克隆基因的表达
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。
2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。
5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。
6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。
7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。
8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。
9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。
10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。
这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。
基因克隆和表达技术及其应用研究
基因克隆和表达技术及其应用研究在现代生物技术领域，基因克隆和表达技术被广泛应用于生物医药、农业生产、环境保护等多个领域，是一项重要的研究方向。
本文将介绍基因克隆和表达技术的原理、工具和应用，旨在深入探讨该技术在现代生物科技领域中的应用价值。
一、基因克隆的原理与工具基因克隆是指将目标DNA片段放入载体中，通过复制和传递，获得大量相同的DNA分子的过程。
基因克隆需要用到一系列工具和分子生物学技术。
其基本的步骤包括：DNA提取、限制酶切割、连接和转化等。
DNA提取是指从细胞中获取目标DNA，一般从细胞核中提取DNA样品。
限制酶切割是一种利用特定的限制酶将DNA切割成不同长度的碎片的技术。
连接是指将目标DNA片段与载体DNA进行配对，在适当的连接条件下会形成一个大的DNA分子，也称作重组DNA。
最后的转化是将重组DNA重新引入一个宿主细胞，使其进行繁殖。
这些步骤组成了一个典型的基因克隆工作流程。
在基因克隆中，一些关键工具也是必不可少的。
例如，限制酶和DNA连接酶是进行酶切和连接的酶类；载体是将目标DNA载入的载体分子。
当然，在实验设计过程中，也需要考虑到多种子序列的选择，以获得最优的结果。
二、基因表达技术基因表达技术是指将克隆好的基因转录和翻译为蛋白质的过程。
基因表达技术所涉及的核心部分主要为转染和转录。
转染是指将载体转化到目标细胞中的过程。
转染可以分为多次批量的直接转染和、转染载体的两种方式。
对于细胞质和细胞核分离的情况，病毒载体或质粒载体也可以被用来介导转录。
质粒载体在转录的时候需要被移入到细胞的核中，由此促进了 DNA 受体和 RNA聚合酶之间的相互作用。
另一种重要的基因表达技术是转录，也称作转录调节。
转录调节可以分为两类：正调节和负调节。
正调节是指通过上调特定基因的表达、促进特定转录的过程；负调节是指通过下调特定基因的表达、抑制特定转录的过程。
转录调节受到多种因素的影响，例如转录因子和超融合酶等分子的运作。
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。
本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。
一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。
基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。
2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。
3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。
通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。
通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。
例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。
二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。
基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。
基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。
常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。
3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。
4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。
可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。
基因克隆与表达
基因克隆与表达基因克隆与表达是生物学领域中重要的技术手段和研究方法。
通过基因克隆和表达，科学家能够研究特定基因的功能、调控机制以及其在生物体内的作用，这对于深入了解生物体的生理过程和疾病发生机制具有重要意义。
