脂质体介导法转染mIMCD-3细胞的可行性及最佳转染条件
脂质体转染实验原理与操作步骤总(精)
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次摘要:细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
找产品,上生物帮 >> >>细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。
它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。
用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。
因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。
细胞种类:COS-7、 BHK 、 NIH3T3、 Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。
脂质体介导抗乙脑病毒载体转染猪胎儿成纤维细胞条件的优化
（ 青 岛农 业 大 学 动 物 科 技 学 院 ，山 东 青 岛 ２ ６ ６ １ ０ ９ ） 摘要： 本 试 验 旨在 探 索 脂 质 体 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｆ ｅ ｃ ｔ ａ ｍｉ ｎ ｅ ２ ０ ０ ０介 导 抗 猪 乙脑 病 毒 （ Ａｎ ｔ ｉ — Ｊ Ｅ Ｖ） 载体转染猪胎儿成纤维细胞 （ Ｐ Ｆ Ｆ ） 的 最适条 件 ， 为构 建 Ａｎ ｔ ｉ — Ｊ Ｅ ｖ 转 基 因 胚 胎 提 供 供 核 细胞 。从 妊 娠 大 白母 猪 获 取 １ Ｏ ～１ ５ ｅ ｍ猪胎儿 ， 采 集 背 部 皮 肤 用 于组 织 块 法 培养分 离 Ｐ Ｆ Ｆ 。结 果 显 示 ， 细胞 培 养 至 Ｐ ７ 代， 生 长 曲线 正 常 ； Ｐ ５ — ７代 细 胞 用 于 抗 猪 乙脑 病 毒 载体 转 染 ， 当质 粒 ＤＮ Ａ 量 设 定 为 ０ ． ３ ５ 、 ０ ． ７ 、 １ ． ０ ５ ｇ和 １ ． ４ ｇ时 ， 转染率分别 为 １ ２ ． ７ ５ 、 ３ ６ ． ８ ２ 、 ２ ４ ． １ ２ 和８ ． ８ ５ ； 当脂 质 体 量 设 定 为 ０ ． ７ 、 １ ． ４ 、 染 率 分别 为 １ ３ ． Ｏ ８ 、 ２ １ ． ７ １ 、 ３ ７ ． １ ５ 、 ２ ４ ． ２ １ 和 ９ ． ２ １ ； 当 转 染 时 间设 定 为 ２ ． ５ 、 ４ ． ５ 、 ６ ． ５ ｈ和 ８ ． ５ ｈ时 ， 转
染 率分别为 ３ ． ９ ７ 、 ３ ８ ． ４ ８ 、 １ ７ ． ５ ４ 和 １ ２ ． ４ ７ 。这 些 结 果 表 明 ， ２ ． １ Ｌ脂 质 体 介 导 ０ ． ７ ｇ质 粒 Ｄ ＮＡ 转 染 ４ ． ５ ｈ转 染 效 率
miRNA模拟物转染人支气管上皮细胞的影响因素和条件筛选
miRNA模拟物转染人支气管上皮细胞的影响因素和条件筛选梁戈玉;浦跃朴;尹立红【摘要】目的:研究miRNA模拟物浓度、脂质体浓度、转染时间对人支气管上皮细胞转染效果和毒性的影响,筛选miRNA模拟物转染人支气管上皮细胞的最适宜条件.方法:分别应用0、10、30、50 nmol/L化学合成的、经Cy3标记的miRNA 模拟物,以0、0.1%、0.3%、0.5%浓度的脂质体转染剂转染人支气管上皮细胞,转染6、12、24 h后应用荧光显微镜观察细胞转染情况,计算荧光强度,评价转染效果;转染24 h后,应用WST-8法检测不同转染条件对细胞活性的影响.结果:随着miRNA模拟物、脂质体浓度增加和转染时间的延长,细胞内荧光信号增强.30和50 nmol/L miRNA模拟物的转染效率明显高于10 nmol/L组(P<0.05);0.3%和0.5%脂质体组的转染效率明显高于0.1%组(P<0.05);转染24 h的荧光强度明显高于转染12 h和6 h组(P<0.05).与对照组相比,转染24 h后各转染组细胞活性无显著性变化(P>0.05).结论:人支气管上皮细胞适合应用脂质体进行化学合成miRNA模拟物的转染研究,miRNA模拟物浓度、脂质体浓度、转染时间均是转染的重要影响因素,30 nmol/L miRNA模拟物、0.3%脂质体、转染24 h可获得理想的转染效果,转染后对细胞活性无影响.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2010(022)003【总页数】6页(P166-170,174)【关键词】人支气管上皮细胞;miRNA;脂质体;转染【作者】梁戈玉;浦跃朴;尹立红【作者单位】东南大学公共卫生学院,环境医学工程教育部重点实验室,江苏,南京,210009;东南大学公共卫生学院,环境医学工程教育部重点实验室,江苏,南京,210009;东南大学公共卫生学院,环境医学工程教育部重点实验室,江苏,南京,210009【正文语种】中文【中图分类】Q291近年来,microRNA(miRNAs)研究发展迅速,已成为目前的热点之一[1-2]。
脂质体转染实验步骤脂质体（LR）试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE
脂质体转染实验步骤脂质体（LR）试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE脂质体转染实验步骤脂质体（LR）试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。
转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。
先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。
因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤（方法一）：（1）：取6孔培养板，向每孔中加入2ml含（1-2）x 10^5个细胞的培养基，37℃、18% CO2培养基40%-60%汇合时。
（2）转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液（为转染1个空细胞所用的量）。
A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。
B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。
轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
（3）转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml 不含血清培养基。
（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。
（5）其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。
（6）注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤（方法二）：● 将细胞以5 x 10^5个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。
腺病毒及脂质体法介导脐静脉内皮细胞转染的实验研究
腺病毒及脂质体法介导脐静脉内皮细胞转染的实验研究李彪;兰静;肖鸣【摘要】目的:利用腺病毒载体和脂质体转染脐静脉内皮细胞探讨转染脐静脉内皮细胞的理想条件.方法:分别使用腺病毒载体和Lipofectamine 2000脂质体介导VEGF165基因转染脐静脉内皮细胞.转染后通过倒置荧光显微镜检测转染效率,对比探讨转染脐静脉内皮细胞的理想方法.结果:采用脂质体法转染脐静脉内皮细胞效果不理想,转染率约11.60%.采用腺病毒载体转染率明显高于脂质体法,且随感染复数增加而增加.结论:采用腺病毒介导VEGF165转染脐静脉内皮细胞较脂质体法转染效率高,当M0I=50时可作为转染安全有效的条件.这为细胞转染技术在脐静脉内皮细胞的研究提供实验基础.【期刊名称】《北方药学》【年(卷),期】2016(013)011【总页数】2页(P130-131)【关键词】脐静脉内皮细胞;细胞转染;腺病毒载体;脂质体转染【作者】李彪;兰静;肖鸣【作者单位】内江市第一人民医院口腔科内江 641000;内江市第一人民医院口腔科内江 641000;内江市第一人民医院口腔科内江 641000【正文语种】中文【中图分类】R543种子细胞的培养是组织工程的基本要素，VEGF是目前已知诱导血管再生作用最强的生长因子，但人工添加VEGF的活性时间短。
Hudson N等[1]研究认为如果在正常氧分压下VEGF165的生物半衰期30～45min，在低氧环境下是6～8h。
参与血管形成的主要细胞是内皮细胞，通过内皮细胞的迁移、增殖、分化和结构重建形成新的毛细血管网[2]。
许多研究证实，通过将特定的目的基因转染到细胞内可以使目的基因长期稳定持续性表达。
如能将VEGF基因转导至内皮细胞，使其能保持局部VEGF高浓度活性促进血管再生。
转染的关键之一是将VEGF基因安全有效转入靶细胞中并持续表达，因此需要寻求转染脐静脉内皮细胞的合适方法。
