蜂毒肽的研究及展望

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蜂毒肽的基因工程
生物工程技术的发展为获得蜂毒肽提供了一条新的途径 , 对其进行 的分子生 物学研究是 用生物工 程技术 对蜂毒 肽
改造利用的基础 . Kindas 等 [ 22] 从处女蜜蜂蜂王的毒腺中提取得到了 总 mR NA , 并证实其所提取得到的蜂王毒腺总 mRN A 中 80 % 是 蜂毒肽 mRN A , 发现蜂毒肽 mR N A 含大约 400 个碱基 对和 1 个 短的 po ly A 结尾 . L ane 等[ 22] 将从蜜蜂 毒腺提 取得到 的 RN A 注射到非洲 蟾蜍的卵母细胞中 , 并在其中进行了表达 , 证明非洲蟾蜍的卵母细胞不能对蜂毒肽前体蛋白 进行修饰 . Vlasak 等用 mRN A ! D NA 逆转录的方法 , 利用质粒 pBR322 构建了蜂王毒腺的 cDN A 文库 , 用蜂 王毒腺总 mRN A 制作 探针从此文库中分离得到了蜂毒肽的 cDN A , 再进一步将其克隆到质 粒 pU C18 上进行 DN A 序列 分析 , 由 DN A 的序 列 分析结果推测出的蜂毒肽序列与实际测得的完全相同 . 1991 年张青文 [ 23] 用 Kindas 的方法提取了蜂王毒腺的 R N A 用 于 在棉铃虫卵中的转译 , 并对提取的 mR NA 成分进行了研究 , 结果发现总 RN A 在除去 rR NA 后就可得 到高纯度的蜂毒肽 mRN A. 1997 年李继 周等 [ 24] 用 lg t11 建 立了 蜂 毒肽 的 cDN A 文库 , 并用 抗体 探针 筛选 出了 阳 性克 隆 . 1998 年陈 仲 兵 等 [ 25] 进一步将蜂毒肽 cD NA 克隆到大肠杆 菌质粒 pU C18 上 , 并进行了序列分析 . 蜂毒肽具有破坏细胞膜、 致死细胞的特性 , 因此要从原核和真 核表达系统 获得有活 性的蜂毒 肽 , 需 要以融 合蛋白 形 式表达 . H e 等 [ 26] 报 道以融合蛋白在 E . coli 中表达 prepromelittin. 融合 蛋白的 N 末端是 半乳糖 苷酶 ( g alac tosidase ) , C 末端是 pr epr omelittin, 在 10 mmol M gCl2 或质量分数为 0. 083 ( 8. 3 % ) 的乙醇 , 信号肽酶抑制剂的诱导 培养基上 , 可产生全长融合蛋白 ( g al pM ) . 带有信号肽的可溶重组蛋白 , N 端 660 个氨基酸 残基能够被 E. coli 内膜 易位结构和 前 导肽识别 . 在可诱 导的启动子控制下 , 将编码 pr epr omelittin 的 cDN A 连接在 P rotein A 或 引起一些完整的融合蛋白释放到培养基中 ; P repro melit tin 与 半乳糖苷酶基因的 3∀末端 , 2 个蛋白连接处是编码 Facto r Xa 的寡核苷酸 . Pr otein A 融合表达量较高 , 大 约 80% 形成包含体 , 其融合的 prepro melittin Gal 融合时表达量低 , 而且附着在 E. coli 的细胞质膜上 , 它的表达对 E. coli 是有毒 性的[ 27] . 1996 年 Dunn 等 [ 4] 将蜂毒肽基因和 来自于 鼠抗人 骨髓瘤 细胞和淋 巴瘤细 胞表面 特 异蛋白的抗体 scFv 基因相融合 , 构建了可以杀死肿瘤细胞的抗毒素 基因 , 并且实现了融合基因在大 肠杆菌中 的表达 , 精 制后的抗毒素在体外显示了杀死肿瘤细胞活性 . 笔者多 年来也做了一些工作 . 我们从蜜蜂 毒腺中提取 总 RN A , 通过 RT PCR 方法扩增得到了 pr epr omelittin 的 cD NA , 再 进一步通过定点诱变 , 在 melittin 的 序列前引 入羟胺裂 解位点 , 构建 了 与 半乳糖苷酶部分序列相融合 melittin 诱变蛋白表达载体 , 并在 E . coli 中表达了诱变蛋白 [ 8] .
第 28 卷第 1 期 2005 年 3 月
辽宁师范大学学报 ( 自然科学版 ) Jour nal of L iao ning N ormal U niver sity ( N atural Science Edit ion)
Vo l. 28 No . 1 M ar . 2005
文章编号 : 1000 1735( 2005) 01 0087 05
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蜂毒肽的研究及展望
王关林,
摘
邢
卓
116029)
( 辽宁师范大学 生命科学学院 , 辽宁 大连
要 : 综述了蜂毒肽 ( melit t in) 的结构 , 药理作用及近年来国内外 对于蜂毒 肽分子生 物学机理的 探索成果 , 并分析
了现阶段研究仍然存在的不足 . 提出基因工程技术是大量获得蜂毒肽的新方法.