本文将介绍基因克隆与表达的原理、方法以及应用。
一、基因克隆基因克隆是将特定基因从一个生物体中分离并复制到另一个载体中的过程。
这个过程主要涉及DNA的分离、复制和连接。
常用的基因克隆技术包括PCR、限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳和基因插入等。
1. PCR聚合酶链反应（PCR）是一种强大的基因扩增技术。
它通过不断地重复某一特定区域的DNA序列，使其得以大规模复制。
PCR可以在短时间内合成大量目标DNA片段，为基因克隆提供了充足的材料。
2. 限制性内切酶切割限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列。
通过选择合适的限制性内切酶，可以实现将目标基因从源DNA中切割下来，为下一步的基因克隆做好准备。
3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术。
通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，并施加电场，DNA片段会根据其大小在凝胶中迁移。
凝胶电泳可以帮助科学家分离和纯化目标基因。
4. 基因插入基因插入是将目标基因连接到载体上的过程。
载体可以是质粒、病毒或者人工染色体等。
通过连接酶的作用，目标基因与载体可以稳定地结合在一起。
二、基因表达基因表达指特定基因通过转录和翻译过程转化为蛋白质的过程。
从基因克隆到基因表达，可以分为以下几个步骤：转染或转化、筛选和检测。
1. 转染或转化转染是指将外源DNA导入到动物细胞中的过程，而转化是将外源DNA导入到细菌细胞中的过程。
转染和转化可以通过多种方法实现，如化学法、电穿孔法和基因枪法等。
2. 筛选筛选是为了确定是否成功将目标基因表达在宿主细胞中而进行的步骤。
常见的筛选方法包括荧光筛选和克隆筛选。
荧光筛选利用荧光蛋白标记目标基因，观察细胞是否出现荧光信号。
克隆筛选则利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的克隆。
基因工程7克隆基因的表达概述
7.3.1.2 终止子
提供转录停止信号的DNA序列称为终 止子，它可被RNA聚合酶识别并停止合成 mRNA。通常终止信号是一小段DNA片段 ，它的RNA转录本上碱基对可自身相互配 对形成柄-环结构。
强启动子是能维持高频率转录的启动子 ，通常控制那些细胞需要其大量转译产物的 基因转录；而弱启动子具有相对较低的转录 效率，指导那些仅需要其少量转译产物的基 因转录。
利用基因工程技术，可将由弱启动子所 控制的基因放在强启动子的下游，从而获得 高效表达。
两个保守区之间的DNA对启动子的功能 也有影响，各启动子都需要一些最适的间隙 ，通常认为间隙为17 bp的启动子功能较强。
(1) 能识别和除去外源基因中的内含子，加工 形成成熟的mRNA，即带内含子的天然基因是 可以利用的；
(2) 真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠杆 菌表达的蛋白是无糖基化的，糖基化对某些表 达蛋白的免疫原性影响很大。
真核细胞作宿主表达系统尚存在以下几个问 题：
(1) 转化真核细胞的效率低； (2) 表达效率不够高； (3) 细胞培养(动植物) 工艺较复杂，成本高； (4) 选择标记及选择系统较少。
2. 影响mRNA转译效果的因素：
(1) SD序列与反SD序列的互补程度：互补程 度高，则表达强。
(2) SD序列与AUG之间的间隔距离(spacer)， 使用不同的启动子，表达不同的基因，其 最佳间隔不一样。
(3) –20 bp到＋13 bp这一段序列中不要有二级 结构（发卡结构）。
(4) 连接在SD序列后面的4个碱基的改变，会 对转译效率发生很大的影响，如果这个区 域由4个A组成，其转译作用最为有效；而 当其被4个C或G替代，则转译效率仅为最高 值的25~50%。
《基因克隆与表达》课件
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
纤维素酶基因的克隆表达过程
纤维素酶基因的克隆表达过程
纤维素酶基因克隆表达过程包括：首先，从拟南芥或者其他植物
中提取纤维素酶原核基因，然后人工合成选定DNA片段，将其通过PCR
技术克隆到重组质粒上；其次，将重组质粒转入大肠杆菌中，并对细
胞培养条件进行优化，使得纤维素酶基因可以表达出来；之后，运用
分离系统，将纤维素酶分离成相应的蛋白种子，而后，利用离心方法，将可溶性蛋白种子进行沉淀；之后，可将纤维素酶基因克隆表达所得
的蛋白种子再经过离子交换柱色谱、梯度离心等处理，进一步分级纯化，获得一定的纤维素酶活性；最后，采用紫外光谱分析、免疫荧光
定量及其他物质分析，可以检测所得纤维素酶活性的水平是否符合理
想的要求。
综上所述，纤维素酶基因克隆表达过程可以分为：基因克隆、细胞表达、蛋白分离纯化和活性检测等步骤，最终能够获得特定
的纤维素酶活性，从而为下一步利用纤维素酶做准备。
第七章培养细胞中克隆基因的表达
第五节 基因定点敲除技术 （依赖同源重组）
ES细胞的基因寻靶（载体类型）
插入载体在同源区内线性 化，使整个载体插入目的 基因位点,打断了目的基 因 ，但也会使选择标记附 近的序列重复..
ES细胞的基因寻靶（载体类型）
替换载体在同源区域与 目的基因共线性.
转染前在同源区外切 割载体成线性。交换 会使内源DNA被导入 的DNA替换.
