用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型

1材料与方法
1. 1. 2 主要试剂环磷酰胺、RPMI 1640 培养
液( 含L-谷氨酰胺，)、Hanks 液( HyClone)、MTT 试剂、
PBS 缓冲溶液( pH 值7. 2 ～ 7. 4，HyClone)、丝裂霉素C、SA 缓冲液，绵羊红细胞，补体( 豚鼠血清)、都氏试剂、LDH 基质液、
P815 细胞( 购于协和医科大学基础医学细胞中心)、YAC-1 细
胞、FITC-Anti-CD3、PE-Anti-CD4、PerCP-Anti-CD8
荧光抗体)。

1. 2 动物与分组
Balb /C 小鼠90 只，雌性，6 ～ 8 周龄，体重18 ～ 22g。

颗粒饲料，室温(22 ± 2)℃，湿度60% ～ 80% 。

动物在实验室条件下检疫1 周后，实验分为3 项处理进
行，(1) 处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数;(2) 处理二:
测定NK 细胞活性，细胞毒性T 细胞活性;(3) 处理三:测定血
清半数溶血值。

每项处理随机分为空白对照组、CTX-1 组和
CTX-2 组。

1. 3 实验方法和测定指标
1. 3. 1 剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX
的LD50为240mg / kg，以1 /4 LD50做为本试验中CTX-1 组的
CTX 剂量，即60 mg / kg 环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给予。

CTX-2 组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔
注射给予动物200 mg / kg 环磷酰胺［2，3］( 用蒸馏水配制)。

另设空白对照组，蒸馏水代替受试物，每日经口给予。

动物灌胃
容积为0. 3ml /10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4 周
后测定各项免疫指标。

1. 3. 2 血液中T、B 淋巴细胞分类计数［4］动物处死前眼
眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3 支流式试管进行
测定，每管加入50μl 抗凝血。

分别在3 管中加入CD3 /CD19
，CD3 /CD4 /CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体。

每管加
入2ml FACS 红细胞裂解液，室温下避光保存20min。

1200r /
min 离心5min，弃去上清液。

每管再加入2ml PBS，1200r /min
离心5min，弃去上清液。

加入0. 5ml PBS 混匀后上流式细胞仪进行检测。

1. 3. 3 细胞毒性T 淋巴细胞活性试验［5，6］
1. 3. 3. 1 脾细胞悬液的制备( 效应细胞) 无菌取脾，用4 层
纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液。

用Hank＇s 液洗2 次，每次离
心10min(1000r /min)。

弃上清将细胞浆弹起，加入0. 5ml 灭
菌水20s，裂解红细胞后再加入5ml Hank’s 液，混匀后1000r / min，10min 离心，用1ml 含10% 小牛血清的RPMI1640 完全培
养液重悬，调整细胞浓度为2 × 107 个/ml;加0. 5ml 此细胞悬
液于24 孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照孔。

1. 3. 3. 2 制备刺激细胞1000r /min，10min 离心处于对数生
长期的P815 细胞，用5ml DMEM 培养液悬浮P815 细胞于
15ml 离心管中，计数细胞。

加入丝裂霉素C，相当于50μg / (2 ～ 5) × 107 个细胞。

用锡纸包裹离心管以避光，在37℃水浴
30min。

用Hank’s 液洗P815 细胞3 次，之后Hank’s 液悬浮
P815 细胞，室温孵育15 ～ 20min 后，离心1 次。

将P815 悬浮于培养液中，计数细胞及活性，调整终浓度为1. 2 × 106 个/ ml，加0. 5ml 此悬液于含有脾细胞悬液的24 孔( 包括对照孔) 板中。

37℃、5% CO2孵育5 天。

5 天期间，每隔一天换一次液。

1. 3. 3. 3 制备效应细胞收集24 孔培养板中的培养物，用Hank’s 液洗1 次，200r /min 离心10min，收集细胞，重悬于RPMI1640 培养液中，计数细胞及活性，调整细胞浓度2 × 107 / ml。

