免疫印迹法的实验技术PPT讲稿
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眼睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了PMSF， 立即用大量水冲洗。
• 所用离心机需提前预冷。 • 为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。 • 吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上
来。
蛋白浓度的测定
原因：
• Western Blot作为一项半定量实验技术，电
泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含量 测定。
• 蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴
• Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，
被检测物是蛋白质，“探针”是抗体， “显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的 蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸 纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形 式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽 类型及其生物学活性不变。以固相载体上 的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体 起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二 抗体起反应，经过底物显色或放射自显影
实验用途
• 用于检测样品中特异性蛋白质是否存
在。
• 对特异性蛋白质进行半定量分析。
蛋白免疫印迹组成
1
SDS -聚丙烯酰 胺凝胶电泳，使 待测样品中的蛋 白质按分子量大 小在凝胶中分成 带
2
把凝胶中已分成 条带的蛋白质转 移到一种固相支 持物上
3
用特异性的抗体 检测出已经印迹 在膜上的所要研 究的相应抗原
2 实验用途 3 实验方法及步骤 4 实验注意事项
实验原
理
• 将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶 【SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDSPAGE)】电泳使蛋白质按分子量的大小进行分离 → 凝胶上分离到的蛋白质转移至固相支持物 （硝酸纤维素膜或PVDF 膜）上 → 用抗靶蛋白 的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进 行特异性结合→与经辣根过氧化物酶标记（偶联） 的二抗结合 →用ECL发光或DAB显色检测。如果 转印膜上含有靶蛋白，经DAB显色后上出现棕黄 色条带蛋白条带。
• BCA(bicinchoninic acid 二辛可酸)法测定蛋
白质的原理与Lowery法相似。即在碱性环 境下蛋白质分子中肽键结构与Cu2+络合并 将Cu2+还原成Cu1+。BCA特异地与Cu1+ 结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM 处有最大光吸收值并与蛋白质浓度成正比， 颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可以 根据吸收值测定蛋白质浓度。该测定方法 灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜 色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去
凝胶电泳
样品的印迹
免疫学检测
实验步骤
• 提取细胞或组织蛋白→测定蛋白
含量→制备SDS-PAGE胶→蛋白变 性、上样→电泳→ 转膜→封闭→ 一抗→TBST洗膜→HRP标记的二抗 →TBST洗膜→ECL底物显色→X光 片曝光、显色→结果分析
二、蛋白样本的制备和浓度的测定
• 蛋白的提取：一般包括组织蛋白提取、细
免疫印迹法的实验技术课件
一、Western-Blot简介
• Western Blot，又称为免疫印迹
（Immunoblot）,是70年代末80年代初 发展起来的蛋白质测定技术。
• 蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯
坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette） 于1981年所著的《分析生物化学》 （Analytical Biochemistry）中首次被称 为Western Blot。
胞蛋白的提取 组织蛋白提取
• 组织和裂解液（加入蛋白酶抑制剂，为防
止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解）按比例 配制-置于玻璃匀浆器中，充分研磨（冰上 操作）4℃离心，12000rpm，10min取上清 分装1.5ml离心管中－20℃保存。（低温和 蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解。）
注意事项
• 注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、
SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电 泳法。
原理
• 1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决
于分子大小和形状以及所带电荷多少。
• 2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫
酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白 质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，在一定 条件下，大多数蛋白质与SDS的结合（1.4gSDS/1g蛋白 质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电 荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩 盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分 子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素 对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
实验前的准备
设备和材料的准备:
• 电泳槽的准备(本实验用垂直电泳槽)、电泳
仪的准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液 枪、枪头、烧杯、量筒
试剂的准备和配置:
• 双蒸水、30%丙烯酰胺、Tris-HCl(PH为8.8)、
Tris-HCl(PH为6.8)、10%SDS、10%过硫酸 铵(AP)、TEMED、电泳上样缓冲液、电泳
• 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相
载体上，而后利用相应的探测反应来检测 样品的一种方法。
• Western Blot 印迹方法，是检测蛋白质混合
液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也 可作为确定同一种蛋白质在不同细胞或者 同一种细胞不同条件下的相对含量的半定
• 实验主要31 内实容验：原理
定; 蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至 会影响此电泳方法的分辨力。
方法：
• 目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、
双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝 法Bradford法）。
• 目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ如BCA
法试剂盒.
BCA法工作原理
• 根据待测样品的蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度.