人体细胞——Semi-Permissive cell
第四节 哺乳动物中瞬时转化载体 （以SV40为例）
SV40病毒及其衍生的载体
1、SV40的生活史 SV40 是一个大约5.2
kb，双链环状 整个基因组有两个转录
单位,以相反方向转录 的早期基因区和晚期基 因区 两个转录区都能形成多 种产物
的孔洞，从而促使不同细胞之间发生原生 质体融合或促使细胞吸收外界环境中的 DNA分子
一、基因转染的策略
（四）、直接转化－ 微注射
真正的显微注射
穿刺
二、瞬时转染（转化）
外源DNA不与宿主的基因组DNA整合， 转化细胞在较短的时间内进行转录和翻译。
常用于较短时间的实验，如启动子功能检 测，蛋白质亚细胞定位等
三、稳定转化
外源基因整合到细胞染色体中，随着细胞 的分裂而传代（或子代的形成），产生稳 定的转基因细胞系（或个体）。
通常用于研究基因的功能或改变生物个体 的性状。
第三节：筛选阳性转基因动物 细胞的遗传标记
内源的选择标记
这些基因存在于野生型的细胞中 只能在相关基因发生了突变（失去功能）的突变
CTGTTGACAATTAATCAT CGAACTAGTTAACTAC GTGTTGACATAAATACCA CTGGCGGTGATACTGA
基因克隆与表达的研究方法
基因克隆与表达的研究方法基因克隆和表达是生命科学中重要的研究方法，它们在基因工程、药物研发、癌症治疗等领域发挥着重要作用。
在克隆和表达一个基因之前，需要先建立一个可重复的实验方法，以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将介绍基因克隆和表达的一些通用方法和技术。
1. PCR扩增PCR扩增是一种常用的克隆方法，它可以在短时间内高效地扩增DNA序列。
这种方法需要一对引物，在PCR反应中引物定向扩增目标序列。
PCR反应需要一个DNA模板、引物和聚合酶，在合适的反应条件和温度下进行。
PCR扩增后的产物可以纯化、酶切、克隆到表达载体上。
2. 限制性内切酶消化限制性内切酶消化是一种分子生物学技术，可以将DNA分子切成不同的长度，并生成暴露的粘性末端。
这样的末端可以与其他的DNA分子的互补末端连接起来，从而实现DNA的克隆。
在DNA克隆中，选择合适的限制性内切酶可以实现目标DNA序列的克隆。
3. 匀浆凝胶电泳匀浆凝胶电泳是一种检测DNA大小的技术，它可以用于确认PCR扩增产物的大小，鉴定DNA克隆的有效性以及纯化DNA等。
在匀浆凝胶电泳中，DNA样品被负载到凝胶上，并在电场作用下迁移。
根据DNA分子大小的不同，可以通过在凝胶上形成特定的DNA带和条带，从而检测DNA分子的大小。
4. 蛋白表达的研究方法蛋白表达是生命科学研究中重要的实验方法，可以获得对生命过程和重要分子的深入了解。
在蛋白表达中，需要克隆一个给定的基因到一个特定的表达载体上。
表达载体中包含能够转录和翻译蛋白质所需的所有元件。
在表达系统中，可以使用细胞培养、原核生物、真核生物等不同的宿主来表达蛋白。
5. 功能分析的研究方法在获得基因克隆和表达蛋白之后，需要通过功能分析进一步了解目标基因和蛋白的生物学功能。
在功能分析中，常用的方法包括基因敲除、蛋白互作、基因组学、蛋白质修饰等。
通过这些方法，可以深入研究生物学体系的信号传导、调节机制、发育和疾病机制等问题。
分子生物学：基因克隆及克隆基因的表达
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
互连后？
GCCTAG+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
6. 水浴槽
8. 电泳系统
分子克隆常用的有毒试剂
1. 溴化乙锭: （Ethidium bromide，EB）用来染DNA和RNA的染料, 是一种致癌物 质；它是DNA突变的诱变剂，可以嵌入DNA，使DNA发生突变，致癌。 有累积 效应，不要直接接触，但是要注意通过呼吸摄入，故此环境要通风。EB可以被 皮肤吸收。做实验的时候一定要带手套。但是，只要按照标准的操作使不会有问 题的。严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害 很大。
2. DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质， 是RNA酶的强抑制剂；DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的 条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的， 使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。
3.苯酚：苯酚又名酚或石碳酸,为高毒类原浆毒物,对人体危害严重。它的浓溶液 对皮肤有强烈的腐蚀性,苯酚所致的急性中毒常常造成死亡。 4. 氯仿：三氯甲烷，侵入途径：吸入、食入、经皮吸收。健康危害：主要作用 于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害。吸入或经皮肤吸收引起 急性中毒，初期有头痛、头晕、恶心、呕吐、兴奋、皮肤粘膜有刺激症状，以后 呈现精神紊乱、呼吸表浅、反向消失、昏迷等，重者发生呼吸麻痹、心室纤维性 颤动、并可有肝、肾损害。误服中毒时，胃有烧灼感、伴恶心、呕吐、腹痛、腹 泻以后出现麻醉症状。慢性中毒：主要引起肝脏损害，此外还有消化不良、乏力、 头痛、失眠等症状，少数有肾损害。 5. 十二烷基硫酸钠（SDS）：提取质粒使用的溶液II中含有SDS，对粘膜和上呼 吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。。 6. 其它常用的试剂如强酸强碱都有很强的腐蚀性。
基因克隆与表达
基因表达的检测方法
Northern blot：检测mRNA的方法，可用于检测基因的表达水平。
RT-PCR：通过逆转录和PCR技术，检测特定基因的表达水平。
Western blot：检测蛋白质的方法，可用于检测基因的表达产物。 免疫荧光技术：通过抗体与目标蛋白质的结合，利用荧光标记技术进行 检测。
基因克隆与表达的研究流程
同的后代。
克隆技术可以用 于繁殖动物、植 物和微生物，以 及用于生产转基 因生物和基因治
疗。
克隆技术的主要 步骤包括获取供 体细胞的DNA、 将DNA植入受 体细胞、培养产 生的胚胎并使其 发育成新个体。
克隆技术的优点 包括可以快速繁 殖具有优良性状 的动物和植物， 以及可以用于基 因治疗和药物生
产等领域。
生物安全：基因 克隆与表达技术 可用于检测和预 防生物威胁，如 生物武器和病原 体的传播，保障 公共安全。
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克隆技术的应用：克隆技术在医学、农业、生物技术等领域具有广泛的应用价值，例如 用于生产转基因动物、研究动物模型、繁殖濒危物种等。
克隆技术的分类
胚胎干细胞克隆技术 核移植克隆技术 转基因克隆技术 基因克隆技术
克隆技术的应用
添加项标题
克隆动物：通过基因克隆技术可以繁殖出具有相同基因的动物， 用于医学研究、药物筛选和动物模型建立等。
03 基因表达的调控
基因表达的概述
基因表达的定义：基因表达是指基因经过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质的过程。
基因表达的调控方式：包括转录水平的调控、转录后的调控和翻译水平的调控。
基因表达的调控机制：包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等。
基因表达的生物学意义：基因表达调控对于生物体的生长发育、代谢和环境适应性等方 面具有重要意义。目的基因的获取：通过基因、PCR、基因合成等方法获取目的基因
基因克隆及克隆基因的表达
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三、目的DNA与载体连接（接）
T4DNA ligase
LOGO
四、重组DNA转入宿主细胞进行扩增（转）
宿主细胞
感受态细胞（competent cell）：
处于易于接纳外源物质的状态的细菌
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几个相关概念：
Lac I
Prokaryotic Expression Plasmid
LOGO
一、原核宿主细胞 大肠杆菌（E.coli)
优点：简便, 快速、成本低 可高密度发酵培养 20-30min
注意：
12 hours Once 用来克隆基因和表达基因的菌株不一样， the recombinant system is established, it is cheap to manufacture.
