免疫抑制模型
钙调磷酸酶类免疫抑制剂大鼠模型尿液中尿酸、肌酐及葡萄糖的变化
钙 调 磷 酸 酶 类免 疫 抑 制剂 大 鼠模 型 尿 液 中 尿酸、 肌 酐及 葡 萄 糖 的变 化
何绿茵 ， 陈林强 ， 陈业辉 ， 仉 智 ， 林华欣 ， 李淼沅 ， 徐邦牢
（ １ ．广州 市第 一人 民 医院检验 科 广东省 临床 分子 医学及 分子 诊断 重点 实验室 ， 广东 广州 ５ １ ０ １ ８ ０ ，
２ ０ ０ ９ ， ３ ２ （ ６ ） ： ６ ０ ９ － ６ １ １ ．
价值 的尿有形成分分析仪 ， 在一定程度上可取代
显 微镜观 察 ， 但 仍 不 能完 全 替 代人 工 镜 检 。应 将 沉渣 法结 果 、 化 学 法 检 测 结 果 联 合 应 用 Ｊ ， 并 结
王延 群 ， 公衍文． Ｕ Ｆ 一 １ ０ ０ ０ ｉ 尿液有 形成分分析仪 、 干
２ ．广州市第一人民医院泌尿外科 ， 广东 广州 ５ １ ０ １ ８ ０ ）
摘要 ： 目的 观察尿量及尿液尿酸（ Ｕ Ａ） 、 肌酐 （ Ｃ ｒ ） 、 葡萄糖 （ Ｇ ｌ ｕ ） 含量在 肾移植术后 首剂治疗 剂量钙调磷 将ｓ Ｄ大 鼠 ２ ４只随机分 为对照组 、 环孢素 Ａ（ Ｃ ｓ Ａ） 组、 他克 莫司
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２ ４ ０・
检验 医学 ２ ０ １ ３年 ３月第 ２ ８卷第 ３期
Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙＭ ｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ， Ｍａ ｒ ｃ ｈ ２ ０ １ ３， Ｖ ｏ ｌ ２ ８ ．Ｎ ｏ ３
非 晶型盐 类 、 细菌 和类 细菌微 粒 附着 在 黏液丝 、 菌 丝等 物质 上 时 ， 仪 器 易 误 判 为病 理 性 管 型 。 由 于 仪器无 法 辨 别 病 理 管 型 类 型 ， 所以必须对 Ｕ Ｆ 一 ５ ０ ０ ｉ 提 示有 病理 管型 的标本 做镜 检确认 。 Ｕ Ｆ 一 ５ ０ ０ ｉ 在 检测 尿 液 中酵 母 样 菌 和结 晶 的特 异 性较 高 ， 分别 为 ９ ７ ． ４ ％和 ９ ６ ． ５ ％ ， 但 假 阴性 率 也较高 （ ２ ５ ． ４ ％、 ２ ０ ． ６ ％） ， 提示存 在 漏诊 现象。
免疫缺陷动物模型
裸小鼠的发现及其意义
●20世纪60年代后期，裸小鼠作为“活试管”，在肿瘤学、免疫学等 方面很快成为广为关注的研究领域. ●20世纪70年代以来，国际上先后召开了很多届“免疫功能缺陷动物 实验”国际讨论会，以裸小鼠为代表的各类免疫功能缺陷动物引起了 生命科学领域的广泛关注，至今方兴未艾。 ●目前国际上发现和培育了以B细胞功能缺陷为特征，来源于CBA/N小 鼠的Xid小鼠，自然杀伤（NK）细胞功能缺陷的Beige小鼠、巨噬细胞 机能异常的P/J小鼠等各类免疫缺陷动物模型。 免疫缺陷 ●借助生物遗传工程的研究手段，应用基因导入等育种技术，将不同 动物分类 类型的基因异常整合在同一动物体上，人工建立了许多联合免疫功能 联合免疫缺陷动物 缺陷动物（Combined Immunodeficiency Model）。
蛋白 质异 常
慢性肾脏疾病、急慢性消化道疾病， 大面积烧或烫伤时，体内蛋白质可大 量丧失；慢性消耗性疾病时蛋白质消 耗会增加；机体内的蛋白质合成不足。
后天继发性免疫缺陷病
长期 使用 药物
长期使用免疫抑制剂、细胞毒药 物和某些抗生素。
医源性 免疫缺 陷
放射 线损 伤
放射线治疗是一种有效手段，大多数 淋巴细胞对γ射线十分敏感，大剂量放 射性损伤可造成机体永久性免疫缺陷。
非特异 性免疫 缺陷
补体 系统 缺陷
机体内补体成分的组分或它的调控蛋 白发生遗传性缺陷所引起的疾病。
后天继发性免疫缺陷病
许多病毒、细菌、真菌及原虫感 染常可引起机体免疫功能低下。
感染
继发性 免疫缺 陷
恶性 肿瘤
患恶性肿瘤特别是淋巴组织的恶性肿 瘤时，常可进行性抑制患者的免疫功 能。广泛转移的癌症患者中常可出现 明显的细胞免疫与体液免疫功能低下。
实验小鼠针灸实验报告
一、实验背景针灸作为一种传统的中医疗法，在治疗多种疾病方面具有显著疗效。
近年来，随着科学研究的深入，针灸在实验动物模型中的应用逐渐受到关注。
本实验旨在探讨针灸对实验小鼠的免疫调节作用，以期为临床应用提供理论依据。
二、实验材料与方法1. 实验动物：选取健康昆明种小鼠32只，体重（20±2）g，随机分为空白对照组、模型组、针灸组。
2. 实验仪器：电针治疗仪、电子显微镜、酶标仪等。
3. 实验方法：（1）建立模型：采用环磷酰胺（CTX）诱导小鼠免疫抑制模型。
（2）针灸治疗：对针灸组小鼠进行电针治疗，选取“足三里”、“肾俞”、“肺俞”等穴位，每次治疗30分钟，每日1次，连续治疗7天。
（3）免疫指标检测：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平。
（4）细胞因子检测：采用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值。
（5）组织学观察：采用苏木精-伊红（HE）染色法观察小鼠脾脏组织形态学变化。
三、实验结果1. 免疫指标：与空白对照组相比，模型组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平显著降低（P<0.05）；与模型组相比，针灸组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平显著升高（P<0.05）。
2. 细胞因子：与空白对照组相比，模型组小鼠脾脏中CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值显著降低（P<0.05）；与模型组相比，针灸组小鼠脾脏中CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值显著升高（P<0.05）。
3. 组织学观察：与空白对照组相比，模型组小鼠脾脏组织出现淋巴细胞减少、组织结构紊乱等病理变化；与模型组相比，针灸组小鼠脾脏组织病理变化明显减轻。
四、讨论本实验结果表明，针灸可以显著提高实验小鼠的免疫功能，其作用机制可能与以下方面有关：1. 调节细胞因子水平：针灸可上调小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平，这些细胞因子在免疫调节中发挥重要作用，可增强机体免疫功能。
免疫抑制小鼠乳腺癌骨转移模型的构建和评价
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１ ８ ４・
广东 医学
２ ０ １ ４年 １月 第 ３ ５卷第 ２期
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免疫 抑 制 小 鼠乳 腺 癌 骨转 移 模 型 的构 建 和评 价 术
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免疫抑制小鼠侵袭性肺曲霉病动物模型的建立
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这些肿瘤免疫小鼠模型,别说你不知道
这些肿瘤免疫小鼠模型，别说你不知道订阅号APExBIO要说当今社会哪种癌症治疗手段最火热，癌症免疫疗法（Cancer Immunotherapy）当之无愧。
科学家们热衷于从免疫系统着手消灭肿瘤细胞。
自美国詹姆斯·艾利森（James P. Allison）和日本免疫学家本庶佑（Tasuku Honjo）因其开创性的癌症治疗方法获得2018年诺贝尔医学奖后，更是为癌症的免疫治疗增添了热度。
虽说免疫检查点抑制剂、癌症疫苗和细胞治疗等方面取得的成就为患者带来了希望，然而建立可以模拟人类疾病的免疫活性小鼠模型仍是一个重大挑战。
免疫疗法的临床前研究需要具有完整功能免疫系统的体内模型。
当前的临床前免疫治疗小鼠模型包括同源肿瘤模型、基因工程小鼠模型和人源化肿瘤模型，本文将浅谈这几种模型。
一、同源肿瘤模型▲同源肿瘤模型（Syngeneic tumor models）。
利用在体外生长和扩增的鼠肿瘤细胞系，将其注射（通常皮下或原位）到免疫活性（Immune-competent）宿主中。
这是最早出现和最常使用的临床前模型。
同源肿瘤模型是将永生化的小鼠肿瘤细胞系接种到近交品系小鼠中形成的同种移植模型。
肿瘤细胞系可以是自发性的、致癌物诱导的或转基因的。
受体小鼠拥有完整的鼠源免疫系统，具有完全的免疫活性（immuno-competent），且该免疫系统与同种移植肿瘤组织相容。
▲常见的同源肿瘤小鼠模型整理（包括鼠肿瘤细胞系、癌症类型、鼠宿主和使用的药物）同源模型易于建立，且有良好的免疫应答。
可以用免疫检查点抑制剂（例如抗PDL-1，抗PD-1，抗-CTLA-4）等药物来评估荷瘤小鼠中肿瘤免疫疗法的效果。
同源细胞系可以在实验室中轻松培养和大量扩增，这种模型价格低廉，操作起来相当简单且重复性强。
同系模型的另一个优点是宿主的免疫系统是正常的，这可能最大化模拟肿瘤微环境的真实生活情况。
缺点是移植的小鼠组织可能无法完全代表临床情况下人类肿瘤的复杂性。
免疫抑制小鼠肺白念珠菌感染模型的建立
