应用环磷酰胺对免疫抑制模型的建立及免疫抑制模型的检测

应用环磷酰胺对免疫抑制模型的建立及免疫抑制模型的检测摘要目的：应用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型并检测免疫抑制模型建立是否成功方法：十六只小鼠分为四大组，每组四只。

将四只小鼠平均分为两组，分别为对照组和免疫抑制组，第一天对两组的四只小鼠进行初次免疫，对照组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，免疫抑制组小鼠分别注射0.4mlNS 和0.4mlOVA-AL(OH)3。

此后分别于第8、10、12、14天给对照组小鼠注射0.4mlNS，给免疫抑制组小鼠注射100mg/kg的CTX。

于第十五天对两组小鼠加强免疫，对照组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，免疫抑制组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，即四组分别为NS-NS组、OVA-NS组、NS-CTX组、OVA-CTX组，免疫抑制模型建立。

用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬墨汁试验对天然免疫功能进行检测，淋巴细胞转化试验对细胞免疫功能进行检测，双向免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验对体液免疫功能进行检测。

结果：细胞免疫的检测（淋转实验）结果全为阴性，吞噬细胞功能的检测（吞噬实验）结果为阴性，体液免疫的检测（双扩实验和ELISA）结果有三项测定项目为阳性。

结论：虽然本实验不足以证明CTX对免疫功能的抑制作用，但从一些数据可以看出CTX的免疫抑制功能。

AbstractObjective:cyclophosphamide was applied to establish the mice immunos uppression model and detection whether the immunosuppression model s uccess or not.Meyhod:Divid the 16 mice into four groups, each group of four. Divid the four mice into two groups, control group and immunosuppressive gro ups. On the first day giver primary immune to the two groups of fou mic e, Control group mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (OH) 3 0.4 ml, Immunosuppressive mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (O H) 3 0.4 ml. In 8, 10, 12, 14 days inject 0.4 ml NS to the control group mice, inject 100 mg/kg CTX to the immunosuppressive mice. In the fift eenth day give strengthen immunity to the two groups of mice. Control g roup mice were injected NS 0.4 ml and OVA - AL (OH) 3 0.4 ml, Immu nosuppressive mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (OH) 3 0.4ml, which means the four groups were NS-NS group, OVA-NS grpoup, NS -CTX group, OVA-CTX group.,Immunosuppression model is established. Use macrophage cell in abdominal cavity of mice phagocytosis ink expe riment to test the natural immune function, The lymphocyte transformatio n test to test the cellular immune function, double immunodiffusion test, ELISA to test the humoral immune function.Result: The results cellular immune detection (lymphocyte transformation test) were all negative, the result Phagocytes function detection (Consuming experiment) was all negative, three of the results of humoral immunity test ( double immunodiffusion test and ELISA) are positive.Conclusion：Although this experiment is not enough to prove that CTX ‘s inhibitory effect on the immune function, but the CTX’s immunosuppressive function can be seen from some of the datas.关键词：免疫抑制环磷酰胺固有免疫体液免疫细胞免疫引言目前化疗仍是临床上治疗肿瘤的三大有效手段之一,化疗在杀灭患者体内的癌细胞方面有很好的效果,但均有不同程度的毒副作用,如化疗后往往会出现白细胞减少,特别是中性粒细胞减少,血小板减少等情况，严重的会造成人体免疫功能降低甚至是免疫功能缺陷[1],随着肿瘤化疗的不断发展，肿瘤的治疗效果有了很大提高，但其免疫抑制的毒副作用却难以克服。

近年，对免疫增强剂的研究多有报道，在免疫增强剂的研究中，常用到免疫抑制模型，因此如何建立免疫抑制模型成为免疫增强剂作用评价的关键。

目前常用的化学造模剂有环磷酰胺、氢化可的松、地塞米松、环孢素A、长春新碱等。

环磷酰胺是治疗恶性肿瘤最常用的烷化剂代表药物，其作用主要是破坏DNA 的结构，从而阻断其复制，导致细胞死亡，具有广谱抗癌作用，是联合化疗、手术和放疗辅助化疗的常用药物之一。