本实验选择脐静脉内皮细胞为实验对象，用不同腺病毒滴度及不同脂质体浓度转染脐静脉内皮细胞，探讨适合脐静脉内皮细胞转染的有效条件。
脂质体转染
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。
电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。
但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
一、实验材料1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基+ 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）3、溶液2：X ul 无血清培养基+ 4 ug 质粒per well（总体积250 ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
胰腺癌细胞 BXPC-3转染条件的优化
胰腺癌细胞 BXPC-3转染条件的优化卜海激;王毛毛【摘要】Objective To investigate transfection methods and conditions for human pancreatic cancer cell line BXPC -3 and related optimal transfection data .Methods The plasm pGFP-N3 was transfected into BXPC-3 cells respectively by lipofectamine 2000 and electroporation .Then, survival and transient transfection rates of the cells were observed and compared after 24 hours, so as to i-dentify the optimal transfection data .Results The positive BXPC-3 transient transfection efficiency by lipofectamine 2 000 was 1.36%, with the cell survival rate of 87.45%, while the transient transfection efficiency by electroporation with the pulse length of 70μsand e-lectric shock of 120 V was 54.78%, with the cell survival rate of64.01%.Statistics indicated that there were significant differences in the transient transfection rates, when comparisons were made between the 2 transient transfection methods(P<0.05).Conclusion In the transfection of BXPC-3, electroporation could achieve higher transfection rates than the conventional lipofectamine .Through optimi-zation of transfection conditions , electroporation could effectively transfect certain cell strains , which were hard to be transfected by lipo-fectamine.%目的：探讨实验室常用的人胰腺癌细胞株BXPC-3的有效转染方法及最佳转染参数。
脂质体介导转染法原理及其研究近展(值得看)
3 脂质体转染法的应用 3 & $ 核酸传递中的应用
研究表明， 在对生物大分子的传递过程中， 脂质体是十 分有效的载体， 无论对微生物细胞还是对植物细胞抑或对哺 乳动物细胞导入外源 ’ 脂质体的包裹就能对抗核酸酶 ( )， 的消化。 4 5 6 7 8 9 :等以脂质包裹链霉菌染色体 ’ ( ) 对棒状链酶 菌和天蓝色链酶菌营养缺陷型原生质体保温。在 0 , 的促 进下， 二 者 发 生 融 合， 并在再生子代中检出具有来自供体 ’ ( ) 遗传标记的菌落达到2 #! $ " #的比率。 核酸也能通过脂质体导入植物的原生质体， 烟草花叶病 毒; 也有报 ( ) 在有 0 , 时可籍 < = > 导入烟草原生质体， 道带正电荷的 < = > 可以增加放射性 ’ ( ) 和极及染色体结 合的比 例。另 一 个 相 似 的 实 验 报 道 了 包 裹 在 带 负 电 荷 的 < = > 中的大肠杆菌 ; ( )
〔 〕 O 染N种， 磷酸钙只能转染$种， 脂染素有$种不能转染 。
胆固醇及其衍生物作为阴离子脂质同样能高效率转染 细胞， ) 4 = P 4等用E种不同的胆固醇衍生物和 % D * C 形成的 脂质体转染细胞均获得了较高的转染率。由于存在血清， 体 内转染时一般的转染介质效率均不高， L ; I H @ 4 ;等应用 % F M （ ） 在! ! $ J % D * C J F 4 = Q ! J " / O K J " / O K " R* 0 : 存在下进行体 外转染， 得到了高的转染率， 体内转染也同样有效， 这样说明
造及其功能， 从而发现了膜的融合及内吞作用。最早证明脂 质体能把 % ／ 人 & ’ 十分有效地引入动物细胞的实验是从鼠 杂种细胞系 （( 中分离出的中期染色体包裹到脂质 ) * + ,- ） 体中， 并用以转染 ( 结果转化率比裸露染色 ) * + ,- 的细胞，
脂质体载体法转染成纤维细胞的最佳条件
脂质体载体法转染成纤维细胞的最佳条件梁惠珍 谢举临 文剑明收稿日期:1998212224作者单位:中山医科大学病理学教研室,广州 510089作者简介:梁惠珍,女,44岁,技师 目前基因转染的方法有多种,其中磷酸钙2DNA沉淀法应用较为广泛,但其转化效率不高,且不太适用于悬浮细胞和原代细胞培养的上皮细胞的转化〔1〕。
本文介绍的Lipofectamine 是一种新的多阴离子转染脂质体,其独特的精胺基团强负电子头部可自发地与DNA 形成复合物,因而具有很强的转染能力〔2〕。
作者研究了影响成纤维细胞转染效率的相关因素,建立了较为满意的转染条件,为研究外源基因在成纤维细胞中的表达奠定基础。
1 材料和方法111 材料 细胞来源:人肺组织成纤维细胞。
质粒:含al (2)型前胶原基因片断的重组质粒。
主要试剂:Lipofectamine 脂质体,遗传霉素G 418,1640培养基,小牛血清。
112 方法〔3,4〕11211 将2×105个细胞接种于35mm 培养皿中,在37℃CO 2培养箱培养24～36h ,使细胞生成单层,处于生长对数期,细胞生长面积达培养皿的70%～80%融合。
11212 在115ml 微量离心管中制备下列溶液:管A ,将210μg 质粒DNA 溶于100μl 无血清培养液中;管B ,将20μl Lipofectamine 溶于80μl 无血清培养液中。
11213 将管A 和管B 混匀,室温下置45min 。
11214 吸去细胞培养液,用无血清培养液洗涤细胞2次。
11215 加1ml 无血清培养液至Lipofectamine 2DNA 混合物中轻轻混匀,再滴加至细胞培养皿内,然后加入1ml 无血清培养液。
11216 在CO 2培养箱培养10h 。
11217 吸出转染液,加4ml 完全培养液继续培养16h 。
11218 弃去培养液,更换浓度为400mg ・L -1的G 418培养液继续培养。
DMRIE-C脂质体介导CLEC2B转染Jurkat细胞及其转染率的影响因素
DMRIE-C脂质体介导CLEC2B转染Jurkat细胞及其转染率的影响因素柳君如;张峻岭;徐士福;程琳【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2014(000)009【摘要】目的：探讨由DMRIE-C脂质体介导将CLEC2B siRNA转染入Jrukat细胞的过程中，对Jurkat细胞的影响，并分析其转染率的影响因素。
方法通过DMRIE-C转染CLEC2B siRNA入Jrukat细胞，台盼蓝染色法观察细胞活性，流式细胞仪检测siRNA转染率，RT-PCR检测CLEC2B基因沉默效率。
结果DMRIE-C脂质体对细胞的损伤程度与两者比例相关，对转染体系600μL （其中200μL密度为2×106／mL淋巴细胞）进行转染时，脂质体达3μL时可损伤细胞，不利于后续试验进行；siRNA∶DMRIE-C比例为3μL∶2μL，siRNA终浓度约80 nmol／L时，转染率最高，可达30．7％，转染后CLEC2B基因抑制率可达（35±1．9）％（t＝15．9，P＜0．05）。
结论 DMRIE-C脂质体可实现目的siRNA对Jurkat细胞有效转染，同时转染中脂质体与细胞比例、血清、操作方式等因素均可对转染效率产生一定的影响。