T-载体：
T7
pMD18-T 2692bp
HindIII Spln PstI HincII AccI SalI
T
T
Xbal BamHI SmaI XmaI KpnI SacI EcoRI
LOGO Sp6
克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（二）常用克隆载体的种类
速高效表达基因产物。
真核表达系统： 外源基因引入真核细胞，使外源
基因在真核细胞中表达。
LOGO
第一部分.外源基因在原核细胞中的表达
原核细胞表达 系统组成
一、原核宿主细胞 二、原核表达载体
Recombinant Protein
wΒιβλιοθήκη
转化（transformation） 质粒或黏粒→细菌 质粒→酵母（真核细胞） 转染（transfection） 外源DNA→真核细胞（酵母除外） 感染（infection） 噬菌体颗粒→细菌 病毒颗粒→哺乳细胞
基因工程中的基因克隆与表达
基因工程中的基因克隆与表达基因工程是一门涉及分子生物学、遗传学、生物化学等多个学科的综合性科学。
其中，基因克隆和基因表达是基因工程研究的两个重要方面。
本文将就基因克隆和基因表达的原理、方法及应用进行探讨。
一、基因克隆1.原理基因克隆是指将目标基因从其天然基因组或其他来源中分离出来，并将其插入到另一个载体（如质粒）中，使其能够在宿主细胞内复制和表达。
基因克隆的原理是基于DNA序列特异性杂交的方法，利用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，然后将它们黏合在一起，形成重组DNA。
通过转形或感染，使重组DNA 进入宿主细胞内，并复制和表达。
2.方法基因克隆的方法主要有限制性酶切与黏合（RE-Mediated Ligation）、PCR（聚合酶链反应）、TA克隆和基因文库等。
限制性酶切与黏合是一种常用的基因克隆方法。
该方法利用限制性内切酶切割DNA，然后通过T4 DNA连接酶黏合在一起。
这种方法操作简单、效率高，但存在限制内切酶的局限性，无法应用于不同酶切位点的DNA。
PCR是用于复制DNA片段的重要方法，也可以用于基因克隆。
PCR方法可以在不使用限制酶的情况下，从任何源提取DNA片段，扩增需要的基因段，并使用酶切和连接技术插入到载体中。
TA克隆是指用于从PCR产物中克隆DNA的一种方法。
该方法利用了Taq聚合酶不完全特异性合成3'-末端斜伸的性质，使产生的末端序列与T自带的A进行互补配对，从而使PCR产物能够被直接连接到TA克隆载体上。
基因文库是一种重要的基因克隆技术，可以将许多目标基因同时克隆入同一载体中。
基因文库分为cDNA文库和基因组文库。
通过荧光筛选或选择性培养，可以从文库中筛选出感兴趣的基因。
3.应用基因克隆技术广泛应用于基因工程、疫苗制备、药物研发、作物改良、动物遗传改良、环境污染治理等领域。
例如，利用基因克隆技术可以创造出超级细菌、工业用酶、新型药物、高产优质作物等。
二、基因表达1.原理基因表达是指基因通过转录和翻译的过程，将DNA序列转化为蛋白质的过程。
基因克隆和表达在蛋白质功能研究中的应用
基因克隆和表达在蛋白质功能研究中的应用蛋白质是生命体内最为丰富和基本的生物大分子，其在生命体内承担着诸多重要的生命过程，如代谢、信号传递、免疫反应、细胞分裂等。
因此，对蛋白质的结构与功能进行研究具有非常重要的科学意义和实用价值。
在这方面，基因克隆和表达技术作为分子生物学研究的重要手段之一，已经被广泛应用于蛋白质结构与功能研究中。
一、基因克隆的原理和方法基因克隆是指将外源DNA序列插入到宿主DNA分子中并将其复制的过程。
它是构建重组DNA分子、获得纯化蛋白质和基因功能研究等生物学实验中必不可少的技术手段。
基因克隆技术的主要步骤包括：1、DNA提取：从目标细胞中提取出DNA2、PCR扩增：利用聚合酶链式反应技术，对目标基因进行扩增3、限制性内切酶切割：用限制性内切酶对扩增出的基因进行切割4、连接外源基因：将切割好的外源基因与质粒连接，构建出重组质粒5、质粒转化：将重组质粒导入宿主细胞中，使其在宿主细胞中稳定复制二、蛋白质表达的原理和方法蛋白质表达是指通过构建重组DNA分子的方式，使得目标蛋白质能够在宿主细胞中稳定表达的技术。
蛋白质表达技术的主要步骤包括：1、重组DNA构建：将目标基因与表达载体连接，构建成重组DNA分子2、宿主细胞转化：将重组DNA分子导入宿主细胞中，使其在宿主细胞中稳定复制3、蛋白质表达：宿主细胞利用其自身的蛋白质表达系统将目标蛋白质进行合成并进行折叠4、蛋白质纯化：利用各种不同的蛋白质纯化技术，将目标蛋白质进行纯化三、基因克隆和表达在蛋白质结构和功能研究中的应用1、蛋白质结构研究基因克隆和表达技术被广泛应用于研究目标蛋白质的结构。
例如，通过在目标蛋白质序列中引入特定的蛋白质标签，可以方便地提取出目标蛋白质，从而通过结晶学研究其晶体结构。
此外，基因克隆和表达技术也被广泛应用于核磁共振光谱、电镜等研究中，以研究蛋白质的结构。
2、蛋白质功能研究基因克隆和表达技术也被广泛应用于研究目标蛋白质的功能。
基因克隆技术及其在蛋白表达中的应用
基因克隆技术及其在蛋白表达中的应用基因克隆技术是一种将外源DNA片段转化到DNA质粒中的技术，其产物为克隆DNA分子。
这种技术可以应用于如生物医学、农业等领域中的研究和应用。
其中，蛋白表达是基因克隆技术的一个重要应用方向。
1. 基因克隆技术的原理和方法基因克隆技术的原理大致分为三个步骤：DNA分子的制备、限制性内切酶切割、DNA片段连接到载体DNA上。
DNA分子的制备涉及DNA提取、PCR扩增、酶切等技术，目的是获得含有目标DNA片段的DNA。
限制性内切酶切割是将DNA分子切割成特定的片段，目的是获得目标DNA片段。
DNA片段连接到载体DNA上是通过连接酶将DNA片段与载体DNA连接成DNA重组物质。
同样的，基因克隆技术的方法分为三种：限制性内切酶法、PCR扩增法和基因文库法。
2. 蛋白表达及其意义蛋白表达是指基因的DNA序列转化为相应的蛋白质。
蛋白质在生命体内十分重要，它们构成了生物体的各种器官和组织的结构，并且承担着许多生物学过程的重要作用，如酶的催化作用、免疫系统的维持、基因的调控等。
