代谢工程(幻灯片)
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
13
节点：网络分流处的代谢产物称为节点。 柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割 率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈 抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。 强刚性节点：是指由节点流向某一分支或某些分支 的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的 反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用 所致。 弱刚性节点：是指介于前两者之间，由该节点流向 各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶 活较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑 制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物 的产率。 柔性及弱刚性节点是代谢设计的主要对象
24
(3) 效果分析 很多研究结果表明，一次性的代谢设 计和基因操作往往并不能达到实际生产所 要求的产量、速率或浓度，因为大部分实 验涉及的只是与单一代谢途径有关的基因、 操纵子或基因簇的改变。然而通过对新途 径进行全面的效果分析，根据由初步代谢 操作所构建出来的细胞所表现出的限制与 缺陷，可以作为新一轮实验的改进目标， 如此反复进行遗传操作即可获得优良物种。
27
(3) 基因操作技术
在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可 以归结为基因水平上的操作。这个过程涉及几 乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术， 如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化， 基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。 代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前 提就是外源基因在所有生物物种（包括人体） 中转化和表达的可行性，而这种可行性又在很 大程度上依赖于各种载体和基因表达调控元件 的开发。
3
4
代谢工程要解决的问题 目前代谢工程要解决的主要问题是改变某 些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质在不 同途径中的流量分布。 典型目标是修饰初级次级代谢，将碳架物 质流导入目的产物的理想载流途径以获得产物 的最大转化率。
5
主要应用方向
(1) 提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量； (2) 改造细胞现存的代谢途径，使其合成新产物， 这种新产物可以是中间代谢产物或修饰型的最 终产物； (3)对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全新 的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成的新 产物； (4)优化细胞的生物学特性，如：生长速率、极 端环境条件和耐受性等。
28
5 代谢改造思路
代谢工程研究的重点在于改造代谢网络， 以便生产特定目的代谢产物或具有过量生 产能力的工程菌应用于工业生产。根据微 生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、 扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方 法。
29Hale Waihona Puke Baidu
(1)改变代谢途径方法 加速限速反应 增加限速酶的表达量，来提高产物 产率。然而限速酶反应的改变可能会给 整个代谢网络带来负面影响。 改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点某一分支代谢途径 酶活力，使其在与其它的分支代谢途径 的竞争中占据优势，从而提高目的代谢 产物的产量。
6
代谢工程研究思路