%Objective To observe the processof transfecting CLEC 2B siRNA mediated by DMRIE-C liposome into the Jurkat cells and to analyze the factors of influencing transfectionrate .Methods We transfected CLEC2B siRNA into the Jurkat cells by DMRIE-C.Trypan blue staining was used to observe the cell activity .siRNA transfection efficiency was de-tected by flow cytometry , and the CLEC2B gene silencing efficiency was detected by RT-PCR.Results The cell damagedegree in the transfection process was influenced by the cell members/transfection system lipo concentration ratio , 3μl lipo in the transfection system (600 μl total liquid, 200 μl 2 ×106/ml lymphocytes) would damage cells, and go against the following experiment.The transfection efficiency could increase to 30.70%when the siRNA:DMRIE-C ratio was adjusted to 3 μl∶2 μl, and then, the CLEC2B gene expression inhibition ratio was about 35 ±1.9%(t=15.9, P<0.05).Con-clusion DMRIE-C lipo cloud successfully transfer aim siRNA to Jurkat cells , and meanwhile, lipo/lymphocyte ratio, ser-um interference and operation skills may influence the transfection efficiency .【总页数】3页(P20-22)【作者】柳君如;张峻岭;徐士福;程琳【作者单位】中国人民解放军第404中心医院，山东威海264200;天津市中医药研究院附属医院;浙江大学医学院附属儿童医院;石家庄市妇幼保健院【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.优化阳离子脂质体介导的组织因子小干扰RNA转染HEK-293的转染条件 [J], 张园;李志樑;邱健;易绍东;董凤英2.脂质体介导寡脱氧核糖核苷酸转染人视网膜色素上皮细胞的转染率及分布测定[J], 李晓青;曾水清;徐莉莉3.脂质体介导法转染mIMCD-3细胞的可行性及最佳转染条件 [J], 高岑;史书龙;张旭;马跃荣4.非病毒载体介导脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞:脂质体及电穿孔转染法的比较 [J], 陈观贵;刘谦虚;谢鼎华5.脂质体介导pcDNA3．1-HGF瞬时转染小鼠MSCs及转染效果检测 [J], 黄雅静;孙万军;孙琪云;王冬梅;艾辉胜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞转染实验
细胞转染实验1．实验目的学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。
了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。
2．实验原理Transfect上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。
电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。
但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。
本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。
3. 实验材料与器材1）材料293T细胞MyoD表达质粒和EGFP表达质粒DMEM培养基链霉素/青霉素（双抗）FCS（小牛血清）PBS（磷酸盐缓冲溶液）胰酶/EDTA消化液转染试剂（TransFast）2）器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯废液缸血球计数板涡旋振荡器恒温水浴箱台式离心机35mm培养皿转染管15ml离心管观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD4. 实验步骤细胞传代(1) 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
脂质体转染技术步骤
脂质体转染实验步骤脂质体（LR）试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。
转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。
先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。
因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤（方法一）：（1）：取6孔培养板，向每孔中加入2ml含（1-2） x 10^5个细胞的培养基，37℃、18% CO2培养基40%-60%汇合时。
（2）转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液（为转染1个空细胞所用的量）。
A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。
B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。
轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
（3）转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。
（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。
（5）其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。
（6）注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤（方法二）：●∙∙∙∙∙∙∙ 将细胞以5 x 10^5个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。
●∙∙∙∙∙∙∙ 在试管中配制DNA-脂质体复合物。
8、细胞转染(脂质体介导法)
三、实验材料与器材
1材料
293T细胞
MyoD表达质粒和EGFP表达质粒
DMEM培养基
链霉素/青霉素(双抗)
FCS(小牛血清)
PBS(磷酸盐缓冲溶液)
胰酶/EDTA消化液
转染试剂(TransFast)
2、器材
20ul/ 200ul/1ml微量移液器和Tip头
利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔
性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效
率却较高。
Gen Escort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的
交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有
一、实验目的
学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的
一般性方法，观测外源蛋白的表达(绿色荧光蛋白) ，为染色准备实验材料。
二、实验原理
上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击
法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体
物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了
外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控
制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对 于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
阳性脂质体介导基因转染及其研究进展