[2]环磷酰胺作为一种免疫抑制剂，已有大量研究表明其能抑制动物的体液和细胞免疫应答，造成动物的免疫抑制。

本实验用环磷酰胺建立免疫抑制模型，从固有免疫和获得性免疫两方面用四种试验检验了免疫抑制模型是否成功建立。

1.材料与方法1.1材料试剂和器材：盐水（NS）、OVA+AL（OH）、33.5%苦味酸培养液（IMDM) 、5%FCS ConA （10µg/ml) 、白细胞计数液（2%冰醋酸）、MTT（5mg/ml)、二甲亚砜（DMSO)、 1.5%琼脂、PBS、洗液(PBS-Tween20)、封闭液、酶标抗体(HRP-GaM) Giemsa-Wrights 染液、5%苦味酸、酶标仪等。

实验动物：共分为四大组，每组将四只小鼠平均分为两组，分别为对照组和免疫抑制组，第一天对两组的四只小鼠进行初次免疫，对照组小鼠分别注射0.4mlNS 和0.4mlOVA-AL(OH)3，免疫抑制组小鼠分别注射0.4mlNS 和0.4mlOVA-AL(OH)3。

此后分别于第8、10、12、14天给对照组小鼠注射0.4mlNS，给免疫抑制组小鼠注射100mg/kg的CTX。

1.2方法1.2.1 加强免疫：对对照组和免疫抑制组的小鼠加强免疫，注射生理盐水（NS）：先用碘酒消毒小鼠头颈部，然后用1ml注射器吸取生理盐水0.4ml，在头颈部皮下注射生理盐水0.2ml，分3点注射；剩余的0.2ml进行腹腔注射。

注射OVA：先用碘酒消毒小鼠头颈部，将(OVA+ AL(OH)3)混合物0.4ml吸入1ml注射器中，注射方法同上。

1.2.2 T淋巴细胞转化试验细胞免疫功能检测（T淋巴细胞功能测定）：实验动物无菌取脾和胸腺，细胞计数，调细胞浓度后在三复孔中加样。

培养48小时后加入MTT，继续培养两小时，小心吸弃上清后加入DMSO震荡，使颗粒全部溶解，酶标仪测吸光度判定结果。

1.2.3 双向免疫扩散试验体液免疫功能B细胞功能检测：1.5%琼脂在微波炉内加热至完全溶解。

将刻度吸管预热后，用刻度吸管吸取5ml琼脂加在载玻片表面，冷却15min后形成均匀的琼脂凝胶。

倍比稀释抗血清，稀释度依次为1：1，1：3，1：7及1：15。

待琼脂凝固后，按照打孔纸样打孔，每张载玻片打两组梅花孔。

加样，Ag 和Ab每孔加满为止。

放入湿盒，37℃扩散24小时。

1.2.4 ELISA试验体液免疫功能（B细胞功能检测）：用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA）稀释（10μg/ml) 。

100 μl/孔加入聚苯乙烯酶标板中，4℃过夜。

弃去孔内溶液，加入150 μl/孔2%BSA（封闭液），43℃，60mins。

加样：弃去封闭液，加倍比稀释的待测免疫血清100 μl/孔43℃孵育40mins ；孵育结束后，用PBS-T洗液加满孔，每次3min，洗三次，在吸水纸上排干液体。

酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG)，100μl/孔，置43℃孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次3min，在吸水纸上排干液体。

于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100μl/孔，室温下避光显色。

加50 μl/孔2M硫酸(终止液)。

判定：肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的最高抗体稀释度为该抗体的效价。

酶标仪测量： 490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照孔A值相比其比值≥2，相对应的最高抗体稀释度为该抗体的效价。

1.2.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬墨汁试验天然免疫功能吞噬细胞功能：实验前2天，给小鼠腹腔注射3％淀粉溶液１ml。

给小鼠腹腔注射3％鸡红细胞悬液0.5ml，用苦味酸给小鼠做好标记，放回笼中；60min后脱颈椎处死小鼠。

立即用酒精棉球消毒，剪开腹部皮肤，用镊子提起腹膜，用5ml注射器向腹腔打入2ml生理盐水，轻揉腹部1min后用镊子提起腹膜，用剪刀将腹膜剪开一小口，用1ml加样器反复吹打腹腔液后吸出腹腔液加入EP管中备用。

充分吹打混匀EP管中的腹腔液后立刻吸取30ul加到玻璃板上并做好标记，再加Giemsa-Wright’s染液30ul 到玻璃板上的腹腔液中，静置染色2分钟。

盖上盖玻片到显微镜下观察计数。

2.结果及分析1.淋巴细胞转化试验结果分析：淋转实验结果如上表所示，由于小鼠脾脏和胸腺的刺激指数均2，不足以作为免疫功能抑制结果的依据，故小鼠的细胞免疫结果为阴性。