关键词 : 蜂毒肽 ; 结构 ; 基因工程 ; 分子生物学机理 ; 应用前景 中图分类号 : Q781 文献标识码 : A
蜂毒 ( bee venom) 是工蜂毒腺分泌出来的一种具有芳香气味的透明毒液 , 它是一种成分复杂 的混合物 , 主要 含有蛋白 质多肽类、 酶类、 生物胺类和其他物质. 蜂毒中研究较多的是蜂毒溶血肽, 又称蜂毒肽 ( melittin) . 蜂毒肽占蜂毒干重的 50%, 是蜂毒中主要发挥作用的物质[ 1] . 蜂毒肽可以抗菌、 抗病毒、 消炎、 抗辐射 [ 2, 3] , 最近又有对其抗癌 作用进行研究的报道 , 受 到抗癌研究人员的重视 [ 4] . 相对抗生素 , 抗菌肽具有抗菌谱广、 低浓度下发挥作用、 不易使微生物产生抗性以及可以合成不 同于天然肽的类似物等优势[ 5] . 作为抗菌肽的一种 , 蜂毒肽也具备上述优点 , 所以其有望成为 新一代抗生素及农 药的候选 者. 尽管蜂毒肽有如此多的作用 , 但其临床应用却有很大的局限 , 主要是因为分离纯化技术难以将蜂毒中有致 敏反应, 并且 与蜂毒肽分子量相近的磷脂酶 A2 完全去除 . 基因工程技术的出现不 失为一条有效的途径 , 但蜂毒肽工程菌的自 杀性又成 为发展的障碍. 笔者多年来研究蜂毒肽的基因工程, 取得了一 定的成绩 [ 6~ 8] , 国内外现有多个 实验室也同样从事 蜂毒肽的 研究工作 . 为推动该研究课题的进展 , 笔者综述近年来的国内外研究成果 , 并提出了今后的研究方向.
有类激素样的作用 , 但无激素的不良反应 [ 14] . 蜂毒肽的镇痛作用亦十分显著 , 其对前 列腺素合成 酶的抑制 作用是吲哚 镁 辛的 70 倍 [ 15] , 镇痛强度为吗啡的 40% , 镇痛持续时间较长 , 但无水杨酸类对消化道的刺激和甾体类的免疫抑 制作用 . 蜂 毒肽可以作用于神经系统 , 其对 N 胆碱受体 有选择性阻滞作用 , 使中枢神经系统突触内 兴奋传导阻 滞 , 并 表现出中枢 性 烟碱型胆碱受体阻滞作用 ; 蜂毒肽还能抑制周 围神经冲动传导 [ 16] . 蜂毒肽具抗菌抗病毒作 用 [ 2, 3] , 可以抑制 20 多种革 兰 氏阴性和阳性细菌的生长繁殖 , 尤其是蜂毒肽 可以抗对青霉 素具有 耐药性 的金黄色 葡萄球 菌 [ 17] , 这在 细菌的 抗抗生 素 能力日见增强的今天 , 引起了人们的特别注意 . 蜂毒肽还能增强磺胺类和青霉素类药物的抗菌效力 . 同时 , 蜂毒肽对多 种 真菌、 病毒也具有毒性 . 用蜂毒肽代替蜂毒全毒不仅对辐射有预防作用 , 而且还有治疗作 用 . 高纯 度的蜂毒 肽可以明 显提高 抗辐射 效应 , 而
* 收稿日期 : 2004 08 20
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( 30270893) 作者简介 : 王关林 ( 1943 ) , 男 , 浙江海盐人 , 辽宁师范大学教授 , 博士 , 博士生导师 .
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且和全蜂毒比较差别非常显著 [ 18] . 蜂毒肽对肿瘤细胞的毒性作用也引起了人们的注意 . 蜂毒肽的分子小 , 比起其他的一些 毒蛋白如蓖麻毒蛋白、 白喉毒蛋白等分子量较大的毒蛋白免疫原性低 , 不易产生过敏反应 ; 对正常细胞的毒性 较低, 可较大 剂量使用 ; 因其是破坏细胞膜而导致细胞的死亡, 因此它不用进入细胞、 在细胞外即可显示出其破坏肿瘤细胞 毒性; 这些性 质使其非常适合作为 弹头 用来制造抗毒素 [ 19, 20] . 澳大利亚联邦科学与工业研究组织( CSIRO) DE Riv ett 博士领导的分子 生物学研究小组正在对蜂毒肽的抗癌作用进行研究 , 他们制造的以蜂毒肽为 弹头 的抗毒素已可对前 列腺癌、 膀胱癌、 乳 腺癌产生疗效[ 4] . 最 近有人在实验中将蜂毒肽和破伤风疫苗联 合作用 , 结 果相对于 未加蜂 毒肽的 一组小 鼠 , 实 验组小 鼠 抗体效价明显增加 , 认为蜂毒肽具有作为新的 抗原辅助药剂的潜力 [ 21] .