解析反应体系，找到能反映细胞生理状态的主要 参数； 如何利用这些信息组织一个代谢网络的控制设计， 并确定合理靶点以修饰构建特定的物种； 怎样正确评估基因或酶的真实修饰效果，以实施 新一轮的代谢网络修饰直到确立最佳状态，从而取代 普通的定向靶点筛选程序； 代谢工程关注的是代谢途径的组合而单一的反应， 因此必须考察完整的生化反应网络，重视代谢网络和 目标产物的热力学可行性，代谢流及其控制。 代谢工程最为突出的特征是强调生化反应途径与 代谢流及其体内条件的控制相关联。
14
如果代谢网络中各节点同等重要，即对产物 的产量具有相近的影响，则这类代谢网络称 为依赖型代谢网络。依赖型代谢网络的存在 会给代谢工程的实施带来很大的困难。 如果代谢网络的主节点不集中，则可以通过 对代谢的修饰影响目的产物的产量，这类网 络为独立型网络。
15
2 代谢分析
代谢分析是代谢工程的重要组成部分。它 涉及代谢流的定量和定向、研究细胞内代 谢物浓度的反应工程方法以及细胞内稳态 流分析等。 代谢流分析是代谢分析的一个重要手段。 它假定细胞内的物质、能量处于拟稳态， 通过测定胞外物质浓度，再根据物料平衡 计算细胞内的代谢流。
12
1 代谢网络理论
代谢网络理论把细胞的生化反应以网络 整体而不是孤立地考虑。细胞代谢的网 络由上万种酶催化的系列反应系统、膜 传递系统、信号传递系统组成，并且既 受精密调节，又彼此互相协调。 各种代谢都不是孤立进行的，而是相互 作用、相互转化、相互制约的一套完整、 统一、灵敏的调节系统。
7
代谢工程的首要工作就是利用在广泛而 深入的研究中获得的技术信息进行组合 设计。 将代谢流的定量分析方法与代谢流控制 的分子生物学技术结合在一起，系统、 合理地修饰生物细胞的遗传性状，是代 谢工程的基础。
8
系统研究代谢流及其控制机制包括以下三 大基本步骤 ①建立一种能尽可能多的观察代谢网络并测 定其流量的方法。 为了做到这一点，通常从测定细胞外代谢 产物的浓度入手进行简单的物料平衡。由于一 个代谢途径的代谢流并不等于该途径中一个或 多个酶的活性，所以酶法分析并不能提供代谢 网络真正的代谢流信息，除非相应的酶在体外 分析条件下存在并具有活性。因此，在代谢分 析中，酶法分析常会错误地显示相似数量级的 代谢流，从而导致产生不正确的结论。
26
(2) 分析技术 在获得大量生化反应基本数据的基 础上，采用化学计量学、分子反应动力学 和化学 程学的研究方法并结合先进的计算 机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的 动态特征与控制机理，以确定代谢改造的 思路。这些分析手段包括能准确测定细胞 内代谢网络流的稳态法、展示代谢流控制 过程的扰动法、简化复杂代等提出的的组 合法以及代谢网络优化技术等。
23
(2)基因操作 利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络 的核心是在分子水平对基因簇进行遗传操作， 其中最典型的形式包括对靶基因或基因簇的克 隆、表达、修饰、敲除、调控、构建特殊的基 因转移系统以及重组基因在目的细胞染色体上 的稳定整合。 在代谢工程的一些应用实例中，代谢流的 控制和分析也可绕过基因操作，直接通过发酵 和细胞培养的工艺和过程参数控制提高细胞代 谢流，并强制使代谢流流向期望的目标产物。
限制活性 的因素 鉴别表型 基因 菌种改造
32
第二章 代谢工程基本理论
1 有关术语
(1) 生物基质要素:构成生物基质大分子池的一类物 质，包括RNA、DNA、 蛋白质、脂质和碳水化合 物等。 (2)途径是指催化总的代谢物的转化、信息传递和其 他细胞功能的酶促反应的集合。 (3)代谢网络:分解代谢途径、合成代谢途径和膜输送 体系的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络包 括物质代谢网络和能量代谢网络。 (4) 通量: 物质或信息通过途径被加工的速率。
33
(5) 代谢主流：在一定的培养条件下，代谢 物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢 流叫做该条件下的代谢主流。 代谢途 径的延伸和剪接都可能改变代 谢主流，从而实现新基质的利用和新产品的 开发。代谢主流的流量测定是代谢工程的重 要组成部分。 (6) 载流途径：代谢主流流经的代谢途径为 主要载流途径，简称载流途径。在代谢工程 领域，是指碳流在代谢网络中通过的主要途 径，即生产所需产物期间让碳流相对集中流 向产物合成的途径。
代谢工程
1
一、代谢工程概述
细胞的生命活动是通过活细胞和细胞 群的代谢网络进行的，而代谢网络是由一 系列酶的级联化学反应以特异性的膜转化 系统构成。 对人类的应用而言，活细胞自身固有 的代谢网络的遗传特性并不是最佳的，为 了积累大量的某种代谢产物，就必须要打 破并重建细胞的代谢平衡。
2
