核移植技术与动物克隆

动物克隆的基本条件：
细胞全能性
细胞可逆性
植物的营养生殖
接穗
zhēn砧木
植 物 细 胞 的 全 能 性
压条 扦插
2-2.胚胎克隆技术
胚胎克隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶 段的胚胎。
主要有：胚胎分割、ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胎融合及胚胎核移植
胚胎分割：是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、
四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后植入受体中， 以得到同卵双生或同卵多生后代技术。
目的基因
基因打靶
转基因细胞系
核移植
动物乳腺
乳液提取目的产物
保 护 濒 危 物 种
细胞核
去核卵母细胞
核移植重构胚
1-6.核移植技术存在的问题
1)成功率低
2)理论研究相对滞后
3)体细胞克隆后代可能出现早衰，老化
4)技术不够完善
二、动物克隆
2-1.基本概念与原理
动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的 技术。发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体 细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中 之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚 胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中， 可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的 动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不 经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构 与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克 隆。
胚 胎 干 细 胞 核 移 植
胚 胎 细 胞 核 移 植
体 细 胞 核 移 植
生 殖 性 克 隆
治 疗 性 克 隆
同 种 核 移 植
异 种 核 移 植

受精1天后才开始卵裂。8细胞 之前，分裂球之间结合比较松 散，8细胞之后紧密化，通过细 胞连接形成致密的球体。16细 胞期，内部1-2个细胞属于内细 胞团，将来发育为胚胎，而其 外周细胞变为滋养细胞，不参 与组成胚胎结构，而是参与形 成绒毛膜。动物的胚胎在64细 胞以前为实心体，称为桑椹胚， 继续分裂成由100多个细胞组成 的早期胚泡。细胞团内部空隙 扩大，成为充满液体的囊胚腔， 此时的胚胎称为囊胚。囊胚的 大小仍和受精卵相似，但细胞 已经增殖到上千个。
体细胞克隆：又称体细胞核移植技术，它是用哺乳动 物特定发育阶段的成体细胞作为核供体，不经过有性 繁殖过程，进行体外重构，并通过重构胚胎的胚胎移 植，从而达到繁殖同基因型个体。
第一步
取妊娠期的6岁母绵羊（Finn Dorset白品种母羊） 的乳腺细胞作核供体细胞，用血清饥饿法使其进入 休眠状态而使全部基因具有活性。
个体，但其结果未被其他实验室重复出来。
□ 直到1983年, McGrath和 Solter等首次利用显微操作技术与细胞融合技 术，以单细胞期小鼠胚胎为供体细胞进行核移植，得到产仔结果并建 立重复性很高的核移植技术程序,使得核移植效率得到很大提高 。
1986年，W illadsen利用绵羊胚胎细胞核移植获得产仔结
3)细胞核移植
常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透
明带下注射。 胞质内注射是用一个外径5～8μm 的注核针吸取 供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。 透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与 卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细 胞融合。
4)激活
卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵 母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列 的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是通过 电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来， 并转到“受精”的状态。
方法有：
显微玻璃针去带分割法
显微手术刀直接分割法
酶消化透明带显微玻璃针分割法 酶-机械去带分割法 徒手刀片分割法
胚胎融合：是通过显微操作将两枚胚胎细胞
(同种或异种动物胚胎)融合成为一枚胚胎，共同发 育成为一个新的个体，这样的新个称为嵌合体。
方法有：
早期胚胎聚合法 分裂球聚合法 囊胚注入法
2-3.体细胞克隆技术
这一成果的重要生物学意义：
第一，它证明了一个已经完全分化了的动物体 细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并 且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形 成完整个体。
第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体 细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复
制品。它的成功提示我们可以进一步做到，在培育
将此种胚胎移入母鼠子宫培育。
生产出7只单亲小鼠。
□ 1981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验室合作， Illmensee和 Hoppe首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。他们将囊胚内细胞团细 胞的核移入去核的受精卵中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将此胚 胎移入同步孕鼠子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的
第四步
新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6天 后发育为桑椹胚或囊胚（8~16个细胞）。
第五步
将此早期胚胎移入假孕母羊子宫中，产下多利 即为6岁母羊的复制品，也为白色。
为何是突破性的工作：
第一，解决了使供
体细胞与核受体细
胞（去核卵细胞） 同步的方法。 第二，解决了用体 细胞做核供体与转 基因的问题。
鱼类的核移植
从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍
鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移 植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细 胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细 胞核的影响．
1979年，中国科学院武汉水生物研究所
利用鲫鱼做移核试验。他们把鲫鱼囊胚期细 胞经过385天59代连续传代培养后，再将此 种培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受 精卵中。到1980年4月，他们成功地培育了 两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常。
果，并提出: (1)作为核受体,卵母细胞较受精卵有更大的优 越性; (2)羊桑椹胚细胞核具有发育全能性。随后,科学家们 在牛 ( Prather etal 1987)、 猪 ( Prather，1989)、 山羊等 动物上相继获得胚胎细胞核移植后代。
1-3.核移植技术的一般操作程序
核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要
生殖性克隆
治疗性克隆
细胞治疗
组织替代
器官移植
两栖类细胞核移植
1938年Spemann最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植到
去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。
1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和实验技术，首次
获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代．
核供体为囊胚期的胚胎细胞——实验成功 核供体为原肠胚期的中胚层和内胚层细胞——实验失败
1958年到1962年，英国剑桥大学的John Gurdon和Machineer利用爪 蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾． 1970年John Gurdon以同样的方法，用爪蟾脚蹼角质化细胞进行移核 试验，蛙卵发育成了蝌蚪。

