PCR分子标记
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②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应 后再加新酶。
③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加 了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和 效率，因而其灵敏性也大大提高，此酶为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。
PCR技术的基本原理 其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核苷酸引物。
PCR技术的应用
遗传性疾病
地中海贫血的基因诊断 血友病 苯丙酮尿症
肝炎 性病 肿瘤
传染性疾病
法医学
个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。• 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行 DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对 于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一 根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医 学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴 定中PCR技术被普遍采用。
多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中， dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4 种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其 中任何一种浓度不同于其它几种时，就会 引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的 产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。
模板的量与纯度，是PCR成败与否的关键 环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用 SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
PCR发展速度
惊人，没有一种技术能与之相比
引用论文最多、应用范围十分广泛
1993•年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开 创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大 籍英国科学家Michael Smith共获。
PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简 便、重复性好、易自动化等突出优点；能
在一个试管内将所要研究的目的基因或某 一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百 万倍, 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛 发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量 的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天 几星期才能做到的事情，用PCR几小时便 可完成。PCR技术是生物医学领域中的一 项革命性创举和里程碑。
Denaturation annealing Elongation cycles:25-30
Taq DNA聚合酶
分离:1969年，美国黄石国家公园 温泉
分子量:94KDa 活性：在几种水生栖热菌中活性最
高，200 000U/mg
Taq DNA聚合酶
离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较 敏感。最适浓度为50mmol/L。
引物量：
每条引物的浓度0.1～1umol或10～ 100pmol，以最低引物量产生所需要的 结果为好，引物浓度偏高会引起错配和 非特异性扩增，且可增加引物之间形成 二聚体的机会。
dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切 关系，dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高 浓度后，小量分装， -20℃冰冻保存。
增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互 补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体， 产生非特异的扩增条带。
设计引物应遵循以下原则：
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第 二个碱基，应严格要求配对，以避免因末 端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被 扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这 对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据 库的其它序列无明显同源性。
忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱 点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环， 利用PCR克隆、测序时尤应注意。
Taq DNA聚合酶
抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、 SDS•及许多其他化学药剂。
内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中 残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有 不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通 用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。
产物的数量满足实验需求为止。
procedures
template(DNA or RNA),
primers, Taq enzyme, 10×PCR buffer, Mg++, 5mmol/L dNTPs
pre-denaturation-denature completely
靶DNA的扩增
5’
(a)
引物2 5’
(b)
3’
3’
3’ 5’ 引物1
5’ (c) 引物2互补链
3’
3’ 引物1互补链
5’
(d)
3’
5’
新引物
5’
3’
(e) 不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’
3’
(g)
3’
引物1互补链
5’
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
温度（℃）
94
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；
②模板DNA与引物的退火：模板DNA变性成单链后，温 度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互 补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大 几百万倍。
PCR(Polymerase Chain Reaction)
Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.