因此，蛋白表达在生物医学、农业等许多领域中具有无限的应用前景，包括生物药物生产、食品安全、草地生态建设等。
3. 基因克隆技术在蛋白表达中的应用基因克隆技术在蛋白表达中的应用主要分为两种：原核表达和真核表达。
原核表达是将外源DNA片段转化到大肠杆菌等细菌中，使其在细菌内部表达并获得蛋白质。
这种方法无需使用复杂的细胞系统，适用于简单的蛋白质表达。
真核表达是将外源DNA片段转化到哺乳动物或其他真核生物的细胞中，使其在细胞中表达并获得蛋白质。
这种方法对于复杂的蛋白质表达和修饰更为有效。
4. 基因克隆技术在生产生物药中的应用基因克隆技术在生产生物药方面的应用十分广泛。
这种方法的基本思想是：将人类基因移植到可表达该基因的外源宿主细胞中，并使该宿主细胞制造有效的蛋白质。
基因克隆技术可以生产生物药，如干扰素、人免疫球蛋白、重组胰岛素等，这些生物药可以更准确地控制疾病的进程，减轻患者的痛苦，并提高治愈率。
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2020/7/10
（2）信号肽（signal peptide）
能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需 要正确切割掉。
一般位于N端。
（3）常用的原核信号肽
①大肠杆菌的信号肽： phoA、OmpA、OmpT、OmpF、 LamB、β-内酰胺酶（lactamase）、 肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等
在大肠杆菌细胞内表达人生长激素 （human growth hormone, hGH）。
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2. 周质中表达
（1）周质（periplasm）
格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间 的细胞结构部分。
蛋白质从细胞质转运到周质的复杂 机理目前不完全清楚
如：pIN III系列： pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,
（1）组成结构
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① 强启动子：
Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5 启动子。 ②调节基因：lac I ③S-D序列和起始密码ATG。 ④分泌信号肽： 大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 ⑤插入位点区（多克隆位点）。
trpR 阻遏蛋白基因；P1 启动子； P2
O 操纵基因； 衰减子
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色氨酸操纵子
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（P1是主要启动子，P2的作用只有3%。）
没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因 结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。
trpR P1 O trpE trpD P2 trpC trpB trpA
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第七章 克隆基因的表达
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一、基因表达：
遗传信息从 DNA到蛋白质 的传递过程— —中心法则 （central dogma）。
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二、克隆基因的表达： 外源基因在宿主细胞中表达。
外源基因 表达载体
重组载体 提取蛋白
导入宿主细胞
在宿主细胞中 表达出蛋白质
ii）起始密码： 位于SD序列下游。 AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）
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2. RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录 tRNA，rRNA和mRNA。 （1）结构 全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2 两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。
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trp的-35区 lacUV5的-10区 ②操纵基因：
乳糖操纵子系统。 lac操纵基因
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③调节基因：
宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如JM105菌。
Lac I
④终止子： rrnB的强终止子 rrnB强终止子
⑤S-D序列和插入位点区： S-D 插入位点区
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⑥载体的其余部分： 来自pBR322质粒。
Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点
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pIN III-comA1 以pBR322为 基础构建的。 调节基因不必 借助于宿主的 lacI.
