实验九 细胞骨架观察

实验九细胞骨架观察（4学时）

一、实验目的

掌握植物细胞骨架的结构特征及其制备技术。

二、实验原理

细胞骨架（cytoskeleton）是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管（MT，20－25nm）、微丝（MF，5－7nm）和中间纤维（IF，8－11nm）。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞骨架的观察多用1% Triton X-100处理细胞，可使细胞膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提掉，而细胞骨架系统的蛋白质不受破坏被保存，经戊二醛固定，考马斯亮兰R250染色后，微管不够稳定，其他类型纤维太细，无法分辨，只能观察到由微丝组成的微丝束（40nm）为网状结构。

三、实验仪器、材料和试剂

（一）仪器、用具：光学显微镜，镊子，剪刀，试管，表面皿，滴管，载玻片，盖玻片，染色缸，烧杯。

（二）材料：新鲜洋葱鳞茎

（三）试剂

1）M缓冲液（pH 7.2）：

50mmol/L咪唑(MW:68.08，3.4g/L) (缓冲剂)

50mmol/L KCl(MW:74.55, 3.73g/L)

0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30, 0.1g/L)或MgCl2(MW:95.3, 0.05g/L)

1mmol/L EGTA(MW:380.36, 0.38g/L) （和EDTA敖合Ca2＋，并在Mg2＋存在时，骨

架纤维保持聚合状态并较为舒

张）

0.1mmol/L EDTA (MW:292.25, 0.29g/L)或EDTA·Na2（MW:372.24,0.37g/L）

1mmol/L DTT(MW:154.3, 0.15g/L)

用1M HCl调至pH7.2

2）0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.3）：

PB 50ml

NaCl 0.15M

蒸馏水至1L

100ml 0.2 M磷酸缓冲液（PB）（pH7.3）：0.2 M Na2HPO477ml 0.2 M NaH2PO4 23ml

0.2 M Na2HPO4：Na2HPO4·2H2O（MW：178.05，3.561 g/100mL）或Na2HPO4·12H2O （MW：358.22，7.164 g/100mL）

0.2 M NaH2PO4：NaH2PO4·H2O （MW：138.01，2.76 g/100mL）或NaH2PO4·2H2O （MW：156.03，3.12 g/100mL）

3）1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于M-缓冲液

4）3% 戊二醛100mL: 取50% 戊二醛6mL ,PBS 94mL

5）0.2% 考马斯亮蓝R250染液：

考马斯亮蓝R250 0.2g（0.04g/20mL）

甲醇46.5mL（9.3ml/20mL）

冰乙酸7mL（1.4ml/20mL）

蒸馏水46.5 mL（9.3ml/20mL）

四、实验方法与步骤

（1）撕取洋葱鳞茎内表皮(约l cm2大小若干片)置于装有pH7.3 磷酸盐缓冲液的50m1烧杯中，使其下沉。

（2）吸去磷酸盐缓冲液，用1％Triton－l00处理20—30min。

（3）吸去Triton－l00，用M缓冲液洗3次，每次10min。

（4）3％戊二醛固定0.5—1h。

（5）pH7.3磷酸盐缓冲液洗2次，每次10min。

（6）0.2％考马斯亮蓝R250染色20一30 min。

（7）用蒸馏水洗1—2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。

五、结果

绘图示细胞骨架的形态