天，给予 各 免 疫 抑 制 组 小 鼠 腹 腔 内 一 次 性 注 射 环 磷 酰 胺 200 mg / kg〔5〕，正常对照组注射同等量的生理盐水，常规饲养。 在免疫抑制前和抑制后的第 2 和第 3 天对小鼠尾静脉采血，瑞姬氏复合染色液染色后，于显微镜下白细胞计数。免疫抑制的 第 4 天开始，鼻滴组接种时，先用 0. 3% 戊巴比妥钠 80 mg / kg 腹腔注射麻醉小鼠后，使其保持直立位，用枪头吸取制备的菌 悬液40 μl缓慢交替滴入小鼠两侧鼻孔，至菌液完全吸收； 雾化 吸入组小鼠则置于自制的密闭雾化箱中，将制备的菌液 20 ml 倒入雾化杯中，调整雾化量，连续雾化吸入至雾化液无残留； 免 疫抑制组和正常对照组不予处理。 1. 2. 4 小鼠一般状态的观察 每日观察小鼠的活动、毛发、状 态及进食情况。 1. 2. 5 肺组织培养及病理学检查 免疫抑制鼻滴组及雾化吸 入组小鼠于连续染菌 8 d 后颈椎脱臼法处死，超净台中取出肺 组织，观察肺脏形态，无菌生理盐水冲洗，取一部分肺组织中加 入无菌生理盐水 200 μl 后匀浆，混匀吸取 30 μl 至沙氏培养基 上涂布培养 48 h 后观察； 剩余肺组织用 10% 甲醛溶液固定，石 蜡包埋切片，HE 染色，行病理学检查。 1. 3 统计学处理 计量数据以 x ± s 表示，用 SPSS19. 0 数据 统计软件进行 t 检验。
·2112·
中国老年学杂志 2012 年 5 月第 32 卷
鼻滴组小鼠接种白念珠菌后活动减少，体重逐渐下降。见图 1。 2. 3 肺组织匀浆培养结果 免疫抑制鼻滴组小鼠肺组织匀浆 在沙氏培养基上可见数十个乳白色、奶油状、边缘整齐的光滑
表 1 环磷酰胺对小鼠白细胞的影响（ × 109 / L，x ± s，n = 10）
环磷酰胺构建动物免疫抑制模型的研究进展
Chinese Journal of Veterinary Medicine中国兽医杂志㊀2019年(第55卷)第2期环磷酰胺构建动物免疫抑制模型的研究进展伍维高,钟金凤(湖南环境生物职业技术学院,湖南衡阳421005)中图分类号:O571.21+1㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:05296005(2019)02008703收稿日期:20180528基金项目:湖南省教育厅项目(16C0563);湖南省科技厅项目(2017JJ5026)作者简介:伍维高(1979-),男,畜牧师,硕士,研究方向为动物繁殖与生产,E-mail:30942422@通讯作者:钟金凤,E-mail:498379002@㊀㊀近几年来,动物疫病肆意流行,免疫接种成为预防传染病的有效措施之一,而免疫反应过程相当复杂,诸多因素会影响接种效果,如免疫抑制性疾病㊁不良的饲养环境㊁微量元素和蛋白质的缺乏等,常导致免疫接种失败,给生产带来不可挽回的重大损失㊂为提高机体抗病力,增强动物免疫力,免疫增强剂得以广泛运用㊂为了进一步研究此类制剂,人为构建免疫抑制模型的研究手段得到了诸多研究者的青睐㊂而环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX),以其诱导动物产生免疫抑制作用效果显著,且成本低廉,越来越广泛地运用到制备动物免疫抑制模型中㊂为此,本文对环磷酰胺构建免疫抑制模型进行综述㊂1㊀环磷酰胺的药理作用经口服或静脉注射的环磷酰胺主要在肝脏进行代谢,生成低毒性的4-羟基环磷酰胺和醛磷酰胺,分布全身,进一步降解为磷酰氮芥㊁丙烯醛和去甲氮芥,结合于快速生长细胞的DNA 上,产生强烈的细胞毒性㊂极少部分可进一步氧化成4-酮环磷酰胺和羧基环磷酰胺,无毒性,随尿排出[1]㊂2㊀CTX 免疫抑制机理2.1㊀环磷酰胺对免疫基因的影响2.1.1㊀抑制抗菌蛋白基因表达㊀内源性抗菌蛋白是天然免疫的重要组成部分,其中杀菌/渗透增强蛋白(Bactericidal /permeability increasing protein,BPI)㊁防御素(Defensins,DF)以及血小板型磷脂酶A 2(Phospholipase A 2,PLA 2)备受关注[2]㊂大鼠连续5d 腹腔注射环磷酰胺40mg /kg㊃bw,对照组注射等体积生理盐水,结果显示,对照组大鼠的睾丸㊁附睾㊁胸腺㊁肝㊁小肠㊁大肠6种器官均表达BPI㊁β-DF-1㊁血小板型PLA 2;而环磷酰胺组胸腺㊁肝无BPI 表达,睾丸㊁胸腺㊁肝无β-DF-1表达,睾丸㊁胸腺无血小板型PLA 2表达,其他有表达的组织中其含量比对照组低[3],试验提示,环磷酰胺可抑制体内抗菌蛋白基因表达㊂2.1.2㊀影响免疫相关基因的表达㊀环磷酰胺对免疫相关基因有一定影响㊂经环磷酰胺处理的荷瘤鼠脾脏㊁骨髓和血浆相关多种免疫调节因子基因上调,包括危险信号㊁模式识别受体㊁炎症介质㊁生长因子㊁细胞因子㊁趋化因子和趋化因子受体[4]㊂通过基因芯片技术检测环磷酰胺干预的胚胎干细胞发现:自体免疫激活和移植排斥相关基因如CD 3㊁CD 28㊁CTLA 4㊁MHC II ㊁PRF 1㊁GZMB 和IL-2R 基因下调,而免疫相关受体基因如IL 1R 2㊁IL 18R 1和FLT 3上调[5]㊂2.2㊀环磷酰胺对动物转录水平的影响2.2.1㊀抑制骨髓细胞相关mRNA 表达㊀环磷酰胺诱导骨髓抑制,造成骨髓细胞(BM)降低㊂雄性昆明种小鼠连续3d 腹腔注射150mg /kg㊃d 环磷酰胺,7d 后采骨髓细胞通过Real time PCR 检测发现,试验组BM 细胞钙敏感受体(Calcium-sensing recep-tor,CaSR)和丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activa-ted protein kinase,MAPK)mRNA 水平极显著高于对照组(P <0.01),引起BM 造血干细胞㊁间充质干细胞和内皮祖细胞增殖㊁分化和动员产生明显障碍[6]㊂2.2.2㊀调节细胞凋亡相关mRNA 表达㊀环磷酰胺对细胞凋亡的影响主要体现在两方面:增加促凋亡基因mRNA 表达而抑制抗凋亡基因mRNA 表达,从而诱导细胞凋亡㊂SPF 级NIH 雄性小鼠于试验期第9㊁11㊁13天腹腔注射环磷酰胺10mg /kg,于14d㊁28d 取脾脏采用半定量RT-PCR 检测促凋亡基因-Caspase-9mRNA 和抗凋亡基因-B 淋巴细胞基因2(B-cell lymphonma gene 2,BCL-2)的表达,两次结果均显示,模型组Caspase-9mRNA 表达较对照组显著升高而BCL-2mRNA 表达显著降低[7]㊂8~12周远78中国兽医杂志㊀2019年(第55卷)第2期Chinese Journal of Veterinary Medicine交系昆明种小鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg,1次/d,连续3d,第10天取小鼠脾脏测定凋亡相关基因,结果显示,BAX(Bcl-2associated X protein)mR-NA表达水平明显上升,而BCL-2mRNA表达明显下降[8]㊂2.2.3㊀降低免疫相关受体mRNA表达㊀环磷酰胺可降低免疫相关受体mRNA的表达㊂树突状细胞相关C-型凝集素-1(Dectin-1)和Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)主要表达在免疫细胞上,为免疫相关受体,与免疫状态有关[9]㊂给予150mg/kg环磷酰胺的BALB/c小鼠与第4㊁7㊁9天取肺组织测定Dectin-1mRNA,结果显示,在第4㊁7天肺组织Dec-tin-1mRNA表达较对照组明显下降(P<0.05)[10]㊂24只昆明种小鼠(雌性)腹腔注射环磷酰胺150 mg/kg,4h后肺泡巨噬细胞TLR2mRNA表达与对照组相比极显著下降(P<0.01);8h后TLR4mR-NA表达极显著降低(P<0.01)[11]㊂2.2.4㊀影响免疫因子mRNA表达㊀环磷酰胺对Th1㊁Th2类细胞因子mRNA表达均有不同程度影响㊂汪祯等[12]用SPF级昆明种小鼠按50mg/kg㊃bw剂量隔日腹腔注射环磷酰胺,共7次,14d后,无菌取脾脏测定IL-2mRNA㊁IL-10mRNA,结果显示, IL-2mRNA㊁IL-10mRNA表达水平与对照组相比显著下降;易有金等[13]腹腔注射40mg/kg㊃d环磷酰胺,结果显示,脾脏和胸腺中IL-2㊁IL-10㊁IL-12㊁IL-4㊁TNF-α和IFN-γmRNA的表达量降低,以上试验提示,环磷酰胺对Th1㊁Th2类细胞因子表达均呈现下调现象[14]㊂2.3㊀环磷酰胺对动物蛋白水平的影响2.3.1㊀抑制细胞周期相关蛋白表达㊀环磷酰胺降低着丝粒蛋白B(Centromere Protein,CenpB),Cen-pB是染色体着丝粒/动粒复合体上一种最重要的功能蛋白,其特异性结合位点位于着丝粒α1-卫星DNA上17bp的CenpB盒,参与着丝粒异染色质的形成,环磷酰胺可致CenpB蛋白含量异常,致细胞无法正常分裂㊂昆明种小鼠连续7d腹腔注射50 mg/kg㊃bw环磷酰胺,5d后取血通过Western Blot-ting方法检测CenpB蛋白,其含量显著低于对照组[15]㊂2.3.2㊀增加细胞凋亡相关蛋白表达㊀环磷酰胺可通过增加细胞凋亡蛋白的表达影响Fas/Fas L系统介导的凋亡蛋白㊂SPF级ICR纯种雄性小鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg㊃bw,用流式细胞术检测Fas 抗原(CD95)介导细胞凋亡的蛋白,其表达量与对照组相比显著升高[16]㊂人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat加入环磷酰胺3mg/L,于12㊁24㊁48h收取细胞,Western Blot检测FasL(Fas ligand,fas配体)和FADD(Floationg Point Addition,胞浆死亡信号衔接蛋白)表达,结果表明,未处理的细胞无FasL和FADD表达,而环磷酰胺处理组表达FasL和FADD,且表达水平随环磷酰胺刺激时间延长而增加[17]㊂除此,环磷酰胺能显著诱导Fas/Fas L下游蛋白Caspases产生[18],使凋亡不可逆进行㊂3 