阳性脂质体介导基因转染及其研究进展ChineseJournalofNewDrugs2007,V ol,16No.23中国新药杂志2007年第l6卷第23期阳性脂质体介导基因转染及其研究进展郑肖利,陈建明(第二军医大学药学院药剂教研室,上海200433)[摘要]基因治疗是一种很有前景的治疗模式,而阳性脂质体介导的基因转染是目前基因治疗的研究热点之一.现综述近5年来有关阳性脂质体的文献,介绍了阳性脂质体的基本组成,并从生物学,理化性质及制剂学等几个方面介绍了影响阳性脂质体/DNA复合物转染效率的主要因素,最后从新的阳性脂质成分及阳性脂质体或阳性脂质体/DNA复合物的表面修饰等方面介绍了近年来有关改善阳性脂质体介导基因转染的研究进展.[关键词]阳性脂质体;阳性脂质体/DNA复合物;转染效率;基因治疗[中图分类号]R459.9;R944.9[文献标识码]A[文章编号]1003—3734(2007)23—1930—06DevelopmentofcationicliposomesforgenedeliveryZHENGXiao-li,CHENJian-ming(DepartmentofPharmaeeuties,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,S hanghai2130433,China)[Abstract]Genetransfectionmediatedbycationicliposomeshasbeenoneofthemostimporta ntresearchspotsingenetherapywhichisapromisingtherapymode.Thisarticlereviewedliterat uresoncat- ionicliposomesinrecentfiveyearsandintroducedthecationicliposomescomponents,themainfactors thatinfluencethetransfectionefficiencyoflipoplexesonbiology,physico-chemicalpropert yandpharma-ceutics.Thisreviewalsointroducednewcationiclipidsandsurfacemodificationsforliposo mesorlipo- plexesthatrelatedtonewtrendsaimingatimprovingcationicliposomesmediatedgenedelive ry.[Keywords]cationicliposomes;lipoplexes;transfectionefficiency;genetherapy基因治疗(Genetherapy)是指通过载体把核苷酸转入患者体内以达到某种治疗目的.基因治疗是一种很有前景的治疗模式,但是目前该治疗方法还有许多难题没有解决,其中最主要的一个问题是没有找到适合的载体把治疗用核苷酸送至靶器官细胞内的作用点,因此,寻找合适的载体是当前的热点问题.目前基因治疗载体可分两大类:病毒载体和非病毒载体.与病毒载体相比,非病毒载体有许多潜在的优势,如:毒性低,免疫原性以及潜在的致癌性都较低;转移的核苷酸大小范围广(从寡核苷酸到人工染色体均可);质量控制较方便;并且制剂方法较简单,剂量可控.在基因治疗中应用较多的是阳性脂质体(cationicliposome)介导的基因转染,目前已成为非病毒载体的最佳选择,并且逐渐为广大研究者所接受,具有广阔的发展空间和前景.1阳性脂质体的基本组成阳性脂质体又称阳离子脂质体,正电荷脂质体(positivelychargedliposome),是一种本身带有正电荷的脂质囊泡.目前大多数阳性脂质体是由一种中性脂质成分和一种或多种阳性脂质成分组成,其中基金项目:上海市科委基础研究重点项目(05JC14048)一1930一中性脂质成分起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用,同时提供阳性脂质的细胞渗透功能.阳性脂质成分又称细胞转染素(Cytofectin),是具有不同化学结构的两性分子,一般由带正电的亲水基团通过中间连接基团与疏水基团连接而成.阳性脂质成分为整个脂质体提供正电荷,而且具有在体外稳定性好,在体内可生物降解的特点,但均有一定的细胞毒性.现常用的中性脂质成分及细胞转染素的结构见图1～5.除了以上的基本组成,还可利用不同性能的材料,如多糖,亲水性阳离子聚合物,寡肽,糖蛋白和表面活性剂等对脂质体进行表面修饰,可调控其在生物体内的过程从而提高其转染效率.图1二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)图2胆固醇(Cho1)ChineseJournalofNewDrugs2007,V o1.16No.23图3N一[1一(2,3一二油酰氧基)丙基]一Ⅳ,Ⅳ,Ⅳ一三甲基硫酸铵(DOTAP) 图42,3-二油酰氧一[2(精胺羧基酰胺)乙基]一Ⅳ,Ⅳ一二甲基1丙基三氟乙酸铵(DOSPA)图53B—lⅣ一(Ⅳ',Ⅳ二甲氨基乙基)J氨甲酰基'胆固醇(DC—Cho1)2影响阳性脂质体/DNA复合物(Lipoplexes,LD)转染效率的主要因素2.1生物学因素无论是体外转染还是体内转染,LD都必须克服一系列生物学的屏障.在体外,复合物首先要跨过带负电的磷脂双分子层结构,即细胞膜屏障;其次,复合物通过内吞作用进入核内体后,如何使复合物最大限度地从核内体中释放,并保证其不被溶酶体酶降解,则是转染的第二道屏障;最后,已释放出的DNA还要完成从胞浆到核孔的转运,最终到达核内才能实现目的基因的表达.在体内,基因转染还需要解决靶向性和克服体液内环境等问题:即如何将基因药物从注射部位定向地输送到病变的组织和细胞,并且能够有效维持药物体内稳定性和最低限度地降低各种调理素对基因转染的影响.2.1.1细胞外屏障LD在体液(如免疫血清)中极不稳定,极容易聚集或降解.疏水性的带负电荷的蛋白质如血清白蛋白与复合物结合可抑制其被细胞直接摄取.小分子的脂类如油酸和大分子的苷类如肝素也会破坏复合物结构的完整性,从而大大降低其转染效率.且阳性脂质体本身也很容易被单核巨噬细胞吞噬系统捕捉及破坏,这些都将导致LD在体液中的循环时间很短.尤其是静脉注射给药时很可能产生肺首过效应,这主要是因为肺部循环是注射复合物后遇到的第一个毛细血管床,在此LD很容易与肺内皮表面的肝素蛋白聚糖结合从而在肺部沉积.这也是静脉注射LD后在肺部的转染率往往比中国新药杂志2007年第16卷第23在其他器官如肝脏或脾脏中高很多的主要原因¨].2.1.2细胞内屏障目前大多认为DNA从核内体中释放出来以及DNA进入细胞核的过程是阳性脂质体介导基因转染的限速过程….DNA从核内体转移到细胞质再从细胞质转移到细胞核内这一系列的转移过程效率相当低,且在此过程中DNA很容易被大量的核酸酶降解导致转染失败.核膜也是DNA转移过程中的一大障碍,对于相对分子质量> 70X10的大分子,核膜将限制其进人细胞核,除非它能与细胞核的主动转运系统发生相互作用.但值得注意的是当细胞处于分裂期时由于核膜的暂时裂解,使得DNA进入核内的能力大大增强,有研究表明除非细胞处于有丝分裂期否则DNA是不可能进入细胞核内的.2.2理化性质及制剂因素除了上述生物学障碍之外,研究还表明LD的转染效率还与其本身的理化性质及其处方工艺等有关.目前研究较多的主要有复合物的粒径,专-电位,复合物的空间构型以及阳性脂质体膜电荷密度(单位面积膜所带电荷)等;制剂方面主要是阳性脂质体与DNA的电荷比对体内外转染效率的影响, 阳性脂质成分的分子结构对基因转染效果也有重要影响,且阳性脂质成分对不同的细胞系的转染能力也大不一样.2.2.1复合物粒径近来有研究发现粒径较大的复合物(>200am)的转染效率比粒径较小的复合物(50～100am)的转染效率要高.这很可能是因为大粒径的复合物更容易沉积在细胞膜上,促进细胞对复合物的摄取;也可能因为粒径不同引发的细胞内吞作用的机制不同;或是粒径大的复合物携带的质粒数多,这些都还有待进一步的研究. Rejman等研究了在细胞内吞作用中粒径的影响,结果表明粒径较小的粒子(<200am)通过网格蛋白介导的细胞内吞作用进入细胞后,被迅速运至溶酶体并被降解.而粒径较大的粒子(200am～1Ixm)则通过细胞膜内陷作用进入细胞,该过程比较缓慢,却使得DNA或LD在核内体到达溶酶体之前就可以从核内体中释放出来,从而避免其在溶酶体被降解.2.2.2阳性脂质体与DNA的比例很多研究都表明LD中两者的比例对基因转染效率及其毒性都有重要的影响.Agostina等..用DC-Chol(见图5)与DOPE(见图1)等质量比制备得到阳性脂质体,并将该阳性脂质体与DNA以不同的P(DC-Chol与DNA 一1931—的物质的量比,P为1.58时电荷比为1)进行体外转染实验证明,当P为5.8时,转染率最高,而P为24时毒性最大.同时实验还表明当电荷比靠近等电点(即电荷比为1)时,由于静电排斥作用最弱导致LD 易于聚集从而降低转染效率.而随着P的增大LD之间的静电排斥作用也随之增大,阻止了LD的聚集从而提高了转染效率.但是当P过大时,这种排斥作用反而不利于其转染(很可能因为过强的排斥作用阻止了其沉积在细胞膜上),且毒性明显增大. 2.2.3DNA的大小及构型研究表明质粒DNA的大小对转染效率有很大影响.