植物中病毒诱导的基因沉默PPT课件
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2019/10/25
植物转化：农杆菌注射法agro-inoculation
转化pCAPE1、pCAPE2-GFP保存的农杆菌液分别用 含有50ng/μL卡那霉素和100ng/μL利福平的LB 液体培养基培养过夜。
培养到OD=1.2-1.5时，取菌液加入到1.5mL离心 管中，离心，用含10mMNaCl、0.1mM乙酰丁香酮、 1.75mMCaCl2的培养基重悬，静置90min。
生光漂白现象
PsPDS:P. sativum中的PDS基因
13
14
现象
15
RT-PCR检测PDS mRNA水平的变化
16
讨论
最广泛应用的病毒是PVX TRV VIGS应用还主要用于烟草。说明烟草感染效率
高，发展针对其它寄主的PEBV载体的难度。 农杆菌注射法的感染效率可达100%其高效性、
Fra Baidu bibliotek可靠性为应用作高通量研究打下基础。
N. benthamiana中 PVX 、TRV 载体引起的突
变4周后又恢复现象，导致沉默与回复表型共 存，相比之下PEBV引起的现象稳定。
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18
19
2019/10/25
两种转化质粒的农杆菌等量混合。
注射植物。嫩叶用1mL注射器在远轴端挑叶背，
11
但不挑破，吸取制备好的菌液注射。
检测转化体系
12
21天后，在注射 叶子上面新长出 来的叶子上检测 到绿色荧光
说明转化体系成 功。
结果2、八氢番茄红素去饱和酶基因（PDS） 的沉默
PDS是产生类胡萝卜素的关键基因，沉默后产
7
实验目的
构建适合不同植物（豆科）的VIGS载体
选用的病毒：Pea early browning virus (PEBV)
原因：1、与TRV同属 2、已建成带有GFP报告基因的表达载体
8
结果1、PEBV侵染克隆的构建
双元载体系统(binary vector system) 农杆菌介导的植物转化机理 本实验用的载体的构建 植物转化：农杆菌注射法（agro-inoculation）
6
VIGS应用的病毒和载体
烟草：烟草花叶病毒TMV
大麦：大麦条纹花叶病毒barley stripe mosaic virus
拟南芥：卷心菜曲叶病毒 cabbage leaf curl virus
番茄：烟草脆裂病毒tobacco rattle virus (TRV)
马铃薯：Potato virusX(PVX)
植物中病毒诱导的基因沉默
刘同坤
1
VIGS病毒诱导基因沉默 VIGS病毒诱导基因沉默
2
植物病毒可用作蛋白质过表达和序 列特异的基因沉默的表达载体,两者 都是功能基因组学研究工具.
3
病毒诱导的基因沉默(VIGS)的获得
1.构建载体 目的基因替换病毒中的与病毒复制、运动无关
的基因 直接插入到病毒基因组中 2 植物的转化 农杆菌 3 病毒携带目的基因在植物中复制和传播
4
原理
RNAi 病毒复制过程中形成的双链RNA触发植物中
与之具有高度序列一致性的mRNA降解。 Dicer酶
5
优点：1、试验周期短 2、可以研究T-DNA标记的敲除突变体
和表达了沉默诱导基因的转化子中有致死表型 的基因 缺点：1、不易获得针对特异物种的病毒载体
2、感病表型可能与靶基因沉默表型混淆
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2019/10/25
植物转化：农杆菌注射法agro-inoculation
转化pCAPE1、pCAPE2-GFP保存的农杆菌液分别用 含有50ng/μL卡那霉素和100ng/μL利福平的LB 液体培养基培养过夜。
培养到OD=1.2-1.5时，取菌液加入到1.5mL离心 管中，离心，用含10mMNaCl、0.1mM乙酰丁香酮、 1.75mMCaCl2的培养基重悬，静置90min。
生光漂白现象
PsPDS:P. sativum中的PDS基因
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现象
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RT-PCR检测PDS mRNA水平的变化
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讨论
最广泛应用的病毒是PVX TRV VIGS应用还主要用于烟草。说明烟草感染效率
高，发展针对其它寄主的PEBV载体的难度。 农杆菌注射法的感染效率可达100%其高效性、
Fra Baidu bibliotek可靠性为应用作高通量研究打下基础。
N. benthamiana中 PVX 、TRV 载体引起的突
变4周后又恢复现象，导致沉默与回复表型共 存，相比之下PEBV引起的现象稳定。
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2019/10/25
两种转化质粒的农杆菌等量混合。
注射植物。嫩叶用1mL注射器在远轴端挑叶背，
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但不挑破，吸取制备好的菌液注射。
检测转化体系
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21天后，在注射 叶子上面新长出 来的叶子上检测 到绿色荧光
说明转化体系成 功。
结果2、八氢番茄红素去饱和酶基因（PDS） 的沉默
PDS是产生类胡萝卜素的关键基因，沉默后产
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实验目的
构建适合不同植物（豆科）的VIGS载体
选用的病毒：Pea early browning virus (PEBV)
原因：1、与TRV同属 2、已建成带有GFP报告基因的表达载体
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结果1、PEBV侵染克隆的构建
双元载体系统(binary vector system) 农杆菌介导的植物转化机理 本实验用的载体的构建 植物转化：农杆菌注射法（agro-inoculation）
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VIGS应用的病毒和载体
烟草：烟草花叶病毒TMV
大麦：大麦条纹花叶病毒barley stripe mosaic virus
拟南芥：卷心菜曲叶病毒 cabbage leaf curl virus
番茄：烟草脆裂病毒tobacco rattle virus (TRV)
马铃薯：Potato virusX(PVX)
植物中病毒诱导的基因沉默
刘同坤
1
VIGS病毒诱导基因沉默 VIGS病毒诱导基因沉默
2
植物病毒可用作蛋白质过表达和序 列特异的基因沉默的表达载体,两者 都是功能基因组学研究工具.
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病毒诱导的基因沉默(VIGS)的获得
1.构建载体 目的基因替换病毒中的与病毒复制、运动无关
的基因 直接插入到病毒基因组中 2 植物的转化 农杆菌 3 病毒携带目的基因在植物中复制和传播
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原理
RNAi 病毒复制过程中形成的双链RNA触发植物中
与之具有高度序列一致性的mRNA降解。 Dicer酶
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优点：1、试验周期短 2、可以研究T-DNA标记的敲除突变体
和表达了沉默诱导基因的转化子中有致死表型 的基因 缺点：1、不易获得针对特异物种的病毒载体
2、感病表型可能与靶基因沉默表型混淆