（一般浓缩胶为5%，分离胶根据所测蛋白分子量定）
凝胶浓度（％）
线性分离范围（KD)
15
12-43
10
16-68
7.5
36-94
5.0
57-212
作 用
• 浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后
(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝 胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负 电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先 通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含 SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条 很薄的区带（或称积层）（0.5-1cm）。
• 所用离心机需提前预冷。 • 为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。 • 吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上
来。
蛋白浓度的测定
原因：
• Western Blot作为一项半定量实验技术，电
泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含量 测定。
• 蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴
• Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，
被检测物是蛋白质，“探针”是抗体， “显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的 蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸 纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形 式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽 类型及其生物学活性不变。以固相载体上 的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体 起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二 抗体起反应，经过底物显色或放射自显影
实验用途
• 用于检测样品中特异性蛋白质是否存
在。
• 对特异性蛋白质进行半定量分析。
蛋白免疫印迹组成
1
SDS -聚丙烯酰 胺凝胶电泳，使 待测样品中的蛋 白质按分子量大 小在凝胶中分成 带
2
把凝胶中已分成 条带的蛋白质转 移到一种固相支 持物上
3
用特异性的抗体 检测出已经印迹 在膜上的所要研 究的相应抗原
2 实验用途 3 实验方法及步骤 4 实验注意事项
实验原
理
• 将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶 【SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDSPAGE)】电泳使蛋白质按分子量的大小进行分离 → 凝胶上分离到的蛋白质转移至固相支持物 （硝酸纤维素膜或PVDF 膜）上 → 用抗靶蛋白 的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进 行特异性结合→与经辣根过氧化物酶标记（偶联） 的二抗结合 →用ECL发光或DAB显色检测。如果 转印膜上含有靶蛋白，经DAB显色后上出现棕黄 色条带蛋白条带。
• BCA(bicinchoninic acid 二辛可酸)法测定蛋
白质的原理与Lowery法相似。即在碱性环 境下蛋白质分子中肽键结构与Cu2+络合并 将Cu2+还原成Cu1+。BCA特异地与Cu1+ 结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM 处有最大光吸收值并与蛋白质浓度成正比， 颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可以 根据吸收值测定蛋白质浓度。该测定方法 灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜 色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去
凝胶电泳
样品的印迹
免疫学检测
实验步骤
• 提取细胞或组织蛋白→测定蛋白
含量→制备SDS-PAGE胶→蛋白变 性、上样→电泳→ 转膜→封闭→ 一抗→TBST洗膜→HRP标记的二抗 →TBST洗膜→ECL底物显色→X光 片曝光、显色→结果分析
二、蛋白样本的制备和浓度的测定
• 蛋白的提取：一般包括组织蛋白提取、细
免疫印迹法的实验技术课件
一、Western-Blot简介
• Western Blot，又称为免疫印迹
（Immunoblot）,是70年代末80年代初 发展起来的蛋白质测定技术。
• 蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯
坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette） 于1981年所著的《分析生物化学》 （Analytical Biochemistry）中首次被称 为Western Blot。
胞蛋白的提取 组织蛋白提取
• 组织和裂解液（加入蛋白酶抑制剂，为防
止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解）按比例 配制-置于玻璃匀浆器中，充分研磨（冰上 操作）4℃离心，12000rpm，10min取上清 分装1.5ml离心管中－20℃保存。（低温和 蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解。）
注意事项
• 注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、
SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电 泳法。
原理
• 1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决
于分子大小和形状以及所带电荷多少。
• 2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫
酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白 质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，在一定 条件下，大多数蛋白质与SDS的结合（1.4gSDS/1g蛋白 质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电 荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩 盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分 子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素 对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
实验前的准备
设备和材料的准备:
• 电泳槽的准备(本实验用垂直电泳槽)、电泳
仪的准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液 枪、枪头、烧杯、量筒
试剂的准备和配置:
• 双蒸水、30%丙烯酰胺、Tris-HCl(PH为8.8)、
Tris-HCl(PH为6.8)、10%SDS、10%过硫酸 铵(AP)、TEMED、电泳上样缓冲液、电泳
• 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相
载体上，而后利用相应的探测反应来检测 样品的一种方法。
• Western Blot 印迹方法，是检测蛋白质混合
液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也 可作为确定同一种蛋白质在不同细胞或者 同一种细胞不同条件下的相对含量的半定
• 实验主要31 内实容验：原理
定; 蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至 会影响此电泳方法的分辨力。
方法：
• 目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、
双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝 法Bradford法）。
• 目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ如BCA
法试剂盒.
BCA法工作原理
• 根据待测样品的蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度.
（一般浓缩胶为5%，分离胶根据所测蛋白分子量定）
凝胶浓度（％）
线性分离范围（KD)
15
12-43
10
16-68
7.5
36-94
5.0
57-212
作 用
• 浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后
(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝 胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负 电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先 通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含 SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条 很薄的区带（或称积层）（0.5-1cm）。