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3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列
表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载 体上的菌体蛋白连接在一起的。
转录↓
5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)
RNA折叠↓
mRNA折叠
C
UC
UG G—C
脱落
A—U
C—G
C—G
G—C
C—G
C—G G—C
RNA聚合酶
AA
CCCAC
UUUU—3
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱDNA
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4. 翻译终止密码
大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三 个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。
宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。
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第一节 外源基因在原核细胞中的表达
用原核生物作宿主。 原核或噬菌体启动子 SD序列 MCS 终止子
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A dividing E. coli
一、原核生物基因表达的特点
1. 只有一种RNA多聚酶 识别原核细胞的启动子，催化所有的 RNA合成。
Shine-Dalgarno（S-D） sequence:
含有一个启始密码子和一段同核糖体 16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫ShineDalgarno（S-D）序列。
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二、原核表达系统的注意事项 1. 外源基因不能带有内含子。 2. 必须用cDNA 3. 不能直接用真核基因组DNA。 4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等） 5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。
3. 转录终止子
在表达载体克隆位点的下游一般设计一 段转录终止子。
启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
内终止子 intrinsic terminator：
E.coli中促使转录终止的DNA位置有 一段反向回文顺序，其后紧接一串A， 称为内终止子，形成终止信号。
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原因：
① 茎环结构 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎 环结构，使转录物与模板之间配对的碱基 数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作
（1）优点 便于融合蛋白的分离和纯化。
（2）组成结构
①核糖体结合位点（ RBS） ribosome binding site
1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：
mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。 SD
mRNA 5’—AGGAGGU——AUG——
UCCUCCA 16S rRNA3’
S-D序列距离AUG的距离也影响翻
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用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性 融合蛋白；
或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。
由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分 泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不 太理想。
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五、几种类型的原核表达载体
1. 非融合型表达载体
2. 以操纵子为单位 数个相关的结构基因与其调控区结合形 成一个表达的协同单位。
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3. 转录和翻译偶联、连续进行。
5’
有意义链
3’
3’
反意义链
5’
转录
5’
mRNA
3’
翻译
N
蛋白质
C
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4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 5. 调控主要在转录水平上。 6. mRNA的核糖体结合位点
② 多聚A/U 由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性 比较差，有利于转录物脱落而不利于转录 延续。
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5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)
结合 不转录
阻遏物 色氨酸
trpC trpB trpA
用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、 操纵基因、和部分trpE基因。
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P1 O trpE 目的基因
（4）PL和PR启动子 是从噬菌体中得到的一类启动子，比lac启动 子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高。
cIII N PL/OL cI PM OR/PR Cro PE cII
载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的 任何蛋白质融合在一起。
S-D序列 ATG-外源基因-TAG
优点 产物结构接近于真核细胞体内的蛋 白质结构。
缺点： 容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。
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（1）pKK223-3 载体
哈佛大学的Gilbert实验室建立的。 表达能力强。 组成结构： ① 强启动子: tac（trp-lac）:
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表达载体常用的噬菌体启动子是PL。 调节基因cI 则是选择了一个温度敏感性的 突变基因cI857。 整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。
cI857 PL 外源基因
cI857:
28oC时阻遏PL，外源基因不转录。 42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录
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②金黄色葡萄球菌的蛋白A。 ③枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。 ④胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。
（2）真核信号肽
也能在细菌中起作用。
鼠源RNase、人生长激素信号肽。
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3. 胞外表达
使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分 泌到细胞外的培养基中。
5. 翻译增强子 Translation enhancer 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞 中的表达效率的特殊序列。
T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。
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6. 基因工程常用的原核启动子
（1）最佳启动子必须具备的条件
⑦表达诱导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）
宿主lac I
阻遏物
IPTG
tac P Lac O S-D 插入位点区 rrnB T
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条件： 必须选择一个有 lacI的宿主菌。
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2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信 号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周 质中。