紫杉醇提取实验方案

实验名称：紫杉醇的提取

实验探究条件：

1、原材料：红豆杉树枝、红豆杉树皮、红豆沙树叶、三者混合；

2、烘干时的温度：40℃、60℃、80℃；

3、粉碎状态：完全不粉碎、粉碎至40目、粉碎至60目、粉碎至80目、粉碎至100目；

4、有机溶剂选取：95%甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯：丙酮=1:1；

5、层析介质选取：硅胶、氧化铝、C18、苯基柱、树脂。

实验器材：

实验仪器：

实验原料：

实验过程

1、红豆杉枝叶、树皮、树枝：采集新鲜的红豆杉树枝、树皮、叶，用清水洗净；

2、干燥与粉碎：于60℃烘箱内干燥至恒重，用粉碎机粉碎至100目，分别准确称取过筛后的各种样品2g，置50mL磨口具塞三角瓶中；

3、有机溶剂提取：加入95%乙醇20mL，超声萃取30min，留上清液，沉淀复加20mL 95%乙醇，重复操作；

4、浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中；

5、萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯（按物料：醋酸乙酯=1：1），萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。

6、浸膏：合并上清液，过滤除渣，滤液于30℃减压蒸干，得浸膏；下层清液作为10-DAB 的原材料保存好，详细步骤见最后；

7、固液萃取：浸膏用20mL甲醇溶解，加入石油醚(60～90℃)(体积比1∶1)，振荡30min，脱脂；

8、液液萃取：萃取余液用三氯甲烷(体积比2∶1)振荡30min，褪色，若褪色不彻底应反复进行；

9、沉淀：由于紫杉醇有在正己烷中沉淀这一特性，所以向液液萃取后得到的紫杉醇乙酸乙酯溶液中加入体积比为10：1的正己烷溶剂，将紫杉醇沉淀下来。（较少时，紫杉醇不能

完全沉淀；较多时，不但没有提高杂质去除量，还会造成正己烷使用量过大，溶剂浪费。）；

10、层析：配制不同极性的淋洗液（乙酸乙酯：正已烷=3：7和3：2两种淋洗液）淋洗，根据检测结果分别收集不同组分，将含紫杉醇的收集液选出，浓缩。层析详细步骤见文档2；

11、脱色：加甲醇溶解后，按（物料：活性碳=3：1）称取一定量的活性碳脱色；

12、结晶：将层析后的组分减压浓缩后，按比例溶解在甲醇（8mL/g）中，水浴加热到50℃，同时在搅拌的情况下缓缓滴入1/3甲醇体积的双蒸水，4℃冷却放置48h以上即可获得呈白色发黄的紫杉醇针状晶体；

13、HPLC检测：流动相为甲醇：水=65:35，进样量为10μL，流量为1.0mL/m1n，检测波长为227nm检测。用甲醇配置浓度为0.1mg/mL的紫杉醇标准品溶液，分别以10、12、14、16、18、20μL的进样量进行HPLC分析并绘制标准曲线。详细步骤见文档3。

其他文献中提到需要注意的地方

重结晶过程中的加水量以及加水速度都会影响结晶效果，应避免溶液的过饱和度过大。结晶的母液经氯仿萃取二次，氯仿萃取液经浓缩、拌样后回第3次柱层析。

2007供试品溶液制备：将原料于95℃烘箱内干燥至恒重，粉碎至100目，以95%甲醇为提取剂，于60℃提取20h，料液比为1∶10，紫杉醇得率为0.086mg/g

10-DAB提取步骤

1、在下层清液中加入中极性和/或高极性有机溶剂40℃提取，过滤，取上清液；

2、将上清液在50℃下减压浓缩至原体积的40%，加入水溶液，静置，分层，取水层；

3、向水层中加入二氯甲烷和/或乙酸乙酷，萃取4次以上，合并萃取层，减压浓缩，得浸膏；

4、加入浸膏2倍量的有机溶剂，冷冻结晶，离心，过滤，取固体1，所述有机溶剂为乙腈、甲醇、甲苯中的一种或几种；

5、向步骤4中制备得到的结晶中加入10倍量的有机溶剂，加入活性炭，混合均匀，加热脱色，过滤，取滤液，减压浓缩后，冷冻结晶，离心，过滤，取固体，烘干得10-DAB粗品，所述有机溶剂为乙臆、甲醇、甲苯中的一种或几种；

6、将10-DAB与硅胶混合均匀，以洗脱液洗脱，在线TLC分析，分段收集洗脱液，所述洗脱液由乙酸乙酷、丙酮中的一种或几种，与正己烷、正庚烷、二氯甲烷、石油醚中的一种或几种以8：2的混合比例混合而成；

7、反复按照步骤6进行反相色谱分离洗脱，收集95%以上纯度的洗脱液，合并洗脱液，浓缩；

8、向浓缩物中加入甲醇与乙酸乙酯的混合溶液重结晶，过滤，干燥，得10-DAB纯品。步骤1中，所述中极性和/或高极性有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或几种。所述步骤1中，所述有机溶剂与红豆杉枝叶的液固比为8：1。所述步骤2中水溶液的加入量为浓缩液的1/10 (体积比)。所述步骤3中每次萃取时搅拌3分钟。

所述步骤3中水层与有机溶剂的比例为1：1 (体积比)。所述步骤5中活性炭加入量为0. 5% (质量体积百分比)。所述步骤6中硅胶与10-DAB质量比为10：1。所述步骤8中重结晶溶液由甲醇与乙酸乙酯以0.5：1的体积比混合而成。所述步骤4或5中所述的冷冻结晶为-5℃下冷冻结晶10小时以上。