有研究发现粒径较小的质粒的转染效率较高,这可能是因为较小的质粒DNA较容易从细胞质扩散至核周围,也比较容易通过核膜孔进入核内.Lukacs等发现大小在100bp以内的DNA片段可以在Hela细胞的细胞质中自由移动.而随着质粒DNA片段的增大,其在细胞质中的迁移能力也随之降低,当DNA片段大小达到2000bp或以上时就完全失去迁移能力. Katrien等将3种构型(超螺旋,开环及线型)的质粒DNA与DOTAP(见图3)/DOPE阳性脂质体复合得到的复合物分别转染V ero细胞,结果发现超螺旋LD的转染效率最高.实验还表明超螺旋DNA 的转染效率之所以会比其他2种构型的要高,并不是因为其在细胞核内的转录效率高,而很可能是因为其更容易从细胞浆中转移至细胞核内.3阳性脂质体用作基因载体的研究进展阳性脂质体作为基因载体虽有许多优势,但仍存在许多问题:转染效率仍较低;生物相容性及靶向性均有待提高;仍有潜在的细胞毒性等.近年来的研究大多针对这些问题对阳性脂质体进行改造,如开发新的阳性脂质成分;对阳性脂质体或LD进行表面修饰;更有效地压缩DNA从而提高转染效率;改善基因治疗给药方式等各种方法提高LD的转染效率.3.1开发新型的阳性脂质成分研究表明不同阳性脂质的分子结构及所带电荷不同对阳性脂质的基因转染效果影响很大,故研制高效且低毒的阳性脂质成分一直是研究的重点之一.目前开发的新型阳性脂质成分除了能够更有效地压缩携带DNA外,还能明显提高LD在血清中的稳定性.Kim等¨报道了一系列新型的阳性脂质成分,通过体内实验筛选得到DMKD(见图6)与DMKE (见图7)2种活性较高的阳性脂质成分,分别由1个赖氨酸残基,2条14碳烃链以及天冬氨酸残基或一1932一中国新药杂志2007年第l6卷第23期谷氨酸残基组成.使用这两种材料分别制得DMKD/Chol/Rho—PE和DMKE/Chol/Rho—PE阳性脂质体,以DOTAP/Chol/Rho—PE阳性脂质体为对照组体外转染4种不同的细胞系:Chang,HRT一18,293以及HepG2细胞,结果表明在这4种细胞系中DMKD脂质体与DMKE脂质体的转染效率均比DOTAP脂质体的高出3～10倍,且在HRT一18,293及HepG2细胞中,DMKE脂质体的转染效率显着高于DMKD脂质体.体外理化性质的研究表明DMKD及DMKE脂质体的膜完整性及电荷强度均高于DOTAP脂质体,这一特点对复合物与细胞膜的结合非常有利.Serika—wa等…将DC一6—14(见图8),DOPE以物质的量比5:2制备得到阳性脂质体,体外实验表明在含5%牛胎血清的缓冲液中1h该LD仍能保持结构完整且仍具有转染活性,而对照组lipofectAMINE/DNA复合物在含5%牛胎血清的缓冲液中15rain结构即被破坏.Antipina等¨则开发了一种pH敏感的阳性脂质体.如前所述DNA从核内体中释放出来是阳性脂质体介导基因转染的限速过程之一,而这种阳性脂质具有pH敏感的性质,即当复合物进入细胞后,由于核内体中pH值的改变,复合物形态和结构发生改变从而释放出DNA.且体外实验表明该阳性脂质与DNA在pH值4的环境中结合量远大于其在pH值8的环境中的结合量,这些都对其提高转染效率十分有利.RI2COzR\厂———————._1H2N/l2(CH2).J图6O,O'一二肉豆蔻酰一』v一赖氨酰谷氨酸盐酸盐(DMKD) H2N,【lH>～c—N,/co2R1.2HcI<一～]H2N/IcH2(CH2)cHl』C\/HaO一昌I\I.O图8O,O'一二肉豆蔻酰一N一(一三甲铵嘌呤内乙酰基)二乙醇胺盐酸盐(DC-6.14)ChineseJournalofNewDrugs2007,V o1.16No.233.2对阳性脂质体进行表面修饰静脉注射LD之后,其表面所带正电荷使其很容易与血细胞如巨噬细胞,单核细胞,中性粒细胞,血小板,红细胞等发生非特异性反应,不仅很可能导致LD还没有到达靶组织就发生解离或者被清除,还有可能会导致血液凝结,潜在的致炎反应以及转氨酶升高等现象的发生.因此科学家试图通过对阳性脂质体或LD进行表面修饰来解决这些问题.目前有很多这方面研究成功的例子,但也有研究表明该方面的研究还有待进一步完善.3.2.1多价阳离子脂质体提高压缩DNA能力目前通过常用的阳性脂质制得的脂质体多为单价阳性脂质体,通常不能有效地压缩DNA,从而影响其转染效率.近年来越来越多的研究在LD的制备过程中加入新的阳性成分来提高其压缩DNA的能力,这些阳性成分多为多价阳离子聚合物,蛋白质或多肽等,均能有效地压缩DNA.目前研究较多的材料是聚左旋赖氨酸(PLL),鱼精蛋白,衍生肽,合成肽,聚乙烯亚胺(PEI)等.其中PEI不仅有较强的DNA结合能力和细胞黏附能力而且具有强缓冲能力,是近年来的研究热点之一.但是单纯的PEI作为转基因载体体内应用存在毒性大及靶向性差等问题,因此研究者认为将PEI与阳性脂质体联合使用作为基因载体,可以产生一定的协同作用. Garcia等建立了一种由阳性脂质体,PEI和核酸组成的三元复合物.通过5种不同的制备方法以及不同的阳性脂质体:PEI:DNA(物质的量比)制备得到一系列三元复合物,以LD,阳离子聚合物/ DNA复合物为对照组,体外转染HepG2细胞,在60%胎牛血清存在的情况下,不同处方的三元复合物均比对照组表现出较高的转染效率以及较低的毒性.同时实验还证明了DNA压缩后的大小不仅影响其在体内的分布情况,而且影响其通过胞吞作用进入细胞的效率.Tagawa等16]则构建了一种由脂质体,mu(腺病毒核心肽),DNA组成的三元核酸给药系统(LMD). 该体系首先将质粒DNA与mu以1:0.6的质量比例混合得到MD复合物,该过程中DNA被充分压缩, 然后再将该复合物与阳性脂质体混合,最终脂质体: mu:DNA的质量比例为12:0.6:1.该给药体系表现出很高的稳定性,且体外转染时所需时间短(10min),质粒DNA的剂量小(0.001/zg/~L即有明显的基因表达).即使在100%血清中仍有转染能力(转染效率为在不含血清介质中的15%一25%).同时中国新药杂志2007年第16卷第23期体内实验也证实该体系在肺部有很高的转染能力.3.2.2立体稳定脂质体提高稳定性由于表面带了较多的正电荷,LD在体液环境中相当不稳定.静脉注射LD后由于带正电荷与血液中的带负电的蛋白质结合,导致其聚集并沉淀下来,并且很容易被网状内皮系统(RES)识别并清除.由此研究人员认为可以对阳性脂质体或LD进行表面修饰,将其制成立体稳定脂质体,抑制其与血清蛋白的结合,从而达到增加LD在血液中的稳定性,延长其在体内的循环时间的目的.目前研究较多也较常用的修饰成分为聚乙二醇(PEG),但也有很多有关新型的修饰成分的研究.Garinot等Ⅲ研究开发了一种两亲性的聚醚树状分子,并用其修饰双十八胺(DODA)/ DOPE阳性脂质体.他们以绿色荧光蛋白基因为报告基因,PEG修饰的阳性脂质体为对照组进行体内外实验.体外转染实验表明用该树状分子修饰的LD在血清中稳定性显着高于PEG修饰的LD.同时体内实验证明该树状分子修饰后的LD在体内循环时间比PEG修饰的复合物提高了5倍.Papanic- olaotl等则合成了一种新多价共聚物pI-IPMA (MA—GG—ONp),在pHPMA,聚[Ⅳ-(2-羟丙基)异丁烯酰胺]上接上二肽Gly—Gly来修饰阳性脂质体. 该共聚物可通过多个共价键与脂质体表面的伯胺连接形成亲水衣层,而PEG则是通过单个共价键连接形成亲水衣层.通过多个共价键连接更容易形成亲水衣层且制剂稳定性更高.用该聚合物修饰的LD 同样在血清中稳定性显着提高,但是体外转染实验却发现转染效率比普通LD要低.这可能因为修饰成分在阻止LD在血清中聚集沉淀的同时也阻止其在细胞膜上的沉积,影响了LD的细胞摄取.3.2.3表面修饰配体提高靶向性为了使药物能够有效地输送到靶组织,可以将能与靶组织特异结合的配体连接至药物的传递系统上,以提高靶组织的药物浓度.这一新型的药物传输理论也指导着基因给药.可用于基因给药的配体包括多肽,糖,蛋白等,如靶向肿瘤的配体有叶酸,转铁蛋白等;靶向肝细胞的配体有半乳糖,去唾液酸糖蛋白等.配体可以直接与阳性脂质体连接,也可以通过PEG链与脂质体共价相连,既能达到靶向目的,又能起到亲水性的屏蔽性能.Y an等合成了胆固醇-5一氧-Ⅳ- {4.[(1-亚氨基-2-D-硫代甘露糖-乙基)氨基]丁基t 甲酰胺(Man.C4.Cho1),该化合物具有一个氨基可以与pDNA通过静电结合,还有一个甘露糖残基可以与细胞膜上的受体结合.通过该化合物即可将甘露一1933—糖修饰于阳性脂质体的表面,进而达到靶向作用. 石靖等将阳性脂质体表面修饰PEG及豆甾醇糖苷(SG,一种含有胆固醇.B.D.葡糖苷的天然混合物,可以与肝实质细胞上的去唾液酸糖蛋白受体特异性结合),得到了一种靶向肝实质细胞的阳性脂质体.该阳性脂质体表现出较高的肝脏聚集性,且在肝实质细胞中的浓度显着高于普通阳性脂质体,在非实质细胞中的浓度则明显小于普通阳性脂质体.Morimoto等发现TRX.20可与硫酸软骨素糖蛋白发生特异性结合,因此制备得到了表面修饰有TRX?20以及PEG的阳性脂质体,不仅具有循环时间长(半衰期14h)的特点,且能与体外培养的人肾小球系膜细胞特异性结合,而与内皮细胞却无此特异性结合.体内分布实验表明该制剂具有很好的肾靶向性.以上这些对阳性脂质体的表面修饰还可以联合使用,通过共同修饰作用达到一种协同作用.Shige. ta等利用组氨酸的质子海绵效应以及半乳糖的肝细胞靶向性,制备得到Ga1.His.C4.Chol/DOTAP 阳性脂质体/DNA复合物.实验证明该复合物不仅具有与Ga1.C4?Chol/DOTAP阳性脂质体/DNA复合物相同的肝靶向性,且体外转染效率显着增高.3.3其他LD不仅可以静脉注射全身给药,而且可以通过皮肤等局部给药方式给药.