重组子导入和筛选.pptx
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重组子导入、表达与筛选
找找看……
重组DNA导入的目的是什么？请简单描述 需要被纯化掉的对象
转化率是什么？该怎么计算表达？ 影响转化率的因素是什么？
一、重组DNA分子导入宿主细胞
什么是转化（transformation）？ 将重组DNA分子引入细菌（原核细胞），
使其在细菌体内扩增及表达的过程。 什么是转染（transfection）? 将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的
DNA重组体导入真核细胞的过程。
基因重组 体外包装
噬菌体
转染
噬菌体体外包装
1原核细胞的转化（细菌转化）
1)受体细胞的选择
限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型： 避免重组整合 转化亲和型： 较高的可转化性 遗传互补型： 利于筛选 感染缺陷型： 防止感染
宿主细胞 原核细胞：大肠杆菌 真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞
亲和性强的质粒载体转化率高；
ccc质粒DNA载体转化率高
•受体细胞 •转化方法：
电击法转化率最高；氯化钙法次之
2、导入植物细胞
（1）农杆菌转化法 基因枪法
（二）基因枪介法
基因枪法（gene gun）是依赖高速的 金属微粒将外源基因 导入活细胞的一种转 化技术。
（二）基因枪法
➢优点：（1）无宿主限制。可以对任何基因 型材料进行转化研究；(2)靶受体几乎包括所 有具有潜在分化能力的组织或细胞。（3）易 于操作。
3）转化率： DNA分子转化宿主细胞获得转化子的效率 什么叫转化子？ 导入外源DNA分子后能稳定存在的宿主细胞 什么叫重组子？ 导入的外源DNA为重组DNA的转化子
表达方式： A、转化子数/用于转化的DNA分子总数 B、转化子数/宿主细胞总数
计算示例，见书132页
影响因素：
•重组DNA： 分子量小，转化率高；
重组子的筛选和鉴定
（一）根据载体的性状变化进行筛选
1 根据载体的抗药性标记进行筛选
载体上的抗药基因： 抗氨苄青霉素基因 抗四环素基因 抗卡那霉素基因等
凡是转入了载体的细胞都获得了这种 抗药性，可以在平板上生长菌落。
当带有完整抗药性基因的载体转化 无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞 都获得了抗药性，能在含有相应药物 的琼脂平板上生长成菌落，而未被转 化的宿主细胞不能生长。
缺点：
①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品 多为胞内产物，提取困难。
②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不 溶性的包含体，表达产物需经变性复性 才恢复活性。
③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多 余一个蛋氨酸残基。
④其内毒素很难除去。
酵母 酵母菌是研究基因表达最有效
的单细胞真核微生物。其基因组小， 世代时间短，有单倍体双倍体两种 形式，繁殖迅速，无毒性。能外分 泌，产物可糖基化。已有不少真核 基因成功表达。
大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原 核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景 知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产 物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内 可溶性表达、细胞周质表达等。 ④易培养，成本低。
找找看……
基因表达系统有哪些？ 基因表达系统应该具有什么条件？ 重组子筛选的意义是什么？ 有哪些方法可以用来筛选重组子？
第一节基因的表达系统与表达策略
最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。
宿主细胞的选择
一、适合目的基因表达的宿主细胞的要求:
1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。
二、宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物 细胞等。
2 根据载体抗药性插入失活选择
根据载体抗药性标志插入失活选择 含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA
片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活， 就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选 含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。
外源基因
抗Amp 抗Tet 抗Amp
抗Tet
抗Amp 抗Tet
重组DNA
空载体
不含有载体或 重组DNA
3 -半乳糖苷酶系统
β-半乳糖苷酶系统 载体：pUC、pGEM系列载体等
带有一个来自大肠杆菌DNA的短序列， 其中含有编码β-半乳糖苷酶（βgalatosidase）基因（LacZ基因）的调控 序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编 码序列中插入了一个多克隆位点，但不破 坏阅读框架，不影响功能。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
当这种载体转入的宿主细胞是含有β-半乳糖 苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列 可以互补（成为α互补），产生具有酶活性的蛋 白质（β-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含 有IPTG,X-gal的培养基上呈蓝色。
➢缺点：如转化频率低、结果的重复性差，易 导致基因沉默，实验成本较高等。
3、导入动物细胞
含目的基因 显微 动物受精卵 的表达载体 注射
早期胚胎
移植
雌性动物输 卵管或子宫
分裂 含目的基因 分化 的受精卵
发 转基因动物
育
显微注射技术
重组体
受体细胞
脂质体
脂质体法
含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过 规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）
重组体分子导入原核细胞 感受态细菌：细菌表面正电荷增加，
细胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子 的吸附和吸收
（1）CaCl2转化：
细菌处于0度，二价阳离子存在的低渗溶 液中，细菌膨胀成球形，处于感受态。
此时加热在42度的热冲击下进入细胞， 在培养基上生长数小时后球形细胞恢复 原状并繁殖。
转化效率为105~106/ug
（2）电击法（electroporation）：
在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔， 重组DNA进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。 实验简单，不需要制备感受态菌，转化效率高 109~1010/ug
[原理] 利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性
的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微 孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增 殖，重组DNA得到大量复制。