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蜂毒肽的结构
蜂毒肽是由 26 个氨基 酸残 基组 成的 多肽 , 分 子量 2 840, 其一 级结 构 的氨 基酸 残 基顺 序为 N H 2 GL Y IL E GL Y
AL A V AL L EU L YS V A L L EU T H R T HR G L Y L EU PRO A L A L EU IL E SER T RP IL E L YS A RG LY S A RG GL N GL N CO OH . 在通常情况下 , C 末端有 4 个氨基 酸残基携带正电荷 , N 末端有 2 个氨基酸残基 携带正电 荷 , 整个 分 子带 6 个正电荷 . 蜂毒肽的 N 末端起前 20 个氨基酸残基主要是疏水的 , C 末端的 6 个氨基酸残基主要是亲水的 . 分子的 3 个赖氨酸和 2 个精氨酸残基使其成为强 碱性肽 . 在中 性水溶 液中 , 蜂毒肽 作为单 体是以 随机的 卷曲结 构存在的 , 而 随 着 pH 值以及离 子强度的增高 , 蜂毒肽自我交联 , 形成 肽的 螺旋结构区域及螺旋间的角度是不 同的[ 11] . 螺旋 的四聚 体结构 [ 9, 10] . 最近 有研究 发现在不 同的溶 液中蜂 毒 螺旋结构中前 21 个 氨基酸是极性的 , 位于螺旋的表面 , 而非极性氨
4Baidu Nhomakorabea
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蜂毒肽的分子生物学机理
膜裂解作用 蜂毒肽发挥其众多功能的主要机理是因为蜂毒肽可以使细 胞膜的透 性增加 , 细胞内容 物泄露 , 细胞 裂解 , 所以蜂 毒
肽与天然或是模型膜的作用成为蜂毒肽研究的热点 . Benachir[ 28] 等利用钙黄绿素作为荧光标记物 , 系统研 究了蜂毒肽 诱 导的膜渗漏 . 他们认为蜂毒肽与囊泡的结合会非常迅速 , 因为在蜂毒肽作用几分钟之后 , 内容物的流出达到最 大值 , 并 且 停止 ; 而且蜂毒肽诱导的磷脂双分子层的裂解 的发生机制是 全或无 , 也就 是说蜂毒 肽作用下 , 有的囊 泡的内 容物全 部 释放 , 而有的则保持完整 , 没有渗 漏 , 这与 Schw arz 等[ 29] 观察的 一致 . 内 容物释 放的 比例与 蜂毒 肽 / 脂 质的 摩尔 比率 有 关 , 只有达到一定量的蜂毒肽才可能有内容物 渗出 . 更为特别的 是蜂毒肽可 以区别出 完整的和已 经有物 质渗出 的囊泡 , 说明这两类脂质双分子层的性质有很大的不同 . 他们还用一个简单的统计学模型得出 : 大约每个个 体上结合 250 个蜂 毒 肽分子是诱导渗漏的最小量 , 这表明渗漏很可 能是由于蜂毒肽以聚集的方式作用于双分子层 , 而不 是在双分子层上形 成 一个个完整的孔洞 . Shai[ 30] 等也认为其作用机制可能是聚集在膜 表面才引起 透性的增 加 , 类似 去垢剂的 作用方 式 . 蜂 毒 肽整个分子带有 6 个正电荷 , 由于静电作用 , 蜂毒肽对于带负电的脂质的亲和力 较带两性电 荷的强很多 [ 31] . 但是亲和 力 强却不一定说明裂解细胞的作用也一定强 [ 32] . 最近有很多 报道认 为 , 微 粒表面 的负电 荷可以 抑制蜂毒 肽对细 胞的裂 解 作用 , Benachir 等的工作表明卵磷脂双分子层表面负电荷的存在对蜂毒肽的裂解能力有 抑制作用 , 并且与 负电荷的密 度 成一定比例 [ 28, 33] . 这可能是由于静电作用吸附蜂毒肽 , 而不能更加深入破坏囊泡而形成渗漏 .
基酸在螺旋的另一面 . 这个两亲性 ( amphiphilic) 是膜结合 肽和膜蛋白跨 膜螺旋的 特征 , 所以 这个特性 决定蜂 毒肽既 可 以溶于水中 , 又可以与膜自然结合 [ 12, 13] , 进而溶解细胞 .
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蜂毒肽基因的药理作用
蜂毒肽是迄今为止人类所知的抗炎活性最强的物质之一 , 其抗炎活性是氢化可的松 ( hydr o cor tisol) 的 100 倍 . 它具