仔猪肠道微生物菌群的研究

第二代测序技术-罗氏454焦磷酸测序技术
454测序法的步骤 （1）样品输出并片段化： GS系统支持各基因组DNA、PCR产物和细菌人工染 色体(BACs) 及cDNA、小分子RNA 的测序。先将基因组DNA 和BACs等通过物 理方法打断为300-800 bp 的片段,而对于短的小分子RNA 和PCR 产物, 则无需此 步骤。 （2）DNA 文库的准备：利用核酸内切酶、聚合酶和激酶的作用在DNA片段的 5′端加上磷酸基团,3′端变成平端,然后和两个44 bp 的衔接子( adaptor)A、B进行 平端连接。将样品5′端和3′端分别连接A和B衔接子。具有A B接头的单链DNA 片段组成了样品文库。
肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法）
分子生态学方法通常以环境中各种微生物的基因组核酸（DNA 或 RNA）为研究对象。在以肠道菌群为对象的分子生态学研究中，研究 者们最常使用核糖体小亚基RNA 基因（细菌中的 16S rRNA 基因）的 全部或部分序列作为分子标签来代表物种，以基因序列的多样性代表 物种的多样性，从而对菌群的组成结构进行分析。细菌 16S rRNA 基因 具有广泛性、进化变异小、具备高保守区和高变区（V 区）等特点， 同时序列还具有信息量巨大且更新迅速的公开数据库，如 Ribosomal Database Project（RDP）、SILVA 、Greengenes 等等，研究者们可以方 便地将自己研究中的 16S rRNA基因序列与数据库进行比对，确定细菌 的分类地位[9]。
第三阶段:断奶以后，基本类似与成年动物肠道菌群。
肠道菌群的研究方法进展（常规分离培养技术）
在肠道微生物学研究中，科学家们通常使用一定的选择 性液体或固体培养基，对粪便或肠道粘膜、肠道内容物等样 本进行培养和富集，并对培养得到的细菌种类进行分析[7]。 根据肠道细菌的特性，对肠道菌进行培养通常需要在厌氧的 条件下进行，严格的厌氧和培养基的选择对于肠道菌的分离 和生长具有非常重要的意义。
不同于指纹图谱技术，DNA 测序技术的目的在于通过直接获取序 列核酸信息的方法，对群落中各物种的进化地位作出判断。基于单克 隆质粒、转化细胞构建和桑格（Sanger）双脱氧法测序的 16S rRNA 基 因克隆文库长期以来广泛用于研究群落中微生物组成的方法。
第二代测序技术-罗氏454焦磷酸测序技术
焦磷酸测序法的原理 将PCR扩增的单链与引物杂交,并与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸
腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5′磷酸硫腺苷共同孵育,然后脱氧核糖核苷三磷酸即按照 碱基配对的原则依次连接到引物上。在每一轮测序反应中,只加入一种dNTP,若该dNTP与 待测模板配对, DNA 聚合酶可以将其掺入到合成链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团 ( PPi) 。ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的 荧光素向氧化荧光素( oxyluciferin)的转化,氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。 ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系,然后加入 下一种dNTP,如此循环[13]。
仔猪肠道微生物菌群的研究
目录
仔猪的肠道微生态 仔猪肠道菌群的形成 肠道菌群的研究方法进展
第二代测序技术-罗氏454焦磷酸测序技术 实验进展及后续实验计划
仔猪的肠道微生态
仔猪肠道微生物区系随宿主日龄增加逐渐变得复杂多样，且形成 一个相对动态平衡、稳定的微生态系统，对宿主的生长和健康起着重 要作用。但报道认为，自然界中很多微生物不能用现有的培养方法进 行分离和鉴定或是不能培养[1,2]，而且仔猪肠道中大部分微生物的生长 需要厌氧环境，因此人们对仔猪肠道及粪样微生物及其变化规律的了 解甚少。
肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法）
DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代 表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使 代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图 谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、 直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的 结构差异。最常用的 DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳 （Denatured gradient gelBaidu Nhomakorabeaelectrophoresis，DGGE）[10,11,12]和末端片段长 度多态性（Terminalrestriction fragment length polymorphism, T-RFLP） 等。
仔猪肠道菌群的形成
新生动物肠道菌群形成可以划分为以下几个阶段 [3,4,5,6]。
第一阶段:新生动物出生两周以内，肠道内的细菌定 植方式基本相同。结肠内首先出现杆菌和肠链球菌，随之 很快出现双歧杆菌并成为优势菌，这个时期肠道菌群的特 点是不稳定，容易发生变化。
第二阶段:出生后两周到断奶以前，动物在母乳喂养 下，肠道内细菌主要以厌氧菌为主，主要为双歧杆菌，肠 杆菌和链球菌数量较少。这个阶段的特点是肠道菌群容易 受食物的影响，食物的微小改变就可以引起肠道菌群发生 较大的变化。
但是，局限于纯培养的方法具有很多不足之处。首先， 体外培养体系难以模拟微生物在肠道中自然生长繁殖的条件， 因此绝大多数的肠道微生物都还不能通过纯培养的方法得到 分离；其次，仅仅依靠形态学和生理生化检测也不能对菌株 进行准确的鉴定[8]。因此，在研究肠道菌群结构和功能的研 究中，研究者们通常结合分离培养方法和分子生物学方法， 对感兴趣的细菌种类进行研究。
常用的分子生态学分析方法分为两大类：基于 DNA 指纹图谱的分 析方法和基于DNA 测序技术的分析方法。除此之外，可用于实时定量 的荧光定量 PCR（Real time quantitative PCR）和荧光原位杂交技术 （Fluorescence in situ hybridization, FISH）也是常用的分析手段。