细胞骨架的观察
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生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
4.实验步骤
微丝的观察—考马斯亮蓝法 • ①细胞培养在平皿中的盖玻片上，生长密度达++～+++时，取出盖玻片，
用PBS洗3次。 • ②用1%Triton X—100处理25—30 min，室温或37℃均可。 • ③立即用M—缓冲液轻轻洗细胞3次。 • ④略晾干后，用3%戊二醛固定细胞5-15 min。 • ⑤PBS洗数次，滤纸吸干。 • ⑥用0.2%考马斯亮蓝R250染片30min-1h。然后小心用水冲洗，蒸馏水冲
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2.实验材料 、用品
• 实验材料：培养的Hela细胞 • 实验用品：
①实验器材：光学显微镜，荧光显微镜，冰箱(—20℃及4℃)，小型 振荡器，温箱，细胞培养设备；平皿，直径30mm小染缸，载玻片， 盖玻片，铝盒等。 ②主要试剂 M—缓冲液，1%Triton X—100（用M—缓冲液配制），0.2%考 马斯亮蓝R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）， 3.7%甲醛—PEMD，甲基罗丹明—鬼笔环肽染液。 PEM缓冲液，PEMP缓冲液，PEMD缓冲液， 兔抗管蛋白血清（一 抗），FITC-羊抗兔抗体（二抗），甘油-PBS(9:1，pH 8.5-9.0)。
的纯化； • （3）将显色剂与抗体结合形成标记抗体； • （4）标本的制备； • （5）免疫细胞化学反应以及呈色反应； • （6）观察结果。
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免疫荧光法
免疫荧光法分为直接法和间接法。 • 直接法：将荧光源自文库（最常用异硫氰酸荧光素、FITC）标记
在特异性抗体上，使其直接与细胞上相应抗原结合，在荧 光显微镜下观察即可鉴定未知抗原。 • 间接法：将荧光素标记在第二抗体上，待一抗与细胞抗原 结合后，再用标记了的二抗与一抗相接，从而显示未知抗 原。间接免疫荧光法中具有2对抗原、抗体系统。
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7.思考题
• 微丝观察实验中，1%Triton X—100 处理细胞的作用是什么?此实验 是否能看到微管、中间纤维?为什么?
• M-缓冲液的作用是什么? • 如果使用的抗体浓度越高，温育时间越长，是否免疫荧光图像会更清
晰? • 试分别用细胞松弛素B（3µg/ml培养液）、秋水仙酰胺
• 用抗管蛋白的免疫血清(一级抗体，例如兔抗管蛋白抗体) 与体外培养细胞一起温育，该抗体将与胞质中的微管(抗 原)特异结合，然后再加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二 级抗体），例如异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔抗体 共同温育，该二级抗体与一级抗体结合，从而使微管间接 地标上荧光素。置荧光显微镜下用一定波长激发光照射即 由荧光所在显示出微管的形态和分布。
• ③在清洁的载玻片上滴加20µl染液，将盖玻片上的细胞样品反扣其 上，放人湿盒内，置暗处室温下染色20～25 min。然后用PBS洗 3次，无离子水洗2次，略干燥后甘油—PBS封片。
• ④荧光显微镜下观察结果，用绿光激发。
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4. 实验步骤 微管的观察
• ①细胞培养在盖玻片上，长到++～+++时取出，用37℃预温的 PEMP缓冲液轻轻漂洗细胞。
洗，空气中略干燥。 • ⑦普通光学显微镜下用40×物镜或油镜观察。
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4. 实验步骤
微丝的观察—甲基罗丹明—鬼笔环肽法
• ①细胞培养在平皿中的盖玻片小条上，当细胞生长密度达+++(约 70%～80%)时取出放进小染缸中，用PBS清清冲洗。
• ②3.7%甲醛—PEMD室温固定10 min，用PBS洗去固定液后，略 干燥再放人预冷的–20℃丙酮中再固定3～5 min，取出略干燥。
1:16等不同浓度，分别滴加约40µL在细胞上，将此长满细胞的盖 玻片反扣在清洁的载玻片上，放在铺有湿纱布的铝盒内，密闭， 37℃温育1 h。
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微管的观察
⑥取出样品，放35mm小染色缸内，按下列顺序洗涤，以除去残 余的抗血清：PBS→1%Triton X—100/PBS→PBS。每次洗 5min，可以放在小型振荡器上轻轻振荡洗涤。然后取出样品，用 滤纸吸去水分，略干燥。 ⑦在细胞面上滴加40 µL左右FITC-羊抗兔抗体(用前仍以 0.3%Triton X—100/PBS稀释成1:4或1:8)。同步骤5放37℃温育 1 h。 ⑧同步骤6洗涤细胞，无离子水洗样品二次。 ⑨略干燥后，用甘油-PBS(9:1)封片。置荧光显微镜下观察，蓝光 激发，外加阻断滤片K530。先用低倍镜观察，后转油镜观察。
• ②0.5％Triton X-100/PEMP溶液预温到37℃，处理细胞1．5～ 2min。