透皮给药中,提高脂质体的形变能力是提高其透皮能力的有效途径,常用的方法是使用生物表面活性剂如胆酸钠,熊脱氧胆酸(UDCA)等对阳性脂质体进行修饰.Ruozi等即将UDCA加入到DOTAP阳性脂质体的脂质双分子层中,得到了具超弹性形变能力的阳性脂质体.细胞摄取实验表明,由于该LD具备了很好的弹性形变能力,因此更容易进入细胞.UDCA的抗氧化能力有效提高了脂质体脂质双分子层的稳定性.同时由于UDCA具有一定的抗细胞凋亡效应和细胞保护作用,经UDCA修饰的LD的毒性有效降低.4结语近年来研究人员通过开发新的阳性脂质成分,对阳性脂质体或LD进行表面修饰,提高载体压缩DNA的能力等来改善阳性脂质体介导基因转染的能力.这些方面的研究均有很大的进展,如提高了复合物的稳定性,靶向性,转染效率等.特别是有关阳性脂质体及其DNA复合物修饰方面的研究,Ko. starelos等…提出了自组装ABCD纳米给药体系的概念.该体系从里至外分为ABCD四层:A即经压——1934——中国新药杂志2007年第16卷第23期缩后的DNA;B为脂质层;C为生物稳定层,即脂质体表面修饰有PEG等;D为生物识别层,即脂质体表面修饰有配体等.可以看出通过改造这4层结构对LD进行系统完善是目前也是今后该领域的研究重点.另外,进一步揭示LD在体内的转移机制及其与细胞之间的反应机制等也是该领域研究的重点之一,该方面的研究对于改善阳性脂质体介导的基因转染具有重要的指导作用.相信随着这几个方向研究的深入,以阳性脂质体为载体的基因给药体系必将在基因治疗中发挥更大作用.[作者简介]郑肖利(1982一),女,硕士研究生.联系电话:(021)25074593,E—mail:***************.[通讯作者]陈建明(1964一),男,硕士生导师,主要从事药物制剂及其机制研究.联系电话:(021)25074593,E.mail:*************.[参考文献]KOSTARELOSK,MILLERAD.Synthetic,self-assemblyABCD nanoparticles:astructuralparadigmforviablesyntheticnon—viralvectors[J].ChemSocRev,2005,34(11):970—994.CHENGJ,ZEIDANR,MISHRAS,eta1.Structure—function correlationofchloroquineandanaloguesastransgeneexpression enhancersinnonviralgenedelivery[J].JMedChem,2006,49 (22):6522—6531.AHMADA,EVANSHM,EWERTK,eta1.Newmuhivalent cationiclipidsrevealbellcurvefortransfectionefficiencyversus membranechargedensity:lipid—DNAcomplexesforgenedelivery [J].JGeneMed,2005,7(6):739—748.ALMOFTIMR,HARASHIMAH,SHINOHARAY,eta1.Lipo—plexsizedetermineslipofectionefficiencywithorwithoutserum [J].MolMembrBiol,2003,20(1):35—43.REJMANJ,OBERLEV,ZUHORNIS,eta1.Size—dependentin—ternalizationofparticlesviathepathwaysofclathrin—andcaeolae?r mediatedendocytosis[J].BiochemJ,2oo4,377(1):159—169. 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阳离子脂质体转染效率影响因素的研究进展
阳离子脂质体转染效率影响因素的研究进展黄柯鑫【摘要】目前用于基因转染的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类.病毒载体的转染效率最高,但由于其容易造成感染和致癌性等安全性问题限制了它在临床中的应用.阳离子脂质体(cationic liposomes)是一种非常具有发展前景的非病毒基因载体.其生物膜特性,能使其转运的基因保持生物活性,保护基因免受溶酶体的降解,且具有无免疫原性、操作简单、对转移基因大小没有限制、重复性好、可自然降解等优点,而成为世界性的研究热点.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2012(025)014【总页数】3页(P1704-1705,1710)【关键词】阳离子脂质体;转染;转染效率;影响因素【作者】黄柯鑫【作者单位】广东医学院神经病学,广东省湛江市,524000【正文语种】中文【中图分类】R33820世纪80年代，Felgner等首次通过实验证明了阳离子脂质体可用于DNA转染。
近年来，基因转染技术在生物学研究领域和临床应用都已取得了很大的进展。
阳离子脂质体安全性好、操作简单，被广泛用于DNA、RNA的细胞转染。
阳离子脂质体在基因转染的成功运用，为基因转移开辟了一条新途径，并显示出广阔的前景。
然而，阳离子脂质体参与体内外基因转染的过程中，受到诸多因素的影响，现就其进展综述如下。
1 脂质体介导的基因转移机制阳离子脂质体介导的基因转染主要通过胞吞作用进入细胞内，其机制可简述为：带正电的阳离子脂质体通过静电作用与带负电的基因（DNA或RNA）形成脂质－基因复合物（lipoplexes，简称脂质复合物），阳离子脂质体表面过剩的正电荷通过静电作用吸附于带负电的细胞膜上［1］，而脂质体本身具有的亲脂性，使脂质复合物通过细胞内吞或细胞膜融合作用进入细胞内形成内涵体；脂质复合物在细胞质中或进一步传递到细胞核内释放基因，从而在细胞内转录和翻译。
2 影响阳离子脂质体转染效率的因素2.1 阳离子脂质体的构型深入探究阳离子脂质体的构效关系，对提高其转染效率有着重要的意义［2］。
【doc】阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究
阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究V o1.25N0.100ct.2005【文章编号】0258—5898(2005)10—1025—05阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究李劲松,叶展,赵涵芳,陈诗书(上海第二医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,上海200025)基础研究?【摘要】目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度,脂质体浓度,脂质体与质粒的比例,转染时间优化转染条件.结朵转染效率Lipo?fectAMINE2000>GenePORTs>LipofectAMINE.在细胞融合度为60%～70%,脂质体/DNA为3L/g,脂质体的量为3ILL,转染时间为5h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论¨p0fectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.【关键词】脂质体;转染;绿色荧光蛋白【中图分类号】Q7【文献标识码】A TransfectionofForeignDNAintoNIH3T3CellMediatedbyCationicLiposomeLIJin-song,YEZhan,ZHAOHan-fang,CHENShi—shu (DepartmentofBiochemistry&MolecularBiology,CollegeofBasicMedicine,Shang haiSecondMedicalUniversity,Shanghai200025,China)Abstract:ObjectiveTofindahighexplorebyefficientmethodoftransfectingforeignDNAint oNIH3T3cellsbycationicliposome.MethodsWithgreenfluorescenceprotein(GFP)asreportgene,transfecti onefficiencywascomparedbyLipofectAMINE2000,GenePORTsandLipofectAMINEinNIH3T3cellusin gFACS,andthetransfectionconditionwasoptimizedincellconfluence,liposomequantity,liposome/DNAratioandtran sfectingtime.ResultsAccor-dingtotheirtransfectingefficiency,thethreeliposomeswererankeddegressively:Li pofectAMINE2000.GenePORTsandLipofectAMINE.ThehighesttransfectingefficiencyofLipofectAMINE2 000wouldbeobtainedwhencellconfluencewas60%～70%,liposomeconcentration3L/1×10.cells, ratioofliposome/DNA3L/1gandtransfectingtimewas5hours.ThecellscouldexpressGFPmorethanonemonth.Conclusi onLipo—fectAMINE2000isthebestliposomeanditstransfectionconditionwouldbeoptimized. Keywords:cationicliposome;transfection;greenfluorescenceprotein阳离子脂质体具有操作简便,转移效率高和无毒等特点,目前广泛应用于真核细胞基因转移¨.