找找看……
重组DNA导入的目的是什么？请简单描述 需要被纯化掉的对象
转化率是什么？该怎么计算表达？ 影响转化率的因素是什么？
一、重组DNA分子导入宿主细胞
什么是转化（transformation）？ 将重组DNA分子引入细菌（原核细胞），
使其在细菌体内扩增及表达的过程。 什么是转染（transfection）? 将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的
DNA重组体导入真核细胞的过程。
基因重组 体外包装
噬菌体
转染
噬菌体体外包装
1原核细胞的转化（细菌转化）
1)受体细胞的选择
限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型： 避免重组整合 转化亲和型： 较高的可转化性 遗传互补型： 利于筛选 感染缺陷型： 防止感染
宿主细胞 原核细胞：大肠杆菌 真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞
亲和性强的质粒载体转化率高；
ccc质粒DNA载体转化率高
•受体细胞 •转化方法：
电击法转化率最高；氯化钙法次之
2、导入植物细胞
（1）农杆菌转化法 基因枪法
（二）基因枪介法
基因枪法（gene gun）是依赖高速的 金属微粒将外源基因 导入活细胞的一种转 化技术。
（二）基因枪法
➢优点：（1）无宿主限制。可以对任何基因 型材料进行转化研究；(2)靶受体几乎包括所 有具有潜在分化能力的组织或细胞。（3）易 于操作。
3）转化率： DNA分子转化宿主细胞获得转化子的效率 什么叫转化子？ 导入外源DNA分子后能稳定存在的宿主细胞 什么叫重组子？ 导入的外源DNA为重组DNA的转化子
表达方式： A、转化子数/用于转化的DNA分子总数 B、转化子数/宿主细胞总数
计算示例，见书132页
影响因素：
•重组DNA： 分子量小，转化率高；
重组子的筛选和鉴定
（一）根据载体的性状变化进行筛选
1 根据载体的抗药性标记进行筛选
载体上的抗药基因： 抗氨苄青霉素基因 抗四环素基因 抗卡那霉素基因等
凡是转入了载体的细胞都获得了这种 抗药性，可以在平板上生长菌落。
当带有完整抗药性基因的载体转化 无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞 都获得了抗药性，能在含有相应药物 的琼脂平板上生长成菌落，而未被转 化的宿主细胞不能生长。
缺点：
①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品 多为胞内产物，提取困难。
②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不 溶性的包含体，表达产物需经变性复性 才恢复活性。
③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多 余一个蛋氨酸残基。
④其内毒素很难除去。
酵母 酵母菌是研究基因表达最有效
的单细胞真核微生物。其基因组小， 世代时间短，有单倍体双倍体两种 形式，繁殖迅速，无毒性。能外分 泌，产物可糖基化。已有不少真核 基因成功表达。
大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原 核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景 知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产 物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内 可溶性表达、细胞周质表达等。 ④易培养，成本低。
找找看……
基因表达系统有哪些？ 基因表达系统应该具有什么条件？ 重组子筛选的意义是什么？ 有哪些方法可以用来筛选重组子？
第一节基因的表达系统与表达策略
最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。
宿主细胞的选择
一、适合目的基因表达的宿主细胞的要求:
1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。
二、宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物 细胞等。
2 根据载体抗药性插入失活选择
根据载体抗药性标志插入失活选择 含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA
片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活， 就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选 含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。
外源基因
抗Amp 抗Tet 抗Amp
抗Tet
抗Amp 抗Tet
重组DNA
空载体
不含有载体或 重组DNA
3 -半乳糖苷酶系统
β-半乳糖苷酶系统 载体：pUC、pGEM系列载体等
带有一个来自大肠杆菌DNA的短序列， 其中含有编码β-半乳糖苷酶（βgalatosidase）基因（LacZ基因）的调控 序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编 码序列中插入了一个多克隆位点，但不破 坏阅读框架，不影响功能。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
当这种载体转入的宿主细胞是含有β-半乳糖 苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列 可以互补（成为α互补），产生具有酶活性的蛋 白质（β-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含 有IPTG,X-gal的培养基上呈蓝色。
➢缺点：如转化频率低、结果的重复性差，易 导致基因沉默，实验成本较高等。
3、导入动物细胞
含目的基因 显微 动物受精卵 的表达载体 注射
早期胚胎
移植
雌性动物输 卵管或子宫
分裂 含目的基因 分化 的受精卵
发 转基因动物
育
显微注射技术
重组体
受体细胞
脂质体
脂质体法
含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过 规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）
重组体分子导入原核细胞 感受态细菌：细菌表面正电荷增加，
细胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子 的吸附和吸收
（1）CaCl2转化：
细菌处于0度，二价阳离子存在的低渗溶 液中，细菌膨胀成球形，处于感受态。
此时加热在42度的热冲击下进入细胞， 在培养基上生长数小时后球形细胞恢复 原状并繁殖。
转化效率为105~106/ug
（2）电击法（electroporation）：
在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔， 重组DNA进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。 实验简单，不需要制备感受态菌，转化效率高 109~1010/ug
[原理] 利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性
的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微 孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增 殖，重组DNA得到大量复制。