• ③用PEMP缓冲液洗细胞2次。 • ④用3.7%甲醛—PEMD溶液室温下固定细胞30 min，PBS洗两次，
用滤纸吸干多余的液体。 • ⑤抗管蛋白抗体用0.3% Triton X-100/PBS稀释成1:4、1:8、
• 实验中用1％Triton X—100可抽提掉胞质中除骨架蛋白 以外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
微丝的观察—荧光法
• 用荧光染料甲基罗丹明标记的鬼笔环 肽处理后，可在荧光显微镜下看到微 丝动态变化的图象。
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微管的观察—免疫组织化学法
• 目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、 酶标、组织化学等。
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微丝的观察—考马斯亮蓝法
• 考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各 种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于 有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管； 还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此 我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左 右。
• 免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等 优点，又能够同形态、功能及代谢等研究结合起来，用以研究其它技 术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。
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免疫组织化学的过程
• （1）抗原的提取与纯化； • （2）免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体
• 各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落。 • 用1%Triton X—100 抽提杂蛋白要作预实验，抽提时间长将破坏细
胞结构，抽提时间短背景干扰大。 • 甲基罗丹明—鬼笔环肽标记微丝，染色时间勿太长，否则背景发红。
在没有固定液3.7%甲醛—PEMD的情况下，也可以用-20℃冷甲醇 代替，但是效果较差。 • 细胞充分贴壁铺展时应力纤维较多，形态挺直。反之，细胞收缩变 圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显得稀少。 • 每步洗涤要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀释下一步的抗 体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。
细胞骨架的观察
1.实验目的
• 熟悉免疫化学方法的原理及操作步骤。 • 掌握掌握考马斯亮蓝R250染色法及观察
细胞内微丝的方法。 • 掌握用间接免疫荧光法显示细胞内微管的
方法。
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2. 实验原理
• 2.1 免疫组织化学技术 • 2.2 细胞骨架的观察
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5. 实验结果
考马斯亮蓝显示细胞微丝
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FITC标记的细胞微管（×400）
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甲基罗丹明—鬼笔环肽标记的细胞微丝（ ×1000）
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6.注意事项
2.1 免疫组织化学技术
• 免疫组织化学(Immunochistochemistry) 是利用免疫学抗原抗体反 应的原理，用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗 体反应和组织化学的呈色反应，对组织细胞内特定抗原进行定性、定 位和定量研究的一项新技术，又称免疫细胞化学 (immunocytochemistry)。
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2.2 细胞骨架的观察
• 细胞骨架(cytoskeleton)是真核细胞细胞质中错综复杂的 蛋白质纤维网络，按纤维直径、组成成分和组装结构的不 同分为微丝(microfilaments，MF，5～7nm)、微管 (microtubule，MF，20～25nm)和中等纤维 (intermediate filaments，IF，8～11nm)。
（0.05µg/mL培养液）在37℃下处理培养的细胞2h，然后按前述实 验方法作考马斯蓝染色，细胞内纤维形态有什么变化?比较所得结果 并解释之。