脂质体用作基因载体的研究始于20世纪70年代末期,但是由于脂质体包裹基因效率低,与细胞膜的结合率不高,而且即使外源基因进入细胞中,内吞的脂质体也易为细胞内的溶酶体降解,使得转染的效率降低,导致外源基因在细胞表达效率低下.1987年Felgner最先制成了最早的单阳离子的小单层脂质体【基金项目】上海市教委重点项目(转化02)和上海教委第四期重点学科(ZDXK2001)资助项目.【作者简介】李劲松(1976一),男,上海人,硕十生.【通讯作者】赵涵芳,E—mail:****************.cn.Lipofetin,试验证明它可以有效的介导外源基因在真核细胞中表达L23.GIBICO公司最新推出的Lipo. fectAMINE2000具有转染效率高的特点,但是对于不同的细胞而言最佳的阳离子脂质体并不相同,而且脂质体的转染的影响因素较多,所以需要对脂质体转染条件进行优化以获得最佳的转染效率.材料与方法材料1.试剂:阳离子脂质体LipofectAMINE,LipofectAMINE2000(GIBICOBRL公司);GenePORTs(Gene.y报a学e学Md大一e科a医a二第n海一上叫盯-耋目I#48hNIH3]~Fig1…PJ'…¨¨1IIINIHF3cellan…nIfrInnJh…J…II一}^Il…":¨:irJ,……lhI…I.…II【:ir1.1~fi.…l』…-iAMJ ～一酣j耋啡m忡一嫩前..一驰流篓一黧一一李劲松,等:阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究图2流式细胞仪检测三种脂质体转染效率的比较Fig2ComparisonoftransfectingeffciencywithdifferentliposomesbyFACS A:Lip()fectAMINE2OOO;B:GenePORTs;C:LipofectAMINE. LipofectAMINE2000转染真核细胞条件的优化1.细胞融合度对转染效率的影响:于24孔板中每孔分别种2×10,3×10,4×10至细胞融合度分别为30%～40%,60%～70%,80%～90%时进行转染,48h后荧光显微镜观察转染效率的差别,在细胞融合度为60%--70%时细胞的转染效率最高(图3).l02Cellconfluence图3比较LipofectAMINE2000在不同细胞融合度时的转染效率Fig3ComparisonoftransfectingeffciencywithLipofectAMINE2000 indifferentcellconfluenceI:cellconfluencewas30%一40%;2:cellconfluencewas60%一70%; 3:cellconfluencewas80%一90%.2.脂质体DNA复合物浓度对转染效率的影响:在细胞融合度为60%～70%,DNA:脂质体为l:3时,加入1,3,6L复合物进行转染,48h后倒置显微镜观察转染效率的差别,所示在复合物为3L时最高(图4).镜下观察发现当脂质体浓度上升的同时细胞的死亡率也在不断增加,给予6L的转染时细胞死亡数量很多有些区域甚至细胞成片崩解.3.脂质体与DNA比率对转染效率的影响:在细胞融合度为60%～70%时,按照DNA:脂质体为1:1,1:3,1:6的比率进行细胞转染,48h后倒置显微镜观2000FlTC察转染效率差别,在DNA:脂质体为1:3时细胞的转染效率最高(图5).在镜下可以见到,随着脂质体比例的上升转染后的细胞死亡率上升,效率下降.l23Liposome(u乙)图4比较LipofectAMINE2000加入不同脂质体量时的转染效率Fig4ComparisonoftransfectingeffciencywithLipofectAMINE2000 indifferentliposomequantityl:LiposomequantitywaslL;2:Liposomequantitywas3L;3:Lipo- somequantitywas6}xL.4.转染时间对转染效率的影响:在细胞融合度为60%～70%,DNA:脂质体为1:3,脂质体复合物为3L时进行转染,分别在转染2,5,8h后弃去转染液,观察转染效率的差别,在转染5h的转染效果最好(图6).镜下观察细胞,在2h结束转染时细胞死亡最少,而8h后结束转染时细胞大量死亡,而且镜下有细胞形态发生改变,表现为细胞内颗粒增加,细胞膜变得不清,显示出细胞状态不佳.转染后外源基因表达的时间在细胞融合度为60%～70%,DNA:脂质体为l:3,脂质体复合物为3L,转染时间为5h的条件下,以绿色荧光蛋白为标记,每隔3d在倒置荧光显微镜下观察转染后绿色荧光蛋白表达时间,可以看到在最初的1周左右有高8642O8642O(I分矗I.曙D香∞蠹占一一^.g【.疆oL10I1}S曩I上上海第二医科大学表达,随着时间的延长逐渐降低,大于2周后有明显的降低,但仍有表达,在1个月后仍有少量细胞表达.20lO5Ol23Liposome/DNAratio图5比较LipofectAMINEE2000在不同的DNA与脂质体比率下的转染效率Fig5ComparisonoftransfectingeffciencywithLipofectAMINE2000 indifferentratioDNAandliposomel:DNA:liposomewas1:1;2:DNA:liposomewas1:3;3:DNA:lipo—SOIllewasl:63图6比较LipofectAMINE2000在不同转染时间下的转染效率Fig6ComparisonoftransfectingefficiencywithLipofectAMINE2000 indifferenttransfectingtimel:transfectingtimefor2h;2:transfectingtimefor5h:3:transfecting timefor8h.讨论脂质体是由生物可降解成分组成,具有毒性小,转染效率高,操作简便,可重复性好,对包裹的基因没有限制,又没有病毒作载体引发生物变异和癌变的可能.因此,在实验室研究和临床基因治疗中得到了广泛的应用.阳离子脂质体的组成成分主要有阳离子去垢剂,带正电的脂质衍生物或天然的带正电的碱性脂与不带电的中性脂,如DOPE或胆固醇及其衍生物.其作用方式主要是通过脂质体与细胞膜相结合后细胞内吞的形式进入胞内,在胞内释放外源基因或者进一步与核膜结合使得外源基因直接进入细胞核.阳离子脂质体介导的转染受到的影响因素有很多,对于不同的组织用同一种脂质体的转染,效率有很大的差异;对于同一种细胞用不同的脂质体转染, 效率也有很大不同.对于给定的细胞和阳离子脂质体种类的转染来说,主要参数有阳离子脂质体的组成,脂质体与DNA的比率,脂质体的总量,细胞密度以及脂质体/DNA复合物与细胞作用的时间等. 其他影响表达的因素有细胞,载体种类,转染时所用的培养液中是否含血清等.对于细胞来说不同的细胞吸收颗粒的能力不同,导致了有些细胞的转染远比其它细胞来的困难.在转染过程中由于阳离子脂质体对细胞膜的损伤也会导致部分的细胞在转染过程中死亡.同时在转染后被导入外源基因的靶细胞会发生细胞代谢的改变,导致生长缓慢或者细胞死亡.转染后有些细胞正常分裂,而另一些的细胞周期则延长,这些都影响了转染后的暂时性表达.获得暂时性表达的结果还受脂质体/DNA复合物与细胞的作用时间密切相关,由于脂质体在常温下的不稳定性和作用时间延长对细胞的毒性作用也随之增加.而且在脂质体作用期间细胞代谢受到极大的影响,也会使细胞在转染后的表达降低.所以,延长脂质体/DNA复合物作用细胞的时间能够增强细胞的转染效率,但是时间超过一定的限度会导致转染效率的低下.而对于细胞密度来说,从理论上考虑,较稀的细胞密度可以使得单位细胞有更多的脂质体/DNA相结合,从而使得有效转染的细胞相对数量增加.但问题并不是这么简单,由于单位细胞结合的脂质体数量的增加,导致了脂质体对细胞膜损伤的增加,使得转染过程中细胞的死亡率增加,而且细胞的绝对数量较少,转染后受到有效转染的细胞代谢影响较大,如前述及细胞的分裂受到影响.而未受到外源基因转染的细胞周期并没有受到影响或者是影响较小,这样导致在转染后有效转染的细胞被稀释,使得转染后的外源基因表达效率不高(图3所示).在实验过程中发现,随着细胞密度的增加其对脂质体的耐受性也大大增加,转染后细胞受到的影响较小,关于这点的机理尚未见到相关报道,可能是与细胞密度增加后细胞膜融合增加,导致转染对细一一【.