环磷酰胺在动物上的应用因环磷酰胺主要作用于快速生长细胞的DNA,并能从基因转录㊁翻译和蛋白表达等多方面产生细胞毒性㊂免疫细胞属于快速生长细胞,因此,环磷酰胺对免疫系统影响甚大,故可用环磷酰胺作为免疫抑制剂构建免疫抑制模型,这是环磷酰胺在动物上的主要用途㊂3.1㊀环磷酰胺抑制动物免疫器官㊀在环磷酰胺作用下鸡表现出形态退行性改变,包括腔上囊囊泡不发达,即腔上囊初级滤泡严重萎缩,皮质和髓质间隔不明显且滤泡间结缔组织严重增值[19]㊂Marsh J 研究发现,脾脏内正常椭球相关细胞在环磷酰胺作用后1周变为空泡[20]㊂3.2㊀环磷酰胺降低动物免疫细胞数量㊀连续3d 给7~8周龄雌性尼古拉斯火鸡注射环磷酰胺(0~ 100mg/kg㊃bw),测定血液学指标发现,环磷酰胺在初始注射后24~72h引起明显的白细胞减少㊁淋巴细胞减少㊁血小板减少和白细胞减少㊂但对单核细胞循环数㊁细胞体积㊁血浆蛋白无明显影响㊂同时,无法确定对嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的变化,因为它们在机体内的数量微量[21]㊂3.3㊀环磷酰胺减少免疫分子产生㊀研究表明,环磷酰胺可减少免疫分子产生:用80mg/kg㊃bw环磷酰胺腹腔注射小鼠,同位素标记法显示24h和48h其肠道蛋白损失显著高于对照组,连续2d注射环磷酰胺(50mg/kg㊃bw),可造成肠黏膜SIgA损伤,肠道固有层IgA表达量减少[22]㊂环磷酰胺(10mg/ kg㊃bw)与单剂量长春新碱(0.025mg/kg㊃bw,静脉注射)和单剂量的L-天冬酰胺酶(400IU/kg㊃88Chinese Journal of Veterinary Medicine中国兽医杂志㊀2019年(第55卷)第2期bw,静脉注射)同时注射狗,3d后抗体反应受抑制[23]㊂环磷酰胺在抑制免疫系统的同时,其他新陈代谢旺盛的组织如胃肠㊁毛发等亦会受影响,因此,用环磷酰胺造模的同时,动物可出现采食量降低㊁生长性能受阻㊁毛发脱落等现象[24-25]㊂4 小结环磷酰胺主要作用快速生长细胞DNA,并从基因水平㊁转录水平和蛋白水平影响免疫系统,它可下调抗菌蛋白基因㊁免疫相关基因的表达,增加促凋亡基因mRNA和抑制抗凋亡基因mR-NA转录,降低着丝粒蛋白B含量,抑制细胞正常分裂;诱导促凋亡蛋白Caspases产生,促使凋亡不可逆进行,从而广泛引起细胞周期改变㊁诱导细胞凋亡发生,最终表现出免疫器官㊁免疫细胞和免疫分子的现象,可广泛应用在动物免疫抑制模型上㊂参考文献:[1]㊀钟金凤,方热军.环磷酰胺免疫抑制机制及在动物模型上的应用[J].中国免疫学杂志,2016,10(32):15411546. [2]㊀Calafat J,Janssen H,Tool A,et al.The bactericidal/permeabili-ty increasing protein(BPI)is present in specific guanules of hu-man eosinophilsl[J].Blood,1998,91(12):44704475. [3]㊀王昕昕,梁宁生,张炜炜,等.环磷酰胺对抗菌蛋白的影响[J].黑龙江科技信息,2014(30):45.[4]㊀Moschella F,Valentini M,AricòE.et al.Unraveling cancer che-moimmunotherapy mechanisms by gene and protein expression pro-filing of responses to cyclophosphamide[J].Cancer Res,2011, 71(10):35283539.[5]㊀El-Serafi I,Abedi-Valugerdi M,PotácováZ,et al.Cyclophosphamidealters the gene expression profile in patients treated with high doses prior to stem cell transplantation[J].PLoS One,2014,9(1):111.[6]㊀徐尚福.人参皂苷Rg1对环磷酰胺诱导骨髓抑制小鼠骨髓功能的改善及机制研究[D].遵义:遵义医学院,2009. 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[13]㊀易有金,胡瞬,熊兴耀,等.灵芝孢子油对免疫低下小鼠免疫调节机制的初步研究[J].卫生研究.2012,41(5):833839.[14]㊀张俊,黄睿,郝迎迎,等.云芝糖肽对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠Th1/Th2平衡的影响[J].中国医院药学杂志.2013,33(13):19221925.[15]㊀董佳亮,张蕾.虫草素对环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠CenpB表达的影响[J].山东大学学报(医学版).2015,53(5):2428.[16]㊀杨丹丹,詹臻.温肾补阳方对实验性免疫低下小鼠胸腺免疫细胞分化影响的实验研究[J].江苏中医药.2005,26(3):5153.[17]㊀刘家浩,唐洪丽,阮为勇,等.环磷酰胺诱导白血病细胞株凋亡及FasL㊁FADD基因蛋白表达[J].江苏医药,2006,32(8):710712.[18]㊀Louis W C,Wings T Y.The Differential Effects of Cyclophospha-mide,Epirubicin and5-Fluorouracil on Apoptotic Marker(CPP-32),Pro-Apoptotic Protein(p21WAF-1)and Anti-ApoptoticProtein(bcl-2)in Breast Cancer Cells[J].Breast Cancer ResTr,2003,80(3):239244.[19]㊀El-Abasy M,Motobu M,Nakamura K,et al.Preventive andtherapeutic effects of sugar cane extract on cyclophosphamide-in-duced immunosuppression in chickens[J].Int Immunopharma-col,2004,4:983990.[20]㊀Marsh J,Glick B.The effect of cyclophosphamide on bursal andsplenic dendritic cells[J].Poult Sci,1992,71(1):113119.[21]㊀Ficken M D,Barnes H J.Effect of Cyclophosphamide on Select-ed Hematologic Parameters of the Turkey[J].Avian Diseases,1988,32(4):812817.[22]㊀Saxena A K,Singh G.Cyclophosphamide modulates gene expres-sion in neonatal rat testis following antenatal exposure to fetusesduring testicular differentiation[J].Arch Androl,1999,42(3):205210.[23]㊀Medleau L,Dawe D L,Calvert C A.Immunosuppressive effectsof cyclophosphamide,vincristine,and L-asparaginase in dogs[J].Am J Vet Res,1983,44(2):176180. 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免疫抑制剂的分类
1969-1970年瑞士山道士公司在巴塞尔微生物研 究所进行抗真菌药物筛选时,从美国和挪威土壤 中分离到两种不完全真菌即光泽柱孢菌和多孔木 霉(后正名为雪白白僵菌)产生窄谱抗真菌抗生素 即环孢素。
1974年进行动物体内免疫抑制活性研究 1978年首次应用于临床肾移植实验 1980年实现CsA全合成 1983年FDA批准用于临床器官移植
中性十一环肽化合物
作用机制： 抑制T细胞活化过程中IL-2 基因的转录 增加TGF-β的表达
IL-2： 活化的T细胞产生 T细胞增殖和产生细胞因子 B细胞增殖分泌抗体
NF-AT
是一种T细胞特异性转录因子 完整的NF-AT有两个亚基组成： NF-Atn位 于核内， NF-Atc位于胞浆内
是第一个用专门设计的免疫抑制剂筛选模型筛选 出来的免疫抑制剂, 同时发现具有抗真菌活性 1988年阐明结构
1989年完成化学合成
1994年FDA批准作为器官移植用的免疫抑制剂应用
于临床
在结构上与CsA不相关，但两者作用机制相似，均 通过钙调磷酸酶的作用而阻断IL-2 的转录
不同点： FK506胞内的结合蛋白为 FKBP, FK506的肾毒性要比CsA小得多，因而治疗 窗口要大得多 FK506免疫抑制作用约为CsA的100倍，不良 反应亦较CsA少，故有望取代CsA成为器官 移植术后首选的免疫抑制剂 联合用药亦可取得协同效应
化学性质：
是一种中性、高亲脂性的由11个氨基酸组 成环聚肽免疫抑制剂。 氨基酸序列变异大，尤其是在2位 除CsA外，其天然的同系物有30多种
Me Me CH (MeLeu) CH2 Me
一种基于受体编辑和免疫抑制的人工免疫系统模型
免疫抑制小鼠肺白念珠菌感染模型的建立
1 Tsai PW，Yang CY，Cheng HT，et al. Human antimicrobial peptide IL-37 inhibits adhesion of candida albicans by interacting with yeast cell-wall carbonhydrates〔J〕. PLoS ONE，2011； 6（ 3） ： e17755.