代谢工程概念演变 代谢工程又称途径工程，最早由美国加 州理工学院化学工程系教授Baily J.E. 于1991 年提出的。 随后Stephanopoulos 认为，代谢工程是一 种提高菌体生物量功代谢物产量的理性化方 法。 Cameron 认为代谢工程是动用重组DNA 技术有目的地改造中间代谢的方法。 现在的定义：通过某些特定生化反应的 修饰来定向改善细胞的特性功运用重组DNA 技术来创造新的化合物。
25
4 代谢工程的研究手段
代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工 程等领域的最新成果。因此，在研究方法和技 术方面主要有下列三大常用手段： (1)检测技术 常规的化学和生物化学检测手段都可用于 代谢工程的研究。这包括：体内确定代谢流的 物料平衡和同位素标记示踪方法；表征酶促反 应进程和性质的酶促反应动力学分析方法;测定 同位素富集和关键代谢物相对分子质量分布的 光谱学方法(核磁共振、质谱、液相色谱分析和 气相色谱分析等)；生物传感器技术。根据这些 检测信息可以判断和描述代谢流的基本状态， 并为细胞的代谢流及其控制分析提供翔实可靠 的原始数据。
17
代谢中间产物作为生物合成的前体及 能量供应者，转向终产物的碳流的大小将 最终决定终产物的产率。中间代谢产物的 代谢流改变会受到细胞的抑制，并引起胞 内功能的严重改变。传统的代谢工程对中 间产物的生理作用考虑较少，从而使产率 远远达不到所计算的理论最大产率。
18
弹性系数和流量控制系数是代谢控制分 析研究的两个主要指标。 弹性系数揭示代谢物浓度变化对反应速 率的影响程度。 而流量控制系数则为单位酶变化量引起 的某分支稳态代谢流量的变化，用来衡 量某一步酶反应对整个反应体系的控制 程度。 这两个系数相互关联，可直接或间接测定。
10
③要系统分析代谢流扰动的结果。如果某 个代谢流的扰动对下游代谢流并未能造 成可观察的影响，那么就可以认为该处 的节点对上游的扰动是刚性的，相反则 成为柔性的。一般地，在刚性节点处， 不能通过改变上游酶活性来影响下游代 谢流。
11
二、代谢工程的研究内容
代谢工程涉及的主要内容包括：
①生物合成相关代谢调控和代谢网络理论； ②代谢流的定量分析； ③代谢网络的重新设计； ④中心代谢作用机理及相关代谢分析； ⑤基因操作。
16
放射性标记、同位素示踪等技术的应用使代谢流 分析更简单、方便。通过对细胞在不同情况(如改 变培养环境、去除抑制、增加或减少酶活等)的代 谢流分析，便可确定节点类型、确定最优途径、 估算基因改造的结果、计算最大理论产率等。对 于简单的反应系统，通过对所有的代谢网络的精 准分析及平衡计算就可以得到满意的结果。 但是，对于比较复杂的代谢系统，代谢流分 析就显得棘手。
9
②在代谢网络中施加一个已知的扰动，以 确定在系统松散之后达到新的稳态时的 代谢流。 常用的扰动方式包括启动子的诱导、 底物流加、特定碳源消除或物理因素变 化等。虽然任何有效的扰动对代谢流的 作用都是可以接受的，但扰动必须定位 于近邻途径节点的酶分子上。一种扰动 往往能提供多个节点上的相关信息，这 对于精确描述代谢网络控制结构所必需 的最小实验量是至关重要的。
19
细胞对于基质的吸收与产物的释放模型 及分析也是代谢工程的重要组成部分。 它包括物质转运过程的生化基础(如转运 蛋白机制、转运动力学、载体介导转运 中的能量偶连以及细胞转运活性的调节 等)、研究方法、过程控制(如生物工艺过 程中营养和吸收的关系、生物工艺过程 中产物的分泌控制、干扰代谢流的结合 以及转运过程的建模)等。
20
代谢工程基本过程
21
3 代谢工程的基本过程
(1)代谢分析与代谢设计 代谢工程的研究对象是代谢途径， 因此必须对代谢网络中的一些酶及产物 进行研究和分析。相对随机突变而言， 代谢工程的一个显著特点就是工作具有 定向性，因为它在修饰靶点选择、试验 设计以及数据分析方面占有绝对优势。
22
代谢分析与代谢设计对代谢工程的 成败起着关键作用，任何精细的靶点选 择都必须经得起细胞生理特性以及代谢 网络热力学平衡的检验。
30
(2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因， 从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物 和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌 能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗 的底物。 (3)转移或构建新的代谢途 通过转移代谢途径、构建新的代谢途 径等方法来实现。
31
三、代谢工程发展趋势
传统的代谢工程是以代谢网络理论为 基础，以代谢分析和代谢改造为主要手段。 代谢途径的复杂性给检测分析带来不少麻 年代末兴起的逆世纪烦，在某种程度上阻 碍了它的应用。 逆代谢工程