用完全培养液配制3 个系列稀释的细胞悬液，每个稀释
度100μl，做3 个复孔。

1. 3. 3. 4 制备靶细胞离心处于对数生长期的P815 细胞，
重悬于0. 5ml Hank’s 液里，离心后重悬于RPMI1640 完全培
养液，调整细胞浓度为2 × 105 个/ml。

1. 3. 3. 5 CTL 检测按效应细胞和靶细胞比为100∶ 1、50∶ 1、25∶ 1和1
2. 5∶ 1( 各加100μl) 在圆孔96 孔培养板的培养孔中加入细胞，每孔液体总体积为200μl，设3 个复孔。

同时设靶
细胞自然释放对照组(0. 1ml 靶细胞+ 0. 1m 培养液) 和最大
释放对照组(0. 1ml 靶细胞+ 0. 1ml 1% NP-40 液) ，效应细胞对照孔(0. 1ml 效应细胞+ 0. 1ml 培养液) ，用96 孔板水平转头500r /min 离心5min，37℃、5% CO2
培养4 ～ 6h。

1000r /min
离心5min，每孔吸取100μl 上清，加于另一ELISA 反应板的
孔中，每孔中加入新鲜配制的底物液50μl，室温避光反应
30min 后，每孔加入50μl 终止液，终止酶促反应。

在酶联检
测仪492nm 波长下读取各孔A 值，CTL 活性用杀伤率表示，
按如下公式计算:CTL 杀伤率(% ) = ( 实验孔A 值－靶细胞
对照孔A 值－效应细胞对照孔A 值) / ( 靶细胞最大释放孔A
值－靶细胞对照孔A 值) × 100% 。

1. 3. 4 NK 细胞活性测定
1. 3. 4. 1 靶细胞传代实验前24h 将靶细胞进行传代培养，
应用前以Hank’s 液洗2 次，用RPMI1640 完全培养液调整细
胞浓度为4 × 105 个_______/ml。

1. 3. 4. 2 效应细胞和靶细胞之比经纯化的小鼠脾细胞，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度。

效应细胞的数量为
5 × 10
6 个/ml，效应细胞和靶细胞之比为50∶ 1。

1. 3. 4. 3 NK 细胞活性测定反应孔加靶细胞和效应细胞各
100μl 于96 孔U 形培养板，靶细胞自然释放孔，加靶细胞和
培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1% 的NP40
或2. 5% Triton 各100μl，每样做3 个平行样。

37℃、5% CO2 条件下培养4h。

培养结束后，96 孔培养板1500r /min 离心
5min，每孔吸取上清100μl 置于平底96 孔板中，同时加入
LDH 基质液100μl，室温避光反应3min，每孔加入1mol /L 的
HCl 30μl，在酶标仪490nm 处测定A 值。

用下列公式计算:
NK 细胞活性(% ) = ( 反应孔A 值－靶细胞自然释放孔A
值) / ( 最大释放孔A 值－靶细胞自然释放孔A 值) × 100% 。

1. 3. 5 半数溶血值的测定(HC50
)
1. 3. 5. 1 制备补体采集豚鼠血，分离出血清( 至少5 只豚
鼠的混合血清) ，将1ml 压积SRBC 加入到5ml 豚鼠血清中，
放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装，－ 70℃保存。

用时以SA 液按1∶ 8稀释。

第3 期齐丽娟，等. 用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型315
1. 3. 5. 2 免疫动物及血清分离制备压积绵羊红细胞
( SRBC) ，并用生理盐水配成2% ( V /V) 的细胞悬液，每只鼠腹
腔注射0. 2ml 进行免疫。