父亲？兄弟？ 母亲？ 归属感？ 人的唯一性问题。 犯罪问题 是一种退化的表现
我是谁？
思考题：
简述核移植技术的操作步骤。
简述克隆羊产生的生物学意义。
克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。 克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。 在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有
解决。
实践问题
克隆动物的成功率还很低 生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。
即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象
伦理道德问题！
克隆人的伦理道德问题！！
发育过程。
卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进 行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的MⅡ卵母细胞。二 是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合 体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。
2)核供体细胞的准备
在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二 倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组； 其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产 生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能 重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。 供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外， 核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。
第二步
注射促性腺激素，促使母羊（Sottish Blackface黑
面母绵羊）排卵，28~33小时取其未受精卵，快速去
核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS连续5天，使其
进入G0期做受体细胞。
第三步
乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电
流的作用下，将乳腺细胞融入卵中，形成一个含有 新的遗传物质的卵细胞。
1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细 胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同 种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核
鱼”新品种。
哺乳类的细胞核移植
哺乳动物的核移植研究直到 1975年才开始。牛津大学的
Bromhall将兔胚的细胞核移植到未受精的卵母细胞中， 获 得了桑椹胚，但成功率相当低。
电激法 化学试剂法
5）重组胚的体内或体外培养
经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，
观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养
方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入
休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和
囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内
哺乳类的细胞核移植
1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实 验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只 单亲小鼠。
将卵细胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后 放入加有适量细胞松驰B的溶液中。
经此番处理的卵细胞的染色体复制后出现了两个核，将此
双核细胞放入正常培养液中培养。
卵中的双核细胞自动融合，并且细胞开始分裂。
2)培育优良畜种，扩大良种种群 ；
3)开展异种动物克隆，拯救濒危动物；
4)与干细胞技术结合，开展治疗性克隆
5)利用核移植技术，研究生物学的基本问题 。
异种器官移植
可移植器官短缺 猪的器官大小、结构和功能上与人体器官相近 急性免疫排斥反应 基因敲除半乳糖基转移酶
核移植
基因敲除SPF克隆猪
器官移植
生 产药 用 蛋 白
体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确 地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因， 再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化 的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。也就
是说，我们可以按照人的意志去改选、生产物种。
克隆动物照片
Sheep Cattle Goats
Mice
1996
1998
第六章 核移植技术与动物克隆
2010.11.16
主要内容：
细胞核移植技术
1）基本概念 2）核移植类型 3）核移植的一般操作程序 4）核移植的应用
动物克隆
1）克隆的基本原理 2）胚胎克隆技术 3）体细胞克隆技术 4）存在的问题
一、核移植技术
1-1.基本概念
核移植技术：所谓核移植技术就是利用显微操作技
包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、 激活、重组胚的体外或体内培养、核移植胚
胎移入代孕母畜（寄母）等步骤 。
1)核受体细胞的准备
去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。这是因 为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植 核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了 的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体
培养7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培
养，发育至桑椹胚或囊胚。
6）胚胎移植
重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与 供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，
进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）
的子宫中，待其发育到产仔。
1-5.核移植技术的应用
1)制备转基因克隆动物， 进行生物药物生产；
1998 1996
Pigs
Gaur
Cat
2000
2001
2001
Mules
Horse
Rats
2003
2003
Deer Dog
2005 2003
2003
体 细 胞 克 隆 牛
2-4.克隆技术存在的问题
理论问题
分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大
部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还 不清楚；
术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中（同种或异 种动物的去核成熟卵细胞），使后者不经精子穿透等有 性过程即可被激活、分裂并发育,使得核供体的基因得到 完全复制，从而创造无性杂交生物新品种的一项技术。
核移植供体 核移植受体 理论基础？
1-2.核移植类型
供体细胞核的来源
核移植目的
供受体种间关系