免疫抑制小鼠肺白念珠菌感染模型的建立
许 群 眭 建 （ 江苏大学临床医学院，江苏 镇江 212001）
〔摘 要〕 目的 建立免疫抑制小鼠肺部白念珠菌感染模型，为相关的感染研究提供科学依据。方法 ICR 小鼠一次性腹腔注射环磷酰胺 200 mg / kg，尾静脉采血计数白细胞。鼻滴组小鼠每天经双侧鼻孔滴入浓度为2 × 109 cfu / ml 的白念珠菌悬液 40 μl； 雾化组小鼠每天吸入浓度为 2 × 109 cfu / ml 的白念珠菌悬液 20 ml，连续感染 8 d 后处死小鼠，行组织培养和病理学检查。结果 环磷酰胺注射后，小鼠白细胞数明显下降。鼻滴组肺 组织培养可见乳白色光滑菌落生成，病理切片可见大量炎细胞浸润，肺泡结构紊乱，肺泡腔内可见弥散的红细胞。雾化组培养未见菌落生成，病理表 现为炎症反应。结论 降低小鼠免疫力，应用鼻滴的方法可以建立小鼠肺部白念珠菌感染模型。
一般情况免疫抑制鼻滴组小鼠在第3和第5天鼻滴接刘青梅等肠康颗粒对溃疡性结肠炎大鼠no水平及nos活力的影响第1o期在白念珠菌感染的研究领域中建立起一个简单可重复的标准化的肺部动物感染模型能为进一步探索发病机制疾病的发展过程新型抗真菌药物的研制及影像学方面的表现提供一个良好的方法将有助于新的诊疗方案的提出
图 1 各组小鼠体重变化趋势图
单次大剂量、多次小剂量环磷酰胺腹腔注射构建小鼠免疫抑制模型对比观察
单次大剂量㊁多次小剂量环磷酰胺腹腔注射构建小鼠免疫抑制模型对比观察李燕华ꎬ梁月琴ꎬ夏洪颖ꎬ王崇静ꎬ李仲昆昆明市延安医院ꎬ昆明６５００５１㊀㊀摘要:目的㊀对比观察单次大剂量㊁多次小剂量环磷酰胺(ＣＹ)腹腔注射构建小鼠免疫抑制模型的效果ꎮ方法㊀３０只ＩＣＲ健康雄性小鼠随机分为单次组㊁多次组㊁对照组各１０只ꎬ单次组在实验第７天腹腔注射１００ｍｇ/ｋｇ的ＣＹꎬ多次组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射５０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)的ＣＹꎬ对照组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射等量生理盐水ꎮ比较各组小鼠体质量㊁脾脏指数㊁胸腺指数㊁ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量ꎮ结果㊀与空白组比较ꎬ单词组实验第８ｄ及多次组实验第３㊁５㊁７㊁８ｄ体质量降低(Ｐ均<０.０５)ꎻ与多次组比较ꎬ单次组实验第３㊁５㊁７㊁８ｄ体质量升高(Ｐ均<０.０５)ꎮ与空白组比较ꎬ单词组和多次组脾脏指数㊁胸腺指数降低(Ｐ均<０.０５)ꎻ与多次组比较ꎬ单次组脾脏指数㊁胸腺指数降低(Ｐ均<０.０５)ꎮ与空白组比较ꎬＰＰｓ计数㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量降低ꎬＣＤ３＋细胞比例升高(Ｐ均<０.０５)ꎻ与多次组比较ꎬ单词组ＰＰｓ计数㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量降低ꎬＣＤ３＋细胞比例升高(Ｐ均<０.０５)ꎮ结论㊀单次大剂量和多次小剂量的ＣＹ均可建立免疫抑制动物模型ꎬ前者对小鼠体质量影响更小ꎬ且造模效果佳ꎮ㊀㊀关键词:环磷酰胺ꎻ动物模型ꎻ免疫抑制模型㊀㊀ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣２６６Ｘ.２０２０.０３.０１１㊀㊀中图分类号:Ｒ９６５㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀文章编号:１００２￣２６６Ｘ(２０２０)０３￣００４２￣０５ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｉｎｇｌｅｈｉｇｈｄｏｓｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｌｏｗｄｏｓｅｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅａｂｄｏｍｉｎａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｕｓｅｍｏｏｌｅｌｓＬＩＹａｎｈｕａꎬＬＩＡＮＧＹｕｅｑｉｎｇꎬＸＩＡＨｏｎｇｙｉｎｇꎬＷＡＮＧＣｏｎｇｊｉｎｇꎬＬＩＺｈｏｎｇｋｕｎＹａｎᶄａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＫｕｎｍｉｎｇＣｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５００５１ꎬＣｈｉｎａ基金项目:昆明市卫生科技人才培养项目(２０１６ＳＷＲＣ)ꎮ通信作者:李仲昆(Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙａｙｙｌｚｋ＠１６３.ｃｏｍ)[１１]ＶｉｔｏｒａｔｏｕＤＩꎬＴｏｌｉａＭꎬＬｉａｋｏｓＰꎬｅｔａｌ.Ｃｌｉｎｉｃａｌｖａｌｕｅｏｆｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｃｅｏｆｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅＦａｃｔｏｒ￣１αꎬｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ￣１ａｎｄｃａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙｄｒａｓｅＩＸｉｎｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒａｆｔｅｒｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅｃｈｅｍｏｒａ￣ｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ[Ｊ].ＪＢｕｏｎꎬ２０１９ꎬ２４(２):４５６￣４６３.[１２]熊艳峰ꎬ赖晓红ꎬ梁桦ꎬ等.七氟醚对单肺通气大鼠肺癌ＨＩＦ１α/ＥＭＴ通路活性及侵袭力的影响[Ｊ].实用医学杂志ꎬ２０１８ꎬ３４(１２):１９７０￣１９７２.[１３]ＬｉＹＸꎬＤｉｎｇＳＪꎬＸｉａｏＬꎬｅｔａｌ.Ｄｅｓｆｅｒｏｘａｍｉｎｅｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｉｎｒａｔｓｂｙｉｎｄｕｃｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１ａｌｐｈａａｎｄｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ[Ｊ].ＮｅｕｒｏｓｃｉＢｕｌｌꎬ２００８ꎬ２４(２):８９￣９５.[１４]ＣｈｅｎＹꎬＦａｎＺꎬＬｉａｏＬꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｙｐｅｒｂａｒｉｃｏｘｙｇｅｎｔｈｅｒａｐｙｗｉｔｈｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅｏｎｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｓｃｈｅ￣ｍｉａ￣ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＪＣｏｌｌＰｈｙｓｉｃｉａｎｓＳｕｒｇＰａｋꎬ２０１９ꎬ２９(１０):１０１６￣１０１７.[１５]蒋智永ꎬ胡子健ꎬ孟承颖ꎬ等.ＨＩＦ￣１α对大鼠内皮细胞通透性的影响及作用机制[Ｊ].安徽医科大学学报ꎬ２０１９ꎬ５４(７):１６０１￣１０６５.[１６]ＺｈｏｕＹꎬＦａｔｈａｌｉＮꎬＬｅｋｉｃＴꎬｅｔａｌ.Ｒｅｍｏｔｅｌｉｍｂｉｓｃｈｅｍｉｃｐｏｓｔｃｏｎ￣ｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｎｅｏｎａｔａｌｈｙｐｏｘｉｃ￣ｉｓｃｈｅｍｉｃｂｒａｉｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｐｕｐｓｂｙｔｈｅｏｐｉｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ/Ａｋｔｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].Ｓｔｒｏｋｅꎬ２０１１ꎬ４２(２):４３９￣４４４.[１７]孙志超.胃癌中ＨＩＦ￣１α㊁ＶＥＧＦ和ＥＧＦＲ的表达及临床病理意义[Ｊ].齐齐哈尔医学院学报ꎬ２０１８ꎬ３９(２４):２８５６￣２８５９. [１８]ＫｉｔａｕｒａＪꎬＭｕｋａｉＳꎬＭｏｒｉｍｏｔｏＨꎬｅｔａｌ.Ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌｈｅｍａｔｏｍａａｆ￣ｔｅｒｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｃｅｒｅｂｒａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｉｎａｐａ￣ｔｉｅｎｔｗｉｔｈａｈｉｓｔｏｒｙｏｆｔｏｔａｌａｏｒｔｉｃａｒｃｈｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ[Ｊ].