酶工程-酶分子修饰

八、甲硫氨酸甲硫基的修饰
虽然甲硫氨酸残基极性较弱，在温和条件下， 很难选择性修饰。但是由于硫醚的硫原子具有亲 核性，所以可用过氧化氢、过甲酸等氧化成甲硫 氨酸亚砜。用碘乙酰胺等卤化烷基酰胺使甲硫氨 酸烷基化。
5.4、酶化学修饰的应用
一、化学修饰在酶的结构与功能研 究中的应用
1. 研究酶的空间结构 2. 确定氨基酸残基的功能 3. 测定酶分子中某种氨基酸的数量
子和各种物理因素对酶分子空间构象（structure）的 影响-研究结构和功能的一种技术 改变酶学性质
3、酶分子修饰的基本要求和条件
（1）对酶性质的了解：
①酶的稳定性：热稳定性、酸碱稳定性、抑制剂等 ②酶活性中心的状况：活性中心基团、辅因子以及分子大小、性状、亚基数
（2）对修饰剂的要求：
胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原
可逆共价调节
磷酸化酶a与磷酸化酶b互变
2、酶分子修饰的意义
增强酶的稳定性（stability） 提高酶活性（activity） 降低或消除酶的抗原性（immunological property） 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离
5.1、酶分子修饰的定义及其意义
1、定义：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变， 从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质）， 特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构 和性质。
讨论:自然界中存在酶分子改造修饰吗？
酶原激活
第五讲 酶分子的化学修饰
第五讲 酶分子修饰
教学目标：
了解有关酶分子修饰的重要应用以及酶分子的物理修饰作用 理解蛋白酶化学修饰的方法和意义 掌握酶分子化学修饰的形式、目的、原理与特点
教学重点：
酶分子化学修饰的方法和意义、酶分子化学修饰的形式
教学难点：
化学修饰的原理与特点
第五讲 酶分子修饰
二、氨基的化学修饰
在蛋白质序列分析中氨基的化学修饰最常用 的 有 2 ， 4 － 二 硝 基 氟 苯 法 （ DNFB ， 又 称 sanger试剂)，丹磺酰氯（DNS)法等。 另外，氨基还可用乙酸酐、碘代乙酸、酮类 修饰。
三、精氨酸胍基的修饰
具有两个邻位羰基的化合物，如丁二酮、 1,2-环己二酮和苯乙二醛是修饰精氨酸残基的 重要试剂。
四、巯基的化学修饰
有机汞试剂，如对氯汞苯甲酸对巯基专一性 很强，修饰产物在250nm有最大光吸收。 N-乙基马来酰亚胺是一种反应专一性很强的 巯基修饰剂，反应产物在300nm有最大光吸收 。
烷基化试剂也是一种重要的巯基修饰剂，修 饰产物稳定，易于分析。
五、组氨酸咪唑基的修饰
常用的修饰剂有焦碳酸二乙酯（DPC)和碘代 乙酸， DPC对组氨酸残基有较好的专一性，产 物在240nm有最大光吸收。
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二、化学修饰酶在医药和生物技术 中的应用
1. 酶的表面化学修饰：
可溶性大分子，如聚乙二醇（PEG)、单甲 氧聚乙二醇（MPEG)、聚丙烯酸（PAA)、聚 氨基酸、葡聚糖、环糊精、羧甲基纤维素、肝 素等可通过共价键连于酶分子表面而进行化学 修饰。
5.1、酶分子修饰的定义及其意义 5.2、酶分子修饰方法 5.3、酶修饰后的性质变化
分析酶在工业生产中应用受到极大限制的原因？
热稳定性差 活力低 （易被蛋白水解酶水解） 耐受pH范围窄 （对酸碱敏感） 分子量过大 成本高，来源有限 不能在靶部位有效聚集 有异体反应 （存在异源蛋白的抗原性）
①良好的生物相容性和水溶性 ②修饰剂的相对分子质量（较大）、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性 ③修饰剂上反应基团的数目及位置 ④修饰剂上反应基团的活化方法与条件
（3）对修饰反应条件的选择：
①反应体系中酶与修饰剂的分子比例 ②反应体系中的溶剂性质、盐浓度和pH条件 ③反应温度及时间
六、色氨酸吲哚基的修饰
N-溴代琥珀酰亚胺（NBS)可以修饰吲哚基，并 通过280nm光吸收的减少跟踪反应。 2-羟基-5-硝基苄溴（HNBB)和4-硝基苯硫氯 对吲哚基修饰比较专一。
七、酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰
酪氨酸残基的修饰包括酚羟基的修饰和芳香 环上的取代修饰。苏氨酸和丝氨酸残基的羟基 一般都可以被修饰酚羟基的修饰剂修饰，但是 反应条件比修饰酚羟基严格些，生成的产物也 比酚羟基修饰形成的产物更稳定。
酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香 环取代反应等类型
一、羧基的化学修饰 (Glu、Asp)
用水溶性的碳二亚胺修饰
二、氨基的化学修饰
氨基的烷基化-Lys
用 三 硝 基 苯 磺 酸 （ TNBS) 修 饰 ， 在 420nm 和 367nm有特定的光吸收。
磷酸吡哆醛（PLP)是一种非常专一的赖氨酸修饰 剂，它与赖氨酸残基反应形成希夫碱后再用硼氢化 钠还原，其衍生物在325nm有最大的光吸收。
四、巯基的化学修饰
5，5－二硫代－双 （2－硝基苯甲酸 ）（DTMB, Ellman试剂）是最常用的巯基修饰剂，它与巯基反应 形成二硫键，释放出1个2-硝基-5-硫苯甲酸阴离子，此 阴离子在412nm有最大光吸收。该试剂是当前定量酶分 子中巯基数目的最常用试剂。它还用于研究蛋白质的 构象变化。
亲和标记-反应专一性
指亲和试剂只与作用部位的特定基团发生作 用，而不与作用部位以外的其它基团发生作 用。
5.2、酶分子的化学修饰定义
物理修饰：
不改变酶的组成单位及其基团的修饰，即酶分子中的 共价键不发生改变，只是在物理因素（高温、高压、 高盐、极端pH值）作用下，副键发生某些变化和重排。
化学修饰：
★广义:指凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的
转变。
★狭义:指在较温和的条件下以可控的方式使一种蛋白质 与某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残 基或其功能基团发生共价的化学变化。
5.3、酶蛋白侧链的修饰
蛋白质侧链上的功能基主要有：
氨基、羧基、巯基、咪唑基、酚基、吲哚基、胍 基、甲硫基。 修饰反应主要有：