4 ～ 5 天后，由动物眼眶内眦静脉取
血，2000r /min 离心10min 收集血清。

1. 3. 5. 3 溶血反应取血清用SA 缓冲液稀释( 一般为
200 ～ 500 倍)。

将稀释后的血清1ml 置试管内，依次加入
10% SRBC 0. 5ml，补体1ml( 用SA 液按1∶ 8稀释)。

另设不加
血清的对照管( 以SA 缓冲液代替)。

置37℃恒温水浴中保温
15 ～ 30min 后，冰浴终止反应。

2000r /min 离心10min。

取上
清液1ml，加都氏试剂3ml，同时取10% SRBC 0. 25ml 加都氏
试剂至4ml，充分混匀，放置10min 后，于540nm 处以对照管
作空白，分别测定各管光密度值。

按下列公式计算HC50。

HC50 =
样品光密度值
SRBC 半数溶血时的光密度值
×稀释倍数
1. 4 统计分析
采用SPSS 13. 0 统计软件进行方差分析或非参数检验。

2 结果
2. 1 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠体重及免疫器官重
量的影响
由表1 可见，CTX-1 组和CTX-2 组小鼠体重较对照组显
著降低(P < 0. 001)。

CTX-1 组小鼠脾脏绝对和相对重量较
对照组增高(P < 0. 001) ，CTX-2 组小鼠脾脏绝对和相对重量
较对照组降低(P < 0. 001，P < 0. 05)。

表1 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠体重及
免疫器官重量的影响
Table 1 The weight and absolute and relative
spleen weight in each group( n = 8，珔x ± s)
组别体重( g)
脾脏
绝对重量( g) 相对重量(% )
对照组22. 36 ± 1. 06 0. 071 ± 0. 007 0. 319 ± 0. 031 CTX-1 组16. 31 ± 2. 05 (3) 0. 081 ± 0. 018 (1) 0. 505 ± 0. 142 (2)
CTX-2 组19. 18 ± 0. 48 (3) 0. 047 ± 0. 009 (2) 0. 243 ± 0. 042 (1)
注:与对照组比较(1) P < 0. 05，(2) P < 0. 001
2. 2 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠淋巴细胞分类计数
的影响
由表2 可见，CTX-1 组小鼠外周血LYM 和LYM(% )、B
淋巴细胞( CD －3 CD +19) (% )、T 淋巴细胞( CD +3 CD －19) (% )、Th细胞(CD +3 CD +4 CD －8) (% ) 和Ts 细胞( CD +3 CD －4 CD + 8) (% ) 及Th /Ts 比值均较对照组显著降低(P < 0. 05) ;CTX-2 组小鼠外周血LYM 和LYM(% )、B 淋巴细胞(% ) 较对照组降低( P < 0. 001) ; CTX-2 组小鼠外周血T 淋巴细胞(% )、Th 细胞
(% )、Ts 细胞(% ) 及Th /Ts 比值较对照组增高( P < 0. 001，
P < 0. 001，P < 0. 05，P < 0. 05，P < 0. 001)。

表2 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠外周血淋巴细胞分类计数的影响
Table 2 Phenotypic analysis results of peripherial blood T lymphocytes in each group( n = 8，珔x ± s)
组别CD －3 CD +19(% ) CD +3 CD －19(% ) CD +3 CD +4 CD －8(% ) CD +3 CD －4 CD +8(% ) Th /Ts(% ) LYM LYM(% )
对照组15. 76 ± 7. 29 49. 88 ± 8. 58 29. 90 ± 13. 33 11. 08 ± 5. 18 2. 29 ± 0. 70 16. 60 ± 6. 20 67. 13 ± 7. 79 CTX-1 组0. 20 ± 0. 17 (3) 4. 03 ± 2. 00 (3) 1. 12 ± 1. 37 (3) 1. 34 ± 0. 84 (3) 0. 72 ± 0. 41 (3) 2. 89 ± 1. 95 (3) 56. 11 ± 15. 96 (2)
CTX-2 组3. 31 ± 1. 74 (3) 88. 37 ± 2. 95 (3) 65. 53 ± 23.
69 (1) 15. 96 ± 1. 38 (1) 4. 14 ± 1. 60 (3) 1. 97 ± 2. 28 (3) 11. 72 ± 3. 51 (3)
注:与对照组比较(1) P < 0. 05，(2) P < 0. 01，(3) P < 0. 001 2. 3 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠HC50、CTL 细胞活
性和NK 细胞活性的影响
由表3 可见，CTX-1 组和CTX-2 组NK 细胞活性(% ) 较
对照组显著降低(P < 0. 05)。

