核酸和蛋白质分析技术

变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性
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pfu DNA 聚合酶
用于核苷酸多态性的分析
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琼脂糖凝胶电泳的基本过程
： 材料 电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶
液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳 时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。
基本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并 上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时 间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶 成像系统紫外灯下观察并照相保存结果
Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学 奖；
目的: 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。
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（一）原理：
双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA －－－变性 ↓
与一对寡核苷酸引物（5’， 3’）降低温度退火 DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火
影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：
1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液
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琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成
PCR产物的琼脂 糖电泳
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聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析
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二 核酸杂交技术
（一）Southern Blot 原理：
将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移 到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记 物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针 互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针 洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检 的片段及其相对大小。
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第一节 核酸分析技术
讲述内容： 1、核酸电泳 2、杂交技术 3、PCR技术 4、基因芯片
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一、核 酸 电 泳
（一）DNA的凝胶电泳
凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开， 能容纳相对大量的DNA
特殊的凝胶电泳
倒转电场凝胶电泳（FIGE）：用于分 离分子量10～2000kb的DNA分子；
钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）：可 分离大于107bp的DNA分子
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（二）RNA 电 泳
基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是， 因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此 必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所 有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严 格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外， 因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳 结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常 用的变性剂为甲醛和戊二醛。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有 点突变、扩增重排等。
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Southern Blot 操作步骤：
DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色
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（二）Northern Blot
注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套
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不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V )
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
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三 PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作 为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的 多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增 产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增 倍数可达106。
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（三）探针标记技术
1 标记物：放射性和非放射性两种
放射性： 32P、35S和3H
非放射性：生物素、地高辛素、荧光素
2、标记方法
（1）切口平移法 （2）随机引物法 （3）末端标记法 （4）单链DNA探针标记 （5）寡核苷酸探针标记法
↓ 适温延伸5’/3’引物形成新链变成4条链DNA －－延伸
↓ 第二轮：变性—退火—延伸 呈指数增长 理论值：一轮一倍 10轮 103=1000倍
20轮 106 30 轮 109 理论 模板扩增30轮 1ng-----------1g 实际 模板扩增30轮 1ng-----------10g
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（二）基本要素
1 Taq DNA聚合酶：
水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶
①5’3’DNA聚合酶活性；
②无3’5’外切酶活性，
35轮0.百度文库5%错配，与原始模板有差别；
最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸
半衰期：92.5℃ 130min
95℃ 40min
97.5℃ 5—6min
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼
脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同 的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA） 及其含量。
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操作过程
mRNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光