节点：网络分流处的代谢产物称为节点。 柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割 率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈 抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。 强刚性节点：是指由节点流向某一分支或某些分支 的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的 反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用 所致。 弱刚性节点：是指介于前两者之间，由该节点流向 各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶 活较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑 制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物 的产率。 柔性及弱刚性节点是代谢设计的主要对象
24
(3) 效果分析 很多研究结果表明，一次性的代谢设 计和基因操作往往并不能达到实际生产所 要求的产量、速率或浓度，因为大部分实 验涉及的只是与单一代谢途径有关的基因、 操纵子或基因簇的改变。然而通过对新途 径进行全面的效果分析，根据由初步代谢 操作所构建出来的细胞所表现出的限制与 缺陷，可以作为新一轮实验的改进目标， 如此反复进行遗传操作即可获得优良物种。
27
(3) 基因操作技术
在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可 以归结为基因水平上的操作。这个过程涉及几 乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术， 如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化， 基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。 代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前 提就是外源基因在所有生物物种（包括人体） 中转化和表达的可行性，而这种可行性又在很 大程度上依赖于各种载体和基因表达调控元件 的开发。
3
4
代谢工程要解决的问题 目前代谢工程要解决的主要问题是改变某 些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质在不 同途径中的流量分布。 典型目标是修饰初级次级代谢，将碳架物 质流导入目的产物的理想载流途径以获得产物 的最大转化率。
5
主要应用方向
(1) 提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量； (2) 改造细胞现存的代谢途径，使其合成新产物， 这种新产物可以是中间代谢产物或修饰型的最 终产物； (3)对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全新 的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成的新 产物； (4)优化细胞的生物学特性，如：生长速率、极 端环境条件和耐受性等。
28
5 代谢改造思路
代谢工程研究的重点在于改造代谢网络， 以便生产特定目的代谢产物或具有过量生 产能力的工程菌应用于工业生产。根据微 生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、 扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方 法。
29Hale Waihona Puke Baidu
(1)改变代谢途径方法 加速限速反应 增加限速酶的表达量，来提高产物 产率。然而限速酶反应的改变可能会给 整个代谢网络带来负面影响。 改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点某一分支代谢途径 酶活力，使其在与其它的分支代谢途径 的竞争中占据优势，从而提高目的代谢 产物的产量。
6
代谢工程研究思路