PCR反应分三步：变性、退火及延伸。
发展历史
60s-70s：基因的体外分离技术。 Khorana（1971）：美国教授、1968年诺贝 尔医学奖得主，提出 “经过DNA变性，与合 适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断 重复该过程便可克隆tRNA基因”。
谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR•的雏 形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当 是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶 获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都 可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。
美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与 •PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR 有关试剂和仪器。
植物保护
杀虫病原微生物的基因型鉴定 植物病原微生物分类
形态学上相似性和潜在的血清学 交互反应，用常规方法难以区分，采 用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区 分
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合 酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，
真实性也较高，但每循环一次，仍需加 入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离 的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合 酶。
此酶特点：
①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原 来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来 的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的 40%。
Kary Mullis(1985)
发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:
“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA 片段的方法是在不可想象的情况下，•即驾车行驶在 月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。
专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚 合酶I的Klenow片段，其缺点是：
①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次 循环都要重新加。
②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板 和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差， 合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化 的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的 优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进 行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只 能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序 添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没 能引起生物医学界的足够重视。
变性温度低，解链不完全是导致PCR失 败的最主要原因。一般情况下，93℃～ 94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于 93℃则需延长时间，但温度不能过高， 因为高温环境对酶的活性有影响。
退火(复性)温度与时间：
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变 性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和 模板发生结合。退火温度与时间，取决于引物 的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的 长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引 物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物
模板DNA Taq DNA聚合酶
Mg2+ 加双或三蒸水至
10ul 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug
2.5u
1.5mmol/L
100ul
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质 主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+
Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种 dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度 为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过 高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性， 使反应产物减少。
变性温度与时间：
引物：引物是PCR特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下
可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
72 72 ℃延伸
60
60 ℃退火 （1.5min）
（1min）
循环3
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增
植物遗传育种
构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位
分子标记辅助育种 了解不同品种间的亲缘关系、系统
进化
畜牧
畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫 病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病 毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检 测
性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段
构建基因图谱 检测基因整合与表达：转基因鱼
保存:在-20℃至少6个月。
PCR污染及其对策 强大扩增能力+检测的敏感性 极微量的污染便可导致假阳性
污染源的追踪 ①点样器和加样器;②离心机;③微解剖刀;④浓 缩用具、真空瓶;⑤电泳装置;⑥紫外灯箱;⑦乙 醇或水浴锅;⑧冰箱门把手、实验台面等
污染的预防
(1)隔离不同操作区 (2)分装试剂 (3)改进实验操作 (4)专用加样器 (5)结果的重演
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适 的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性。复性时间一般为wk.baidu.com0～ 60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
聚合酶链反应技术（PCR） 及分子标记
聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一 种利用DNA变性和复性原理在体外进行 特定的DNA片段高效扩增的技术，可检 出微量靶序列（1个copy）。在模板 DNA、引物和dNTP存在的条件下依赖于 DNA聚合酶的酶促合成反应。
仅需用极少量模板，在一对引物介导下， 在数小时内可扩增至100-200万copy.
③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加 了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和 效率，因而其灵敏性也大大提高，此酶为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。
PCR技术的基本原理 其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核苷酸引物。
PCR技术的应用
遗传性疾病
地中海贫血的基因诊断 血友病 苯丙酮尿症
肝炎 性病 肿瘤
传染性疾病
法医学
个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。• 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行 DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对 于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一 根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医 学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴 定中PCR技术被普遍采用。
多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中， dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4 种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其 中任何一种浓度不同于其它几种时，就会 引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的 产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。
模板的量与纯度，是PCR成败与否的关键 环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用 SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
PCR发展速度
惊人，没有一种技术能与之相比
引用论文最多、应用范围十分广泛
1993•年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开 创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大 籍英国科学家Michael Smith共获。
PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简 便、重复性好、易自动化等突出优点；能
在一个试管内将所要研究的目的基因或某 一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百 万倍, 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛 发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量 的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天 几星期才能做到的事情，用PCR几小时便 可完成。PCR技术是生物医学领域中的一 项革命性创举和里程碑。
Denaturation annealing Elongation cycles:25-30
Taq DNA聚合酶
分离:1969年，美国黄石国家公园 温泉
分子量:94KDa 活性：在几种水生栖热菌中活性最
高，200 000U/mg
Taq DNA聚合酶
离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较 敏感。最适浓度为50mmol/L。
引物量：
每条引物的浓度0.1～1umol或10～ 100pmol，以最低引物量产生所需要的 结果为好，引物浓度偏高会引起错配和 非特异性扩增，且可增加引物之间形成 二聚体的机会。
dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切 关系，dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高 浓度后，小量分装， -20℃冰冻保存。
增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互 补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体， 产生非特异的扩增条带。
设计引物应遵循以下原则：
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第 二个碱基，应严格要求配对，以避免因末 端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被 扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这 对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据 库的其它序列无明显同源性。
忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱 点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环， 利用PCR克隆、测序时尤应注意。
Taq DNA聚合酶
抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、 SDS•及许多其他化学药剂。
内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中 残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有 不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通 用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。
产物的数量满足实验需求为止。
procedures
template(DNA or RNA),
primers, Taq enzyme, 10×PCR buffer, Mg++, 5mmol/L dNTPs
pre-denaturation-denature completely
靶DNA的扩增
5’
(a)
引物2 5’
(b)
3’
3’
3’ 5’ 引物1
5’ (c) 引物2互补链
3’
3’ 引物1互补链
5’
(d)
3’
5’
新引物
5’
3’
(e) 不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’
3’
(g)
3’
引物1互补链
5’
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
温度（℃）
94
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；
②模板DNA与引物的退火：模板DNA变性成单链后，温 度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互 补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大 几百万倍。
PCR(Polymerase Chain Reaction)
Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.