ＫｙｏｂｕＧｅ￣ｋａꎬ２０１９ꎬ７２(９):６７３￣６７６.[１９]ＬｉｕＢＮꎬＨａｎＢＸꎬＬｉｕＦ.ＮｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐＡｋｔａｎｄＨＩＦ￣１αｏｎｉｓｃｈｅｍｉａｒａｔｓ[Ｊ].ＡｓｉａｎＰａｃＪＴｒｏｐＭｅｄꎬ２０１４ꎬ７(３):２２１￣２２５.[２０]ＣｈｅｎｇＺꎬＬｉＬꎬＭｏＸꎬｅｔａｌ.Ｎｏｎ￣ｉｎｖａｓｉｖｅｒｅｍｏｔｅｌｉｍｂｉｓｃｈｅｍｉｃｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｓｒａｔｓａｇａｉｎｓｔｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｂｙｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＳＴＡＴ３ａｎｄｒｅｄｕｃｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ[Ｊ].ＩｎｔＪＭｏｌＭｅｄꎬ２０１４ꎬ３４(４):９５７￣９６６.(收稿日期:２０１９￣１０￣１４)２４㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｉｎｇｌｅｈｉｇｈｄｏｓｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｌｏｗｄｏｓｅｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ(ＣＹ)ａｂ￣ｄｏｍｉｎａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｔｈｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＴｈｉｒｔｙｈｅａｌｔｈｙｍａｌｅＩＣＲｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈＣＹ１００ｍｇ/ｋｇｏｎｔｈｅ７ｔｈｄａｙꎬｔｈｅｍｉｃｅｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈＣＹ５０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)ｏｎｔｈｅ１ｓｔꎬ３ｒｄꎬ５ｔｈａｎｄ７ｔｈｄａｙｓꎬｗｈｉｌｅｔｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅｏｎｔｈｅｔｈｅ１ｓｔꎬ３ｒｄꎬ５ｔｈａｎｄ７ｔｈｄａｙｓ.ＴｈｅｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔꎬｖｉｓｃｅｒａｌｉｎｄｅｘꎬｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘꎬＰＰｓｃｏｕｎｔꎬｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ３＋ꎬｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ１９＋ａｎｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＳＩｇＡｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍｉｃｅｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｂｅｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｏｎｔｈｅ８ｔｈｄａｙａｎｄｉｎｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｏｎｔｈｅ３ｒｄꎬ５ｔｈꎬ７ｔｈａｎｄ８ｔｈｄａｙｓｄｅｃｒｅａｓｅｄ(ａｌｌＰ<０.０５).Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｖｉｓｃｅｒａｉｎｄｅｘａｎｄｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(ｂｏｔｈＰ<０.０５)ꎻｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｖｉｓｃｅｒａｉｎｄｅｘａｎｄｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(ｂｏｔｈＰ<０.０５).ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＰＰｓꎬｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ１９＋ａｎｄｉｎｔｅｓｔｉ￣ｎａｌｍｕｃｏｓａＳＩｇＡｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ３＋ｉｎ￣ｃｒｅａｓｅｄ(ａｌｌＰ<０.０５).ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＰＰｓꎬｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ１９＋ａｎｄｉｎ￣ｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＳＩｇＡｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ３＋ｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(ａｌｌＰ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＢｏｔｈｔｈｅｓｉｎｇｌｅｈｉｇｈｄｏｓｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｌｏｗｄｏｓｅｓｏｆＣＹｃａｎｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｏｆｉｍｍｕｎｏｓｕｐ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎꎬａｎｄｔｈｅｆｏｒｍｅｒｈａｓｌｅｓｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔａｎｄｂｅｔｔｅｒｍｏｄｅｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅꎻａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓꎻｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｄｅｌｓ㊀㊀免疫器官㊁免疫细胞和免疫分子共同组成了免疫系统ꎬ是对抗感染和肿瘤至关重要的因素[１]ꎮ近年来ꎬ由环境污染㊁生态失衡等所引发的免疫抑制性疾病的发病率逐年上升ꎬ而建立适合的免疫抑制模型对进一步研究该类疾病尤为重要[２]ꎮ环磷酰胺(ＣＹ)是一种抗肿瘤药物ꎬ其也具有显著的免疫抑制作用[３]ꎬ是治疗免疫疾病的常用药物ꎬ特别在作为联合应用的免疫调节剂和抗肿瘤药物方面已广泛应用[４ꎬ５]ꎮＣＹ在抑制癌细胞增殖的同时ꎬ也抑制免疫细胞的增殖ꎬ可造成机体免疫应答(包括体液免疫和细胞免疫)的全面抑制ꎮ因此ꎬ许多国家和国际机构均推荐ＣＹ作为免疫毒性的阳性物[６~８]ꎮ采用ＣＹ建立免疫抑制模型的方法常采用单次大剂量(１００㊁１５０ｍｇ/ｋｇ)和多次小剂量[２０㊁４０㊁８０ｍｇ/ (ｋｇ ｄ)]两种给药方法ꎬ但是较大剂量[８０ｍｇ/ (ｋｇ ｄ)]腹腔连续注射３ｄ后可造成实验后期动物的死亡[９]ꎮ为减少实验动物的病死率ꎬ提高造模的成功率ꎬ为免疫抑制实验模型的建立提供参考ꎬ本研究采用单次大剂量注射和小剂量多次注射的给药方法制备小鼠免疫抑制模型ꎬ并对小鼠的体质量及末次注射ＣＹ后２４ｈ的脏器指数㊁肠道黏膜派氏结(ＰＰｓ)计数㊁肠道黏膜ＰＰｓ淋巴细胞表型㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量等免疫指标进行比较ꎬ旨在为选择ＣＹ制备免疫抑制模型时的合适剂量提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验动物㊀ＳＰＦ级ＩＣＲ雄性小鼠３０只ꎬ６~８周龄ꎬ体质量(２０ʃ２)ｇꎬ购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司ꎬ动物许可证号ＳＣＸＫ(湘)２０１１￣０００３ꎮ１.２㊀药物㊁试剂及仪器㊀０.