解析反应体系，找到能反映细胞生理状态的主要 参数； 如何利用这些信息组织一个代谢网络的控制设计， 并确定合理靶点以修饰构建特定的物种； 怎样正确评估基因或酶的真实修饰效果，以实施 新一轮的代谢网络修饰直到确立最佳状态，从而取代 普通的定向靶点筛选程序； 代谢工程关注的是代谢途径的组合而单一的反应， 因此必须考察完整的生化反应网络，重视代谢网络和 目标产物的热力学可行性，代谢流及其控制。 代谢工程最为突出的特征是强调生化反应途径与 代谢流及其体内条件的控制相关联。
14
如果代谢网络中各节点同等重要，即对产物 的产量具有相近的影响，则这类代谢网络称 为依赖型代谢网络。依赖型代谢网络的存在 会给代谢工程的实施带来很大的困难。 如果代谢网络的主节点不集中，则可以通过 对代谢的修饰影响目的产物的产量，这类网 络为独立型网络。
15
2 代谢分析
代谢分析是代谢工程的重要组成部分。它 涉及代谢流的定量和定向、研究细胞内代 谢物浓度的反应工程方法以及细胞内稳态 流分析等。 代谢流分析是代谢分析的一个重要手段。 它假定细胞内的物质、能量处于拟稳态， 通过测定胞外物质浓度，再根据物料平衡 计算细胞内的代谢流。
12
1 代谢网络理论
代谢网络理论把细胞的生化反应以网络 整体而不是孤立地考虑。细胞代谢的网 络由上万种酶催化的系列反应系统、膜 传递系统、信号传递系统组成，并且既 受精密调节，又彼此互相协调。 各种代谢都不是孤立进行的，而是相互 作用、相互转化、相互制约的一套完整、 统一、灵敏的调节系统。
7
代谢工程的首要工作就是利用在广泛而 深入的研究中获得的技术信息进行组合 设计。 将代谢流的定量分析方法与代谢流控制 的分子生物学技术结合在一起，系统、 合理地修饰生物细胞的遗传性状，是代 谢工程的基础。
8
系统研究代谢流及其控制机制包括以下三 大基本步骤 ①建立一种能尽可能多的观察代谢网络并测 定其流量的方法。 为了做到这一点，通常从测定细胞外代谢 产物的浓度入手进行简单的物料平衡。由于一 个代谢途径的代谢流并不等于该途径中一个或 多个酶的活性，所以酶法分析并不能提供代谢 网络真正的代谢流信息，除非相应的酶在体外 分析条件下存在并具有活性。因此，在代谢分 析中，酶法分析常会错误地显示相似数量级的 代谢流，从而导致产生不正确的结论。
26
(2) 分析技术 在获得大量生化反应基本数据的基 础上，采用化学计量学、分子反应动力学 和化学 程学的研究方法并结合先进的计算 机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的 动态特征与控制机理，以确定代谢改造的 思路。这些分析手段包括能准确测定细胞 内代谢网络流的稳态法、展示代谢流控制 过程的扰动法、简化复杂代等提出的的组 合法以及代谢网络优化技术等。
23
(2)基因操作 利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络 的核心是在分子水平对基因簇进行遗传操作， 其中最典型的形式包括对靶基因或基因簇的克 隆、表达、修饰、敲除、调控、构建特殊的基 因转移系统以及重组基因在目的细胞染色体上 的稳定整合。 在代谢工程的一些应用实例中，代谢流的 控制和分析也可绕过基因操作，直接通过发酵 和细胞培养的工艺和过程参数控制提高细胞代 谢流，并强制使代谢流流向期望的目标产物。
限制活性 的因素 鉴别表型 基因 菌种改造
32
第二章 代谢工程基本理论
1 有关术语
(1) 生物基质要素:构成生物基质大分子池的一类物 质，包括RNA、DNA、 蛋白质、脂质和碳水化合 物等。 (2)途径是指催化总的代谢物的转化、信息传递和其 他细胞功能的酶促反应的集合。 (3)代谢网络:分解代谢途径、合成代谢途径和膜输送 体系的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络包 括物质代谢网络和能量代谢网络。 (4) 通量: 物质或信息通过途径被加工的速率。
33
(5) 代谢主流：在一定的培养条件下，代谢 物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢 流叫做该条件下的代谢主流。 代谢途 径的延伸和剪接都可能改变代 谢主流，从而实现新基质的利用和新产品的 开发。代谢主流的流量测定是代谢工程的重 要组成部分。 (6) 载流途径：代谢主流流经的代谢途径为 主要载流途径，简称载流途径。在代谢工程 领域，是指碳流在代谢网络中通过的主要途 径，即生产所需产物期间让碳流相对集中流 向产物合成的途径。
代谢工程
1
一、代谢工程概述
细胞的生命活动是通过活细胞和细胞 群的代谢网络进行的，而代谢网络是由一 系列酶的级联化学反应以特异性的膜转化 系统构成。 对人类的应用而言，活细胞自身固有 的代谢网络的遗传特性并不是最佳的，为 了积累大量的某种代谢产物，就必须要打 破并重建细胞的代谢平衡。
2