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4.实验步骤
微丝的观察—考马斯亮蓝法 • ①细胞培养在平皿中的盖玻片上，生长密度达++～+++时，取出盖玻片，
用PBS洗3次。 • ②用1%Triton X—100处理25—30 min，室温或37℃均可。 • ③立即用M—缓冲液轻轻洗细胞3次。 • ④略晾干后，用3%戊二醛固定细胞5-15 min。 • ⑤PBS洗数次，滤纸吸干。 • ⑥用0.2%考马斯亮蓝R250染片30min-1h。然后小心用水冲洗，蒸馏水冲
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
2.实验材料 、用品
• 实验材料：培养的Hela细胞 • 实验用品：
①实验器材：光学显微镜，荧光显微镜，冰箱(—20℃及4℃)，小型 振荡器，温箱，细胞培养设备；平皿，直径30mm小染缸，载玻片， 盖玻片，铝盒等。 ②主要试剂 M—缓冲液，1%Triton X—100（用M—缓冲液配制），0.2%考 马斯亮蓝R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）， 3.7%甲醛—PEMD，甲基罗丹明—鬼笔环肽染液。 PEM缓冲液，PEMP缓冲液，PEMD缓冲液， 兔抗管蛋白血清（一 抗），FITC-羊抗兔抗体（二抗），甘油-PBS(9:1，pH 8.5-9.0)。
的纯化； • （3）将显色剂与抗体结合形成标记抗体； • （4）标本的制备； • （5）免疫细胞化学反应以及呈色反应； • （6）观察结果。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
免疫荧光法
免疫荧光法分为直接法和间接法。 • 直接法：将荧光源自文库（最常用异硫氰酸荧光素、FITC）标记
在特异性抗体上，使其直接与细胞上相应抗原结合，在荧 光显微镜下观察即可鉴定未知抗原。 • 间接法：将荧光素标记在第二抗体上，待一抗与细胞抗原 结合后，再用标记了的二抗与一抗相接，从而显示未知抗 原。间接免疫荧光法中具有2对抗原、抗体系统。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
7.思考题
• 微丝观察实验中，1%Triton X—100 处理细胞的作用是什么?此实验 是否能看到微管、中间纤维?为什么?
• M-缓冲液的作用是什么? • 如果使用的抗体浓度越高，温育时间越长，是否免疫荧光图像会更清
晰? • 试分别用细胞松弛素B（3µg/ml培养液）、秋水仙酰胺
• 用抗管蛋白的免疫血清(一级抗体，例如兔抗管蛋白抗体) 与体外培养细胞一起温育，该抗体将与胞质中的微管(抗 原)特异结合，然后再加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二 级抗体），例如异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔抗体 共同温育，该二级抗体与一级抗体结合，从而使微管间接 地标上荧光素。置荧光显微镜下用一定波长激发光照射即 由荧光所在显示出微管的形态和分布。
• ③在清洁的载玻片上滴加20µl染液，将盖玻片上的细胞样品反扣其 上，放人湿盒内，置暗处室温下染色20～25 min。然后用PBS洗 3次，无离子水洗2次，略干燥后甘油—PBS封片。
• ④荧光显微镜下观察结果，用绿光激发。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
4. 实验步骤 微管的观察
• ①细胞培养在盖玻片上，长到++～+++时取出，用37℃预温的 PEMP缓冲液轻轻漂洗细胞。
洗，空气中略干燥。 • ⑦普通光学显微镜下用40×物镜或油镜观察。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
4. 实验步骤
微丝的观察—甲基罗丹明—鬼笔环肽法
• ①细胞培养在平皿中的盖玻片小条上，当细胞生长密度达+++(约 70%～80%)时取出放进小染缸中，用PBS清清冲洗。
• ②3.7%甲醛—PEMD室温固定10 min，用PBS洗去固定液后，略 干燥再放人预冷的–20℃丙酮中再固定3～5 min，取出略干燥。
1:16等不同浓度，分别滴加约40µL在细胞上，将此长满细胞的盖 玻片反扣在清洁的载玻片上，放在铺有湿纱布的铝盒内，密闭， 37℃温育1 h。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
微管的观察
⑥取出样品，放35mm小染色缸内，按下列顺序洗涤，以除去残 余的抗血清：PBS→1%Triton X—100/PBS→PBS。每次洗 5min，可以放在小型振荡器上轻轻振荡洗涤。然后取出样品，用 滤纸吸去水分，略干燥。 ⑦在细胞面上滴加40 µL左右FITC-羊抗兔抗体(用前仍以 0.3%Triton X—100/PBS稀释成1:4或1:8)。同步骤5放37℃温育 1 h。 ⑧同步骤6洗涤细胞，无离子水洗样品二次。 ⑨略干燥后，用甘油-PBS(9:1)封片。置荧光显微镜下观察，蓝光 激发，外加阻断滤片K530。先用低倍镜观察，后转油镜观察。
• ②0.5％Triton X-100/PEMP溶液预温到37℃，处理细胞1．5～ 2min。