PCR反应分三步：变性、退火及延伸。
发展历史
60s-70s：基因的体外分离技术。 Khorana（1971）：美国教授、1968年诺贝 尔医学奖得主，提出 “经过DNA变性，与合 适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断 重复该过程便可克隆tRNA基因”。
谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR•的雏 形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当 是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶 获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都 可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。
美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与 •PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR 有关试剂和仪器。
植物保护
杀虫病原微生物的基因型鉴定 植物病原微生物分类
形态学上相似性和潜在的血清学 交互反应，用常规方法难以区分，采 用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区 分
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合 酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，
真实性也较高，但每循环一次，仍需加 入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离 的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合 酶。
此酶特点：
①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原 来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来 的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的 40%。
Kary Mullis(1985)
发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:
“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA 片段的方法是在不可想象的情况下，•即驾车行驶在 月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。
专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚 合酶I的Klenow片段，其缺点是：
①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次 循环都要重新加。
②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板 和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差， 合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化 的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的 优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进 行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只 能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序 添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没 能引起生物医学界的足够重视。
变性温度低，解链不完全是导致PCR失 败的最主要原因。一般情况下，93℃～ 94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于 93℃则需延长时间，但温度不能过高， 因为高温环境对酶的活性有影响。
退火(复性)温度与时间：
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变 性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和 模板发生结合。退火温度与时间，取决于引物 的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的 长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引 物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物
模板DNA Taq DNA聚合酶
Mg2+ 加双或三蒸水至
10ul 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug
2.5u
1.5mmol/L
100ul
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质 主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+
Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种 dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度 为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过 高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性， 使反应产物减少。
变性温度与时间：
引物：引物是PCR特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下
可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
72 72 ℃延伸
60
60 ℃退火 （1.5min）
（1min）
循环3
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增
植物遗传育种
构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位
分子标记辅助育种 了解不同品种间的亲缘关系、系统
进化
畜牧
畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫 病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病 毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检 测
性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段
构建基因图谱 检测基因整合与表达：转基因鱼
保存:在-20℃至少6个月。
PCR污染及其对策 强大扩增能力+检测的敏感性 极微量的污染便可导致假阳性
污染源的追踪 ①点样器和加样器;②离心机;③微解剖刀;④浓 缩用具、真空瓶;⑤电泳装置;⑥紫外灯箱;⑦乙 醇或水浴锅;⑧冰箱门把手、实验台面等
污染的预防
(1)隔离不同操作区 (2)分装试剂 (3)改进实验操作 (4)专用加样器 (5)结果的重演
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适 的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性。复性时间一般为wk.baidu.com0～ 60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
聚合酶链反应技术（PCR） 及分子标记
聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一 种利用DNA变性和复性原理在体外进行 特定的DNA片段高效扩增的技术，可检 出微量靶序列（1个copy）。在模板 DNA、引物和dNTP存在的条件下依赖于 DNA聚合酶的酶促合成反应。
仅需用极少量模板，在一对引物介导下， 在数小时内可扩增至100-200万copy.