蛔0∞巨加m5O一一一0口uB李劲松,等:阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究胞代谢影响减小.但是,细胞密度过高时转染伴随着对脂质体耐受的增加,有效转染的数目也随之减少,其转染效率降低.同理,脂质体的浓度也不是可以无限增加的,随着脂质体浓度的上升,虽然细胞接受转染复合物的可能性增加,但是它对细胞生长和代谢影响的增加导致有效转染的效率降低.所以,在一定的范围内,可以看到转染的效率是随着脂质体的浓度增加而呈非线性的增加,超过一定的界限后转染效率有一个明显的降低(图4所示).在转染过程中,脂质体与DNA的比率也是一个很重要的参数,由于转染时脂质体与DNA是形成了小单层脂质体包裹DNA的复合物,给予合适比例的脂质体/DNA可以使得脂质体/DNA复合物稳定,增加复合物被细胞内吞的效率.而脂质体与DNA的比率不当,使得无效的脂质体/DNA复合物增加,同时游离的DNA分子会影响脂质体/DNA复合物的稳定性.而游离的脂质体则可增加细胞毒性,对细胞的代谢发生影响,使细胞表达外源基因受到影响,最终降低细胞的转染效率.在这过程中脂质体与DNA的比率决定了脂质体/DNA复合物颗粒的大小和复合物表面的电荷分布,这些都是影响脂质体/DNA复合物转染细胞的重要因素.在LipofectAMINE2000介导pCDNA3一GFP转染NIH3T3后,我们观察到了其表达时间可以长达一个月.在转染后的最初两个星期有较高表达,随后表达量减少,表现在GFP蛋白的荧光强度降低,表达GFP的细胞减少.这主要是由于质粒转染真核细胞主要是以非整合的形式在细胞内表达,而且NIH3T3是非大T抗原转化细胞,所以它无法在细胞中复制,只能是短暂表达;随着时问的延长,质粒不断丢失导致了表达随着时间的延长而降低,但是在这些转染细胞中有一些大约是1%可以被宿主细胞整合而获得长期的表达.【参考文献】[1]陈诗书,汤雪明.主编.医学细胞与分子生物学[M].上海医科大学出版社,1995.[2]FeignerPL,GadekTR,HolmM,eta1.Lipofeetin:ahighlyeffi- cientlipid-mediatedDNAtransfectionprocedure[J].ProcNatl AcadSciUSA,1987.84:7413—7417.[3]王跣,林其谁.阳离子脂质体介导基因转染的最优化条件[J].生命的化学,1997,17(1):32—34.[4]xuL,HuangCC,HuangWQ,eta1.Systemictumor-targetedgenede- liverybyaoti-transferrinreceptorscFv-immun0lip0s0mes[J].Mole-cularCancerTherapeutics,2002,1:337—346.[5]NakaseM,lnuiM,OkumuraK,eta1.p53genetherapyofhumanOS? teosarcomausingatransferrin-modifiedcationicllposome[J].Mol CancerTher,2005,4..625—631.[6]XiaoHZ,HuangL.DNAtransfectionmediatedbycationiclipo- somescontaininglipopolylyinecharacterizationandmechanismofae- tion[J].BBA,1994,1189:195—203.[7]SmithJG,WalzemRL,GermanJB.eta1.Liposomesasagentfor DNAgenetransfer[J].BBA,1993.1154:327—340.[8]HollonT,Y oushimuraFK.V ariationinenzymatictransientgeneex- pressionassays[J].AnaJBioehem,1989.182:411—418.[9]Hawley-NelsonP,CiccaroneV,GebeyehuG.eta1.Lipo. fectAMINEreagent:anew,higherefficiencypolycationicliposome transfectionregent[J].Focus,1993,15:73—79.【收稿日期】2004—07—04【修回日期】2005—06—22。
裸质粒与脂质体介导转染方法对大鼠平滑肌细胞CYP2J3基因表达的影响
裸质粒与脂质体介导转染方法对大鼠平滑肌细胞CYP2J3基因表达的影响常静;曾翔俊;王红霞;穆晶;刘琨;王瑛;李珊珊;张立克【期刊名称】《首都医科大学学报》【年(卷),期】2009(30)4【摘要】目的比较脂质体介导法和裸质粒直接转染法导入CYP2J3基因表达的效率.方法将CYP2J3真核表达质粒导入原代培养大鼠平滑肌细胞,用半定量RT-PCR 方法检测CYP2J3 mRNA表达,Western blotting方法测定CYP2J3蛋白表达,高效液相色谱法测定培养液11,12-EET含量.实验分为裸质粒转染组(2J3)、脂质体介导转染组(L2J3)和对照组,转染后24 h和48 h收集细胞.结果转染后24 h,2个转染组CYP2J3 mRNA表达均较对照组明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);L2J3组蛋白含量较对照组低,差异有统计学意义(P<0.01),2J3组蛋白含量较L2J3组高,差异有统计学意义(P<0.05).培养液11,12-EET含量在3组间差异无统计学意义.转染后48 h 2个转染组CYP2J3 mRNA表达较24 h时弱,但仍较对照组高,脂质体转染组较裸质粒转染组CYP2J3 mRNA表达增强;2J3组及L2J3组蛋白含量均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.01);2个转染组培养液中11,12-EET浓度较对照组高,脂质体转染组表达高于裸质粒转染组,差异有统计学意义(P<0.05).结论裸质粒直接转染能成功导入CYP2J3基因并表达产物.【总页数】5页(P481-485)【作者】常静;曾翔俊;王红霞;穆晶;刘琨;王瑛;李珊珊;张立克【作者单位】首都医科大学基础医学院病理生理学教研室;首都医科大学基础医学院病理生理学教研室;首都医科大学基础医学院病理生理学教研室;首都医科大学基础医学院病理生理学教研室;首都医科大学基础医学院生物化学教研室;首都医科大学基础医学院生物化学教研室;首都医科大学基础医学院生物化学教研室;首都医科大学基础医学院病理生理学教研室【正文语种】中文【中图分类】R541.4【相关文献】1.脂质体介导HSP27干扰质粒转染人肺泡Ⅱ型上皮细胞对胶原合成的影响 [J], 邓海静;高学敏;薛新新;杜世璞;孙月;徐洪;杨方2.低频超声联合微泡增强脂质体介导Rac1-shRNA质粒转染前列腺癌细胞及对其生物学行为的影响 [J], 林艳端;胡兵;申锷3.弱激光对脂质体介导的血管平滑肌细胞基因转染的影响 [J], 顾瑛;刘凡光;江亿平;朱建国;李峻亨4.脂质体介导pBLAST2-hHGF质粒转染Lewis大鼠肝卵圆细胞 [J], 李铸;李立;冉江华;张升宁;刘静;刘滇生;李来邦;陈娟5.人心钠素基因裸质粒与脂质体介导转染在培养鼠心肌细胞中表达的研究 [J], 黄国明;李庚山;张宏祥;李建军;朱刚艳;赖亦木;王晶;郝亚荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞转染技术试题及答案
细胞转染技术试题及答案一、选择题（每题2分，共10分）1. 细胞转染技术中，最常用的转染方法是什么？A. 电穿孔法B. 脂质体介导法C. 病毒载体法D. 微注射法答案：B2. 脂质体介导法转染细胞时，脂质体与DNA的比例通常是多少？A. 1:1B. 2:1C. 3:1D. 4:1答案：C3. 电穿孔法转染细胞时，电脉冲的参数包括哪些？A. 电压B. 电流C. 脉冲时间D. 所有选项答案：D4. 病毒载体法转染细胞的优势是什么？A. 高效率B. 低毒性C. 长期表达D. 所有选项答案：D5. 微注射法转染细胞时，通常用于哪些类型的细胞？A. 悬浮细胞B. 贴壁细胞C. 原代细胞D. 所有选项答案：C二、填空题（每题2分，共10分）1. 细胞转染技术是指将外源性______导入到细胞内，使其在细胞内表达的技术。
答案：DNA或RNA2. 脂质体介导法转染细胞时，脂质体的主要作用是______。
答案：形成脂质体-DNA复合物3. 电穿孔法转染细胞时，电脉冲可以增加细胞膜的______，从而促进DNA的进入。
答案：通透性4. 病毒载体法转染细胞时，常用的病毒载体包括______和______。
答案：腺病毒载体、慢病毒载体5. 微注射法转染细胞时，需要使用______将DNA直接注射到细胞内。
答案：显微注射器三、简答题（每题10分，共20分）1. 请简述细胞转染技术在基因功能研究中的应用。
答案：细胞转染技术在基因功能研究中，可以用来过表达或敲除特定基因，从而研究该基因在细胞中的功能。
例如，通过转染含有特定基因的表达载体，可以研究该基因的表达对细胞生长、分化、凋亡等过程的影响。
2. 请简述脂质体介导法转染细胞的优缺点。
答案：脂质体介导法的优点包括操作简单、转染效率高、对细胞毒性低等。
缺点则包括转染效率可能受到脂质体和DNA比例、细胞类型等因素的影响，且转染后的表达时间相对较短。
四、论述题（每题20分，共20分）请论述细胞转染技术在基因治疗中的应用前景。