代谢工程概念演变 代谢工程又称途径工程，最早由美国加 州理工学院化学工程系教授Baily J.E. 于1991 年提出的。 随后Stephanopoulos 认为，代谢工程是一 种提高菌体生物量功代谢物产量的理性化方 法。 Cameron 认为代谢工程是动用重组DNA 技术有目的地改造中间代谢的方法。 现在的定义：通过某些特定生化反应的 修饰来定向改善细胞的特性功运用重组DNA 技术来创造新的化合物。
25
4 代谢工程的研究手段
代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工 程等领域的最新成果。因此，在研究方法和技 术方面主要有下列三大常用手段： (1)检测技术 常规的化学和生物化学检测手段都可用于 代谢工程的研究。这包括：体内确定代谢流的 物料平衡和同位素标记示踪方法；表征酶促反 应进程和性质的酶促反应动力学分析方法;测定 同位素富集和关键代谢物相对分子质量分布的 光谱学方法(核磁共振、质谱、液相色谱分析和 气相色谱分析等)；生物传感器技术。根据这些 检测信息可以判断和描述代谢流的基本状态， 并为细胞的代谢流及其控制分析提供翔实可靠 的原始数据。
17
代谢中间产物作为生物合成的前体及 能量供应者，转向终产物的碳流的大小将 最终决定终产物的产率。中间代谢产物的 代谢流改变会受到细胞的抑制，并引起胞 内功能的严重改变。传统的代谢工程对中 间产物的生理作用考虑较少，从而使产率 远远达不到所计算的理论最大产率。
18
弹性系数和流量控制系数是代谢控制分 析研究的两个主要指标。 弹性系数揭示代谢物浓度变化对反应速 率的影响程度。 而流量控制系数则为单位酶变化量引起 的某分支稳态代谢流量的变化，用来衡 量某一步酶反应对整个反应体系的控制 程度。 这两个系数相互关联，可直接或间接测定。
10
③要系统分析代谢流扰动的结果。如果某 个代谢流的扰动对下游代谢流并未能造 成可观察的影响，那么就可以认为该处 的节点对上游的扰动是刚性的，相反则 成为柔性的。一般地，在刚性节点处， 不能通过改变上游酶活性来影响下游代 谢流。
11
二、代谢工程的研究内容
代谢工程涉及的主要内容包括：
①生物合成相关代谢调控和代谢网络理论； ②代谢流的定量分析； ③代谢网络的重新设计； ④中心代谢作用机理及相关代谢分析； ⑤基因操作。
16
放射性标记、同位素示踪等技术的应用使代谢流 分析更简单、方便。通过对细胞在不同情况(如改 变培养环境、去除抑制、增加或减少酶活等)的代 谢流分析，便可确定节点类型、确定最优途径、 估算基因改造的结果、计算最大理论产率等。对 于简单的反应系统，通过对所有的代谢网络的精 准分析及平衡计算就可以得到满意的结果。 但是，对于比较复杂的代谢系统，代谢流分 析就显得棘手。
9
②在代谢网络中施加一个已知的扰动，以 确定在系统松散之后达到新的稳态时的 代谢流。 常用的扰动方式包括启动子的诱导、 底物流加、特定碳源消除或物理因素变 化等。虽然任何有效的扰动对代谢流的 作用都是可以接受的，但扰动必须定位 于近邻途径节点的酶分子上。一种扰动 往往能提供多个节点上的相关信息，这 对于精确描述代谢网络控制结构所必需 的最小实验量是至关重要的。
19
细胞对于基质的吸收与产物的释放模型 及分析也是代谢工程的重要组成部分。 它包括物质转运过程的生化基础(如转运 蛋白机制、转运动力学、载体介导转运 中的能量偶连以及细胞转运活性的调节 等)、研究方法、过程控制(如生物工艺过 程中营养和吸收的关系、生物工艺过程 中产物的分泌控制、干扰代谢流的结合 以及转运过程的建模)等。
20
代谢工程基本过程
21
3 代谢工程的基本过程
(1)代谢分析与代谢设计 代谢工程的研究对象是代谢途径， 因此必须对代谢网络中的一些酶及产物 进行研究和分析。相对随机突变而言， 代谢工程的一个显著特点就是工作具有 定向性，因为它在修饰靶点选择、试验 设计以及数据分析方面占有绝对优势。
22
代谢分析与代谢设计对代谢工程的 成败起着关键作用，任何精细的靶点选 择都必须经得起细胞生理特性以及代谢 网络热力学平衡的检验。
30
(2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因， 从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物 和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌 能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗 的底物。 (3)转移或构建新的代谢途 通过转移代谢途径、构建新的代谢途 径等方法来实现。
31
三、代谢工程发展趋势
传统的代谢工程是以代谢网络理论为 基础，以代谢分析和代谢改造为主要手段。 代谢途径的复杂性给检测分析带来不少麻 年代末兴起的逆世纪烦，在某种程度上阻 碍了它的应用。 逆代谢工程