shRNA原理及设计

shRNA原理及设计
RNAi概述：RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。

当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)。

由于RNAi 具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。

RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。

RNAi基本原理示意图：
RNAi类别：
1、siRNA合成：原理：在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。

激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。

化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。

2、microRNA干扰载体构建：原理：载体采用Pol II启动子表达人工设计的微小RNA (miRNA), 后者从长的转录本被加工，进而导致特异性的mRNA的降解。

3、shRNA干扰载体构建：短发卡RNA (shRNA) 是可以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA (siRNA, 19-21个核苷酸的RNA 双链)的DNA分子。

我们可根据靶标设计短发卡RNA (shRNA)序列并将其克隆到特定载体上。

4、慢病毒RNAi：原理：慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。

利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus－shRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

5、腺病毒RNAi：原理：腺病毒（adenovirus，AV）是一种没有包膜的线状双链DNA，它能感染分裂细胞和非分裂细胞，在核内以神经元细胞的形式复制，存在多种A V血清型。

到目前为止，构建的绝大多数载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方法取代E1或E3基因，降低病毒的复制能力。

这些重组病毒仅在表达高水平E1和E3基因的细胞中复制，因此适合应用于治疗的高效控制系统。

腺病毒载体能够高效传递和表达基因的能力（尤其是在体外），由于具有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；能有效进行增殖，滴度高；与人类基因同源；不整合到染色体中，无插入致突变性。

对于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞，采用病毒递送miRNA/shRNA的方式是非常有效的选择。

几个概念的区分：
shRNAs (RNA-Short hairpin RNAs)：即短发夹RNA，是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，可通过RNA干扰来抑制基因的表达。

Thomas Rosenquist和Greg Hannon小组联合研究了在哺乳动物种系细胞中shRNAs的转移导致基因长时间稳定沉默的机制。

microRNA（miRNA，微小RNA）是由内源性发夹（hairpin）结构转录产物衍生而来的一种长为19 nt~25 nt的单链RNA。

在每种高等动物中，存在200种以上的miRNA，是最大的基因家族之一，约占基因组的1%。

siRNA：(short/small interfering RNAs)：即小干扰RNA，是一种短片断双链RNA
分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径（RNA interference pathway）
miRNA，siRNA，dsRNA和shRNA都是RNA干扰技术中用到的小分子RNA，其不同之处在miRNA 是单链RNA，其余均为双链RNA；siRNA和dsRNA相似；shRNA需通过载体导入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。

miRNA与shRNA图示：
shRNA（短发夹RNA）的设计：
1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。

随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。

3.Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。

4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。

5.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。

如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。

6.ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。

不同大小和核苷酸序列的茎环都被
成功的运用过。

其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。

在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TCAAGAG3'序列最为有效。

7.5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录。

8.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。

这可能导致shRNA转录的提前终止。