• ③用PEMP缓冲液洗细胞2次。 • ④用3.7%甲醛—PEMD溶液室温下固定细胞30 min，PBS洗两次，
用滤纸吸干多余的液体。 • ⑤抗管蛋白抗体用0.3% Triton X-100/PBS稀释成1:4、1:8、
• 实验中用1％Triton X—100可抽提掉胞质中除骨架蛋白 以外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
微丝的观察—荧光法
• 用荧光染料甲基罗丹明标记的鬼笔环 肽处理后，可在荧光显微镜下看到微 丝动态变化的图象。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
微管的观察—免疫组织化学法
• 目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、 酶标、组织化学等。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
微丝的观察—考马斯亮蓝法
• 考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各 种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于 有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管； 还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此 我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左 右。
• 免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等 优点，又能够同形态、功能及代谢等研究结合起来，用以研究其它技 术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
免疫组织化学的过程
• （1）抗原的提取与纯化； • （2）免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体
• 各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落。 • 用1%Triton X—100 抽提杂蛋白要作预实验，抽提时间长将破坏细
胞结构，抽提时间短背景干扰大。 • 甲基罗丹明—鬼笔环肽标记微丝，染色时间勿太长，否则背景发红。
在没有固定液3.7%甲醛—PEMD的情况下，也可以用-20℃冷甲醇 代替，但是效果较差。 • 细胞充分贴壁铺展时应力纤维较多，形态挺直。反之，细胞收缩变 圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显得稀少。 • 每步洗涤要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀释下一步的抗 体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。
细胞骨架的观察
1.实验目的
• 熟悉免疫化学方法的原理及操作步骤。 • 掌握掌握考马斯亮蓝R250染色法及观察
细胞内微丝的方法。 • 掌握用间接免疫荧光法显示细胞内微管的
方法。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
2. 实验原理
• 2.1 免疫组织化学技术 • 2.2 细胞骨架的观察
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5. 实验结果
考马斯亮蓝显示细胞微丝
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FITC标记的细胞微管（×400）
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甲基罗丹明—鬼笔环肽标记的细胞微丝（ ×1000）
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6.注意事项
2.1 免疫组织化学技术
• 免疫组织化学(Immunochistochemistry) 是利用免疫学抗原抗体反 应的原理，用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗 体反应和组织化学的呈色反应，对组织细胞内特定抗原进行定性、定 位和定量研究的一项新技术，又称免疫细胞化学 (immunocytochemistry)。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
2.2 细胞骨架的观察
• 细胞骨架(cytoskeleton)是真核细胞细胞质中错综复杂的 蛋白质纤维网络，按纤维直径、组成成分和组装结构的不 同分为微丝(microfilaments，MF，5～7nm)、微管 (microtubule，MF，20～25nm)和中等纤维 (intermediate filaments，IF，8～11nm)。
（0.05µg/mL培养液）在37℃下处理培养的细胞2h，然后按前述实 验方法作考马斯蓝染色，细胞内纤维形态有什么变化?比较所得结果 并解释之。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室