９％氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司ꎬ生产批号ａｄ１６０２０１ｂ２)ꎻ注射用ＣＹ(江苏盛迪医药有限公司生ꎬ批号１７１０２５２５)ꎻＤＡＢ试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司)ꎮ抗小鼠ＣＤ３ｅ￣ＦＩＴＣ㊁抗小鼠ＣＤ１９￣ＰＥ㊁ＣＤ６９￣ＰＥ￣ＣＹＴＭ７(美国ＢＤ￣Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司ꎬ批号分别为５５３０６２㊁５５７３９９㊁５５２８７９)ꎻＡｎｔｉ￣ＴＬＲ４ａｎｔｉｂｏｄｙ试剂盒(Ａｂｃａｍ公司ꎬ批号ＧＲ３２５０３４￣５)ꎻ胎牛血清(ＦＢＳ)(法国Ｂｉｏｗｅｓｔ公司ꎬ批号０２０４１３￣ＵＹ)ꎻ改良型ＲＰＭＩ１６４０培养基[赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司ꎬ批号ＮＡＣ１３６１]ꎮＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪(ＦＣ￣５００)(美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司)ꎻ全自动酶标仪Ｍｏｄｅｌ５５０(美国ＢＩＯ￣ＲＡＤ公司)ꎻＬＥＧＥＮＤＭＩＣＲＯ１７台式微量离心机(美国Ｔｈｅｒｍｏ公司)ꎻ倒置相差显微镜(ＢＤＳ２００)(重庆奥特光学仪器有限责任公司)ꎻＴＤ５Ｍ低速多管架自动平衡离心机(长沙万佳森仪器设备有限责任公司)ꎻ光学显微镜(Ｎｉｋｏｎ５０ｉ):日本Ｎｉｋｏｎ公司ꎻＦＡ２００４电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)ꎻ血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)ꎻＣｅｌｌＳｔｒａｉｎｅｒ(１００μｍꎬ７０μｍ)(美国Ｆａｌ￣ｃｏｎ公司)ꎻ眼科剪㊁眼科镊ꎮ１.３㊀实验动物分组及免疫抑制模型制备㊀将ＩＣＲ健康雄性小鼠适应性暂养１周后ꎬ称重㊁标记ꎬ后随机分为单次组㊁多次组㊁对照组各１０只ꎮ单次组在实验第７天腹腔注射１００ｍｇ/ｋｇ的ＣＹꎬ多次组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射５０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)的ＣＹꎬ以免疫抑制模型ꎻ对照组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射等量生理盐水ꎮ各注射后自由取食饮水ꎮ３４１.４㊀小鼠体质量测定㊀采用电子秤测定实验第１㊁３㊁５㊁７㊁８ｄ每只小鼠的体质量ꎬ并记录ꎮ１.５㊀小鼠处死及相关指标测定㊀实验第８ｄꎬ以颈椎脱臼法处死小鼠３０只ꎬ按下列步骤测定小鼠脏器指数㊁肠黏膜ＰＰｓ计数㊁肠黏膜ＣＤ３＋㊁ＣＤ１９＋细胞比例测算㊁小鼠肠道黏膜ＳＩｇＡꎮ１.５.１㊀小鼠脏器指数测定㊀沿胸部和腹部中线切开小鼠ꎬ按解剖位置摘取脾脏和胸腺ꎬ小心剔除其周围的筋膜及组织ꎬ滤纸吸干残余的血液后进行称重(ｇ)ꎬ将称得的重量(ｇ)除以小鼠体质量(ｇ)ꎬ计算胸腺指数和脾脏指数ꎬ脾脏指数(％)＝脾脏重量(ｇ)/小鼠体质量ˑ１００ꎬ胸腺指数(％)＝胸腺重量(ｇ)/小鼠体质量ˑ１００ꎮ１.５.２㊀小鼠肠黏膜ＰＰｓ计数㊀打开小鼠腹腔ꎬ取出全段小肠ꎬ迅速放入含有５％胎牛血清(５％ＦＢＳ)的ＲＰＭＩ１６４０液的培养皿中ꎬ剔除肠系膜及肠黏膜表面的脂肪组织ꎬ在外肠壁上可看见麦粒样的圆形突起ꎬ即为ＰＰｓ[１０]ꎬ肉眼计数并记录ＰＰｓ数目ꎮ１.５.３㊀小鼠肠黏膜ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例测算㊀ＰＰｓ淋巴细胞获取及表型测定肉眼计数并记录ＰＰｓ数目完成后ꎬ将小鼠肠腔冲洗干净ꎬ迅速放入含５％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０液的培养皿中ꎻ用眼科镊和眼科剪小心分离出ＰＰｓꎻ将其浸入含５％ＦＢＳ的ＲＰ￣ＭＩ１６４０液的培养皿中ꎬ先用５％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０液浸润１２０目细胞筛ꎬ并将ＰＰｓ小心移入细胞筛中ꎬ用研磨棒以适当的力度轻轻研磨ꎬ再用５％ＦＢＳ的ＲＰ￣ＭＩ１６４０液冲洗细胞筛过滤ꎻ以上滤液用２００目细胞筛过滤ꎻ收集滤液ꎬ加至５ｍＬꎬ以２０００ｒ/ｍｉｎ速度离心１０ｍｉｎꎬ弃上清液ꎬ加入５％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０液约３ｍＬꎬ重悬细胞即得ＰＰｓ细胞悬液ꎮ将收集到的ＰＰｓ细胞计数并调节细胞浓度至１ˑ１０７/ｍＬꎬ分别取１００μＬ细胞加入流式检查专用试管中进行荧光标记ꎬ每管依次加入抗小鼠ＣＤ３ｅ￣ＦＩＴＣ㊁ＣＤ１９￣ＰＥ单克隆抗体各０.５μｇꎬ混匀后４ħ避光孵育３０ｍｉｎꎬ用ＰＢＳ洗涤细胞两次(１５００ｒ/ｍｉｎꎬ５ｍｉｎ)ꎬ弃上清ꎬ用ＰＢＳ３００μＬ重悬后进行流式细胞仪检测[１０]ꎮ１.５.４㊀小鼠肠道黏膜ＳＩｇＡ测定㊀取出全段小肠ꎬ用带有灌胃针的１０ｍＬ注射器向肠腔内注入ＮＳ约３ｍＬꎬ并在小肠内保留３ｍｉｎꎬ轻轻晃动使肠腔内的内容物充分溶解ꎬ将肠腔内灌洗液收集于ＥＰ管中ꎬ以３０００ｒ/ｍｉｎ的速度离心１０ｍｉｎꎬ收集上清液于冻存管ꎬ－８０ħ储存ꎬ编号备用ꎮ待样本收齐后ꎬ严格按酶联免疫技术(ＥＬＩＳＡ)鼠ＳＩｇＡ试剂盒说明书操作[１０]ꎬ即取１００μＬ不同浓度梯度的标准品㊁样品㊁阳性对照品和空白分别加入酶标板ꎬ３７ħ孵育２ｈꎻ用拍板纸拍干板子ꎬ不洗板ꎻ提前２０ｍｉｎ配制Ｄｅｔｅｃ￣ｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＡ工作液ꎻ加入１００μＬＤｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＡ工作液到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ３７ħ孵育６０ｍｉｎꎻ洗板３次ꎻ每个孔加３００μＬ１ˑ洗液工作液放置２ｍｉｎ后用拍板纸拍干板子ꎻ提前２０ｍｉｎ配制ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＢ工作液ꎻ加入１００μＬＤｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＢ工作液到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ３７ħ避光孵育３０ｍｉｎꎻ洗板５次ꎻ加入９０ｌ显色底物(ＴＭＢ)到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ３７ħ避光孵育１５ｍｉｎꎻ加入５０μＬ终止液到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ用酶标仪在４５０ｎｍ处检测标准品和样本ＯＤ值ꎻ以ＯＤ值为纵坐标ꎬ以标准品浓度为横坐标ꎬ绘制标准曲线ꎬ根据ＯＤ值在标准曲线上查出浓度ꎮ１.６㊀统计学方法㊀采用ＳＰＳＳ２３.０统计软件ꎮ计量资料以 ｘʃｓ表示ꎬ组间比较采用单因素方差分析ꎮＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结果２.１㊀不同时点各组小鼠体质量比较㊀不同时点小鼠体质量比较见表１ꎮ表１㊀不同时点各组小鼠体质量比较(ｇꎬ ｘʃｓ)细胞体质量实验第１ｄ实验第３ｄ实验第５ｄ实验第７ｄ实验第８ｄ单次组２１.４２ʃ０.２８２２.８３ʃ０.２８ｂ２４.０９ʃ０.３２ｂ２５.４４ʃ０.３７ｂ２５.１３ʃ０.３８ａｂ多次组２１.３３ʃ０.３０２２.３６ʃ０.２７ａ２３.４０ʃ０.３４ａ２４.４２ʃ０.２４ａ２４.８２ʃ０.２３ａ空白组２１.４６ʃ０.３３２２.９２ʃ０.３２２４.０７ʃ０.６４２５.２３ʃ０.４９２５.７５ʃ０.１９㊀㊀注:与空白组比较ꎬａＰ<０.０５ꎻ与多次组比较ꎬｂＰ<０.０５ꎮ２.２㊀各组脾脏指数㊁胸腺指数比较㊀脾脏指数㊁胸腺指数比较见表２ꎮ２.３㊀各组肠黏膜ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量比较㊀肠黏膜ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量比较见表３ꎮ表２㊀各组脾脏指数㊁胸腺指数比较(％ꎬ ｘʃｓ)组别脾脏指数胸腺指数单次组０.２７ʃ０.０２ａｂ０.０７ʃ０.０１ａｂ多次组０.３６ʃ０.０２ａ０.１１ʃ０.０４ａ空白组０.４６ʃ０.０３０.１７ʃ０.０５㊀㊀注:与空白组比较ꎬａＰ<０.０５ꎻ与多次组比较ꎬｂＰ<０.０５ꎮ４４表３㊀各组肠黏膜ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量比较( ｘʃｓ)组别ＰＰｓ计数(个)ＣＤ３＋细胞比例(％)ＣＤ１９＋细胞比例(％)肠道黏膜ＳＩｇＡ含量(μｇ/ｍＬ)单次组４.７０ʃ０.４８ａｂ５５.３７ʃ４.９５ａｂ４５.１１ʃ５.３６ａｂ２２.７３ʃ３.２７ａｂ多次组５.９０ʃ０.７４ａ４８.