of the protein expression in the recombinant strains M.Marker; 1. E.coli DH5α; 2. E.coliDH5α(pMD19-glnA); 3 E.coli DH5α(pMD19)
• 但通过VHb基因的克隆提高抗生素的产量目前可能仅限于那 些在发酵中非常好氧而设备条件不能满足其要求的抗生素产 生菌。
4、引入抗性基因和调节基因，提高抗 生素产量
• 抗生素的产生与菌种对自身抗生素的耐性紧密有关。 因此，利用高拷贝质粒的基因量效应，增加菌种对自身抗 生素的抗性，有可能增加抗生素的产量。 • • •
生化反应途径并不是孤立的，而是
按生物化学规律汇成生化反应网络；代
谢途径与跨膜输送系统按代谢规律汇成
（物质）代谢网络。
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3.代谢网络的联网问题
代谢中间化合物都在代谢网络上，有些外源有
机化合物虽然不在代谢网络上但仍有可能与代谢网 络“联网” （把指定的化合物连接到代谢网络上 去）。 “联网”可以用化学或生物学方法（ 含DNA重组技
“逆行的代谢工程” 为代谢网络的构建和完
善，以及代谢工程的进展提供了大量的生理
学和遗传学信息。
2 基因工程理论和技术的成熟
。DNA重组的分子生物学技术的开发和应用， 把代谢操作引进了一个新的层面，能对代谢 途径的指定酶反应进行精确的修饰，因此， 有可能构建精心设计的遗传背景。
2015-1-18
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Fig. 2 Capillary electrophoresis results of standard sample and the test ample
Fig.3 1H nuclear magnetic resonance spectrum of the transformed product.
出已获得优良性状的突变株。
尽管这种方法已被广泛地接受并已取得好
的效果，但人们对突变株的遗传和代谢性
状的精确变化，知之甚少。
但我们已能根据随机诱变后从突变株中筛
得的高产突变株遗传标记，及这些突变株的优 良性质的实验结果，来推测代谢途径及其控制 的机制。
这是一种“逆行的代谢工程”（reverse
metabolic engineering）。
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5、用人工合成的寡核苷酸探测基因库
• 由于链霉菌DNA中G+C的比例很高，因此 链霉菌基因对密码子利用有明显的不随机 性，即密码子第三位有90%以上常为G和C。 因此在分析某一抗生素生物合成酶的部分 氨基酸顺序后，就能设计出较低程度兼并 性的寡核苷酸顺序，经人工合成这段顺序 后就可用作探针从基因库中钓出所需的克 隆子。