CTX-1 组和CTX-2 组CTL 细胞活性(% ) 均较对照组显
著降低(P < 0. 05)。

CTX-1 组和CTX-2 组小鼠HC50
均较对照组显著降低(P < 0. 05)。

表3 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠HC50、
CTL 细胞和NK 细胞活性的影响
Table 3 The HC50，CTL cell and NK cell activity changes in each group( n = 8，珔x ± s)
组别HC50CTL 细胞活性(% )NK 细胞活性(% )
对照组49. 24 ± 29. 93 7. 17 ± 4. 26 12. 16 ± 8. 30
CTX-1 组6. 89 ± 2. 23 (1) 2. 24 ± 1. 35 (1) 5. 96 ± 2. 80 (1)
CTX-2 组4. 05 ± 2. 19 (1) 2. 42 ± 2. 67 (1) 4. 67 ± 3. 57 (1)
注: (1) 与对照组比较P < 0. 05
3 讨论
环磷酰胺作为一种免疫抑制剂，已有大量研究表明其能
抑制动物的体液和细胞免疫应答，造成动物的免疫抑制［7-9］。

本实验研究结果表明:正常小鼠连续30 天灌胃CTX 60mg / kg (CTX-1 组) 和腹腔注射200mg / kg CTX( CTX-2 组) 1 天均引
起小鼠较为严重的免疫抑制。

外周血淋巴细胞数目和百分比
下降(P < 0. 01)、体重下降( P < 0. 001)、CTL 细胞活性和NK 细胞活性下降(P < 0. 05)、HC50
下降(P < 0. 05)。

有研究发现
环磷酰胺可引起脾脏萎缩［10，11］，本实验研究发现CTX-1 组小鼠脾脏绝对重量和相对重量增加，这可能是低剂量环磷酰胺
引起小鼠脾脏代偿性增生引起的，尚待进一步验证。

淋巴细胞亚群的稳定是维持机体正常免疫调节功能所必
需的，是评估机体细胞免疫功能的重要指标。

本研究表明两
组CTX 均使LYM 和LYM 百分比、B 淋巴细胞百分比下降，但
是与CTX-1 组不同之处在于，CTX-2 组T 淋巴细胞(% ) 升
高。

这可能提示高剂量环磷酰胺在短时间作用下对非T 淋巴
细胞有更明显的细胞毒作用，造成T 淋巴细胞比例的相对增
加。

而CTX-2 组Th 细胞(% )、Ts 细胞(% ) 及Th /Ts 比值也
升高，这可能提示环磷酰胺对不同亚类T 细胞的敏感性不同，
对Ts 细胞较敏感，而对Th 细胞敏感性稍差，从而导致Th /Ts
比值的相对升高［3，12］。

因此两组CTX 在一定程度上均干扰
了小鼠淋巴细胞亚群的稳定。

本研究提示连续30 天灌胃给予60mg / kg 环磷酰胺与一
次性腹腔注射200mg / kg 环磷酰胺均可建立环磷酰胺免疫低
下模型，但有文献报道环磷酰胺一次性大剂量给药造成的免
疫抑制维持时间一般不超过2 周［13］，不能满足保健食品起效周期长的特点。

且由于评价保健食品安全性所采用的给药方
式一般为经口给予，因此，经口给予环磷酰胺更能模拟受试物
体内代谢情况。

所以，本研究中连续30 天小剂量环磷酰胺给
药方式较适用于保健食品安全性评价中免疫低下模型的建
立。