８５ʃ２.６８ａ５１.１６ʃ４.８１ａ３２.４７ʃ３.２９ａ空白组７.３０ʃ０.８２３８.６９ʃ４.１７６１.４０ʃ５.１５４０.８６ʃ２.９４㊀㊀注:与空白组比较ꎬａＰ<０.０５ꎻ与多次组比较ꎬｂＰ<０.０５ꎮ３㊀讨论㊀㊀免疫系统的各种细胞㊁组织和器官的组成成分和功能的正常是机体免疫功能的基本保证ꎬ任何一方面的缺陷都将导致免疫功能障碍ꎮ机体自发㊁病原或药物㊁营养因素㊁环境因素均可引起免疫系统的功能异常ꎬ进而导致功能障碍㊁免疫应答和保护功能的降低或消失ꎬ最后引发机体丧失抵抗感染能力或形成免疫性疾病ꎬ容易受到细菌㊁病毒㊁真菌等感染ꎬ甚至容易长肿瘤[１１~１３]ꎮ目前ꎬ对免疫抑制性疾病的治疗主要以调整机体的自身免疫功能为主ꎬ免疫增强剂在医学上的应用已经引起了人们的广泛关注[１４]ꎮ中药免疫增强剂是目前使用较多的免疫增强剂ꎬ它可激活免疫活性细胞ꎬ增强机体的免疫功能ꎻ还可作为辅助药物与一些疫苗合用ꎬ增强免疫应答ꎬ提高免疫效应ꎻ主要用于一些免疫功能缺陷及难治性感染ꎮ但其仅在动物饲料添加中使用较为广泛ꎻ在临床使用方面ꎬ受到一定的限制ꎬ需要进入深入的研究开发[１５]ꎮ为此ꎬ建造安全有效的免疫抑制动物模型显得尤为重要ꎮ在生命科学研究中ꎬ免疫抑制动物模型建造的主要方法包括去胸腺动物模型㊁基因敲除动物模型㊁辐射损伤模型和免疫抑制剂模型等[１６~１８]ꎬ其中使用免疫抑制剂进行建模的方法由于总体成本较低㊁操作简便并且重复性好ꎬ因此在目前的研究中广泛应用ꎮ用于建立免疫抑制动物模型的免疫抑制剂包括微生物酵解产物类㊁激素类㊁抗代谢物类㊁抗体类㊁烷化剂类等ꎬ其中烷化剂类免疫抑制剂是建立的免疫抑制模型研究中最常用的方法ꎮ烷化剂按化学结构可分为氮芥类㊁磺酸酯及多元醇类㊁亚硝基脲类㊁三氮烯咪唑类和胼类㊁乙撑亚胺类ꎮ㊀㊀ＣＹ是一种抗肿瘤药物ꎬ对白血病和实体瘤都有效ꎬ是第一个所谓 潜伏化 广谱抗肿瘤药ꎮＣＹ是一种无活性的前药ꎬ在氮芥部分上连有一个吸电子的环状磷酰基ꎬ降低了烷基化的能力ꎬ体外几乎无活性ꎬ当其进入人体后ꎬ被肝脏或肿瘤内存在的过量的磷酰胺酶或磷酸酶水解ꎬ变为活化作用型的磷酰胺氮芥而起作用的氮芥类衍生物ꎮ磷酰胺氮芥作为烷化剂的一种在体内能和细胞的蛋白质和核酸相结合ꎬ使蛋白质和核酸失去正常的生理活性ꎬ发挥其抑制肿瘤细胞生长的作用ꎬ同时由于其非特异性ꎬ也会产生针对骨髓㊁胃肠道上皮和生殖系统等生长旺盛的细胞毒性ꎻ此外ꎬ还对免疫器官和敏感的淋巴细胞产生影响ꎬ进而对免疫功能产生明显抑制ꎮ可用于乳腺癌㊁恶性淋巴瘤ꎬ多发性骨髓瘤㊁白血病㊁卵巢癌㊁宫颈癌㊁前列腺癌㊁结肠癌㊁支气管癌㊁肺癌等肿瘤的化疗ꎻ还可作为免疫抑制剂用于各种自身免疫性疾病ꎬ如天疱疮以及溃疡性结肠炎㊁严重类风湿性关节炎㊁全身性红斑狼疮㊁多发性肉芽肿㊁特发性血小板减少性紫癜㊁儿童肾病综合征等ꎬ以及用于器官移植时抗排斥反应[１９~２３]ꎮＣＹ因其效果稳定㊁较易获得同时成本不高ꎬ常用于建立免疫抑制模型并有较多的文献报道ꎬ因而被广泛接受并应用于药物药效学评价和安全性评价ꎮ㊀㊀文献[６]报道ꎬ实验动物腹腔注射ＣＹ后ꎬ可导致动物体质量不同程度的降低ꎬ这与使用ＣＹ的剂量和时间有关ꎬ尤其是在注射后的第１周ꎬ但大剂量单次注射体质量明显高于小剂量连续注射组ꎮ与空白组比较ꎬ单词组实验第８天及多次组实验第３㊁５㊁７㊁８天体质量降低ꎻ与多次组比较ꎬ单次组实验第３㊁５㊁７㊁８天体质量升高ꎮ脾脏是机体最大的外周免疫器官ꎬ当抗原刺激机体后ꎬ免疫细胞(Ｔ细胞㊁Ｂ细胞和巨噬细胞)过度增生ꎬ导致其体积增大ꎻ胸腺是机体的中枢免疫器官ꎬ是Ｔ细胞分化成熟的场所ꎻ而机体免疫抑制时ꎬ使得淋巴组织萎缩ꎬ免疫器官的体积缩小ꎮ故免疫器官的脏器指数体现了其发育情况ꎬ可间接的反映机体的免疫状态ꎮ本研究显示ꎬ单次组和多次组均出现了脾脏指数和胸腺指数的降低ꎬ且单次组较多次组明显ꎬ间接说明两组实验动物均存在免疫抑制ꎬ且单次组较多次组明显ꎮＰＰｓ是沿着小肠纵向分布位于膜系膜固有层和黏膜下层的微小淋巴样组织ꎬ含有胸腺源性Ｔ细胞和Ｂ细胞ꎬ其中心区域富含Ｂ细胞ꎬ是诱导肠道黏膜进行免疫应答的重要部位ꎬＰＰｓ淋巴细胞数量和活性状态等可以反映肠道黏膜局部的免疫功能状态ꎮＣＤ３＋Ｔ淋巴细胞代表总的Ｔ淋巴细胞ꎬ而ＣＤ１９＋是Ｂ淋巴细胞表面抗原ꎬ除了浆细胞外的Ｂ细胞谱系所有发育阶段都有ＣＤ１９分布ꎬＣＤ１９也是ＣＤ１９/ＣＤ２１/ＣＤ８１信号复合物的重要组成部分ꎬ故ＣＤ１９＋代表了ＰＰｓ内除了浆细胞外的Ｂ细胞谱系不同发育阶段Ｂ细胞的总和ꎮ在既往的研究中ꎬ不同的ＣＹ造模实验５４均可导致Ｔ淋巴细胞㊁Ｔｈ细胞㊁Ｔｓ细胞比例升高ꎬＢ淋巴细胞比例下降[６]ꎮ本文发现ꎬ单次组和多次组均出现了ＣＤ３＋细胞比例升高ꎬＣＤ１９＋细胞比例降低ꎬ且单次组较多次组更为明显ꎬ进一步说明两组实验动物均存在免疫抑制ꎬ造模成功且单次组效果更佳ꎮ有研究[９ꎬ２４]表明ꎬ大剂量ＣＹ(１００ｍｇ/ｋｇ)制造免疫抑制模型效果更佳ꎻ在连续腹腔注射ＣＹ的动物模型中ꎬ４０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)和６０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)的用量均可完成免疫抑制模型的成功造模[２５]ꎬ但后者的效果优于前者ꎮ康慧琳等[２６]发现ꎬ高剂量ＣＹ通过抑制ＤＮＡ的复制㊁促进细胞凋亡ꎬ降低免疫细胞功能ꎬ使机体处于免疫抑制状态ꎮ免疫效应分子ＳＩｇＡ由肠道黏膜固有层浆细胞分泌ꎬ是机体内分泌量最大的免疫球蛋白ꎬ也是肠黏膜表面主要的免疫球蛋白ꎬ对消化道黏膜起着重要防御作用ꎬ当ＣＹ免疫引起抑制时ꎬ可引起肠道粘膜ＳＩｇＡ水平下降[２７]ꎮ本研究中ꎬ肠道粘膜ＳＩｇＡ的含量也出现了相同的变化趋势ꎬ且以单次组更为明显ꎮ㊀㊀总之ꎬ单次大剂量和多次小剂量的ＣＹ均可建立免疫抑制动物模型ꎬ前者对体质量影响更小㊁造模效果更佳ꎮ参考文献:[１]ＬｉｎｄｓａｙＢ.Ｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＥｓｓａｙｓＢｉｏｃｈｅｍꎬ２０１６ꎬ６０(３):２７５￣３０１.[２]钟金凤ꎬ方热军.环磷酰胺免疫抑制机制及在动物模型上的应用[Ｊ].中国免疫学杂志ꎬ２０１６ꎬ３２(１０):１５４１￣１５４５. 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[８]ＨｕｙａｎＸＨꎬＬｉｎＹＰꎬＧａｏＴꎬｅｔａｌ.Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅｏｎｗｈｉｔｅｂｌｏｏｄｃｅｌｌｓａｎｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｐｏｐｕｌａ￣ｔｉｏｎｓｆｒｏｍｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆＢａｌｂ/ｃｍｉｃｅ[Ｊ].ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｐ￣ｈａｒｍａｃｏｌꎬ２０１１ꎬ１１(９):１２９３￣１２９７.[９]张俊ꎬＹｏｎｇ￣ＳｅｏｎｇＳｈｉｎꎬ胡安君ꎬ等.环磷酰胺致大鼠免疫抑制和免疫亢进模型的建立与评价[Ｊ].中国实验动物学报ꎬ２０１５ꎬ２３(４):３９５￣４００.[１０]李燕华ꎬ梁月琴ꎬ王崇静ꎬ等.粗根荨麻多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠肠道派氏结细胞表型及ＴＬＲ４的影响[Ｊ].中成药ꎬ２０１７ꎬ３６(６):１２７２￣１２７６.[１１]马肖静ꎬ周慧婷ꎬ董熠ꎬ等.肿瘤发生与免疫逃逸相关机制的研究进展[Ｊ].肿瘤学杂志ꎬ２０１８ꎬ２４(１１):１０４６￣１０５０.[１２]何亚运ꎬ罗泊涛ꎬ陆元志.肿瘤微环境中免疫抑制性细胞和细胞因子在抗肿瘤免疫反应中的作用研究进展[Ｊ].山东医药ꎬ２０１９ꎬ５９(６):８８￣９２.[１３]杜娜雯ꎬ白日兰ꎬ崔久嵬.肿瘤免疫逃逸机制及治疗策略[Ｊ].中国肿瘤生物治疗杂志ꎬ２０１９ꎬ２６(４):４５４￣４６２.[１４]樊淑华ꎬ葛红莲.免疫增强剂的种类和应用[Ｊ].周口师范学院学报ꎬ２００９ꎬ２６(２):１０２￣１０６.[１５]晏继红ꎬ王仕宝ꎬ刘文虎.中药免疫增强剂研究进展[Ｊ].西北药学杂志ꎬ２０１３ꎬ２８(５):５４９￣５５２.[１６]ＲａｊＳꎬＲｕｉｚＰꎬＲｕｓｃｏｎｉＰ.Ｅａｒｌｙｐｒｉｍａｒｙｇｒａｆｔｆａｉｌｕｒｅａｆｔｅｒａｐｅｄｉ￣ａｔｒｉｃｈｅａｒｔｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｎｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｒｅｓｃｕｅｗｉｔｈｐｌａｓｍａｐｈｅｒｅｓｉｓꎬｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓꎬａｎｄａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ[Ｊ].ＡｎｎＰｅｄｉａｔｒＣａｒｄｉｏｌꎬ２０１７ꎬ１０(１):６９￣７１.[１７]陈敬宇ꎬ江艺ꎬ张小进.术前脾切除对肝移植治疗门脉高压症的影响[Ｊ].中华肝胆外科杂志ꎬ２０１４ꎬ２０(８):５７２￣５７６. 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与免疫抑制微环境的研究思路
免疫抑制微环境是指在肿瘤微环境中存在多种免疫抑制因素,阻碍机体对肿瘤的免疫应答,从而促进肿瘤生长。
研究免疫抑制微环境对于深入了解肿瘤免疫逃逸机制、开发新的免疫治疗策略至关重要。
以下是一些可能的研究思路:
1.鉴定和表征免疫抑制细胞群利用流式细胞术、单细胞测序等技术,鉴定构成免疫抑
制微环境的主要细胞群,如调节性T细胞、骨髓源抑制细胞、M2型肿瘤相关巨噬细胞等,分析其表型和功能特征。
2.阐明免疫抑制分子机制研究免疫抑制细胞群分泌的细胞因子(如TGF-β、IL-10等)、
表达的共抑制分子(如PD-L1、CTLA-4等)对免疫细胞的抑制作用,阐明细胞间相互作用网络。
3.探索诱导免疫抑制的关键信号通路如低氧、乳酸累积等肿瘤代谢应激、基质重塑等,
导致免疫细胞功能障碍或诱导免疫抑制细胞活化。
4.建立免疫抑制微环境模型利用细胞系、患者样本或小动物模型,重建免疫抑制微环
境,为研究提供工具平台。
5.评估免疫检查点抑制剂的作用机制免疫检查点抑制剂可逆转免疫抑制,研究其对各
种免疫细胞的影响。
6.开发新型免疫治疗策略基于免疫抑制微环境机制,探索与免疫检查点抑制剂的联合
应用,或新型免疫调节细胞疗法等策略。
7.建立生物标志物寻找能够反映免疫抑制状态的生物标志物,用于预测疗效、指导个
体化免疫治疗。
免疫抑制微环境研究需要多学科交叉、多层次研究,系统揭示复杂的调控网络,为提高免疫治疗疗效奠定基础。
免疫抑制小鼠脓毒症前后肺部及肠道微生态的变化特点
中国临床保健杂志 ２０２１年１２月第２４卷第６期 ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＨｅａｌｔｈｃ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０２１，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．６·基础研究·免疫抑制小鼠脓毒症前后肺部及肠道微生态的变化特点宋立成，闫鹏，杨庆云，张晗，解立新，磨国鑫中国人民解放军总医院呼吸与危重症医学部，北京１０００４８［摘要］ 目的 探讨脓毒症前后肠道及肺部微生态的差异。
方法 将６４只４周龄的雄性Ｃ５７ＢＬ６小鼠用随机数字表法随机分为两组，免疫抑制组（ＭＰ ｃｏｎｔｒｏｌ）小鼠每日腹腔注射甲泼尼龙０．２ｍｇ／ｇ，免疫正常组（ｃｏｎｔｒｏｌ）小鼠每日灌注相同体积的０．９％氯化钠注射溶液，连续灌注３０ｄ，建立免疫抑制模型，记录体质量及检测外周血淋巴细胞亚群变化情况，确定模型建立是否成功。
通过气管内及腹腔注射脂多糖（ＬＰＳ）建立脓毒症模型，记录生存曲线；于建模后第２４小时观察外周血炎症因子变化特点，及小鼠肺部及肠道微生态的变化特点。
结果 ＭＰ ｃｏｎｔｒｏｌ组小鼠体质量随时间增加呈现为第１周先增高此后逐渐降低的趋势，外周血淋巴细胞亚群表现为总淋巴细胞计数显著降低，ＣＤ４／ＣＤ８显著降低，ＣＤ８细胞在总ＣＤ３细胞中的比例显著升高，提示免疫抑制模型建立成功。
ＭＰ ｃｏｎｔｒｏｌ组小鼠经ＬＰＳ干预后，４８ｈ死亡率显著高于ｃｏｎｔｒｏｌ组。
肺部微生态分析发现，ｃｏｎｔｒｏｌ组与ＭＰ ｃｏｎｔｒｏｌ组α多样性差异无统计学意义，但ＭＰ ｃｏｎｔｒｏｌ组微生态中抗炎及短链脂肪酸（ＳＣＦＡ）产生相关的菌群明显升高，但ＭＰ ｃｏｎｔｒｏｌ组粪便中微生态出现显著的紊乱；在脓毒症早期，ＭＰ ＬＰＳ组和ＬＰＳ ｃｏｎｔｒｏｌ组肺部微生态α多样性差异无统计学意义，但ＭＰ ＬＰＳ组促炎相关的菌群水平显著升高，抗炎相关菌群水平显著降低；粪便微生态中，ＭＰ ＬＰＳ组α多样性显著低于ＬＰＳ ｃｏｎｔｒｏｌ组，且抗炎及黏膜屏障相关的菌群水平显著低于ＬＰＳ ｃｏｎｔｒｏｌ组，而促炎和机会感染相关菌群水平显著升高。
环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立及其免疫功能的测定
环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立摘要:[目的]建立环磷酰胺对小鼠的免疫抑制的动物模型，从天然免疫功能和获得免疫功能两方面检测对小鼠的影响。
[方法]初次免疫设立实验组给予OVA-AL(OH)3(0.5/只)和对照组给予NS（0.5/只）；8d,10d,12d,14d分别给实验组和对照组注射NS和CTX(100mg/kg);与15d加强免疫分别注射NS和OVA-AL(OH)3(0.5/只)；22d检测免疫功能[结果]与NS-NS组相比，CTX-NS组的SI值，双向免疫及ELISA的效价无明显差别，但吞噬细胞指数及吞噬细胞百分率明显降低；与NS-OVA相比CTX-OVA组的SI 明显降低，双向免疫剂ELISA效价都降低[结论]环磷酰胺对小鼠的T淋巴细胞，B淋巴细胞以及吞噬细胞有抑制作用Abstract:[aims] To establish animal model of cyclophosphamide in mice immunosuppression , test in mice from two aspects of natural immune function and immunity function [methods] Primary immune to set up the experimental group given OVA-AL(OH)3 and The control group given NS ; the 8th,10th,12th,14th day give the experimental group NS and the control group CTX ,and the 15th strengthen the immune;the 22th test the immune function [results] Compared with NS - NS group, the SI value of CTX - NS group, bidirectional immune potency and ELISA has no obvious difference, but the phagocyte index and phagocytes percentage decreased obviously; Compared with NS - OVA CTX - SI of OVA group was obviously lower, bidirectional immune agent ELISA titer were reduced [conclusion] Cyclophosphamide in mice of T lymphocyte, B lymphocyte and phagocytes have inhibition关键词：环磷酰胺 CTX 免疫抑制动物模型淋巴细胞建立一种环磷酰胺免疫抑制小鼠模型，并将其与正常小鼠进行对照，通过检测小鼠的天然及获得免疫功能对比其改变与不同，从而可知环磷酰胺对免疫抑制的作用，有利于进一步进行对临床应用抗肿瘤的研究。
CTX
免疫抑制模型的建立及其免疫功能检测孟庆东（吉林大学白求恩医学院，长春130000）摘要：目的：利用环磷酰胺（CTX）抑制小鼠的免疫力，建立免疫抑制模型，并检测其免疫功能。
方法:分别对注射了生理盐水的小鼠（对照组）和注射了卵清蛋白的小鼠（实验组）隔日连续腹腔注射环磷酰胺（100mg/kg）4次，再注射卵清蛋白加强免疫后，通过淋巴细胞转化试验（细胞免疫）、吞噬实验（吞噬细胞功能）、酶联免疫吸附试验（ELISA）（体液免疫）、双向琼脂扩散试验（体液免疫）检测小鼠免疫功能的变化。
结果：淋转实验结果全为阴性，吞噬实验仅一组对照为阳性，ELISA实验结果仅一组对照为阳性，双扩实验结果仅一组对照为阳性。
结论：只有体液免疫的实验中有两项阳性结果，此次试验失败，未能证明环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制效果。
关键词：环磷酰胺免疫抑制模型免疫功能检测ImmunosuppressionModel AndThe Establishment OfImmuneFunction TestingObjective: To use of cyclophosphamide (CTX) inhibiting mice immunity, the establishment of immunosuppression model, and test the immune function. Methods: Respectively on the physiological saline injection (control group) and mice injected with the egg albumin in mice (experimental group) alternate days continuous celiac injection cyclophosphamide (100 mg/kg) four times, reinject ovalbumin strengthen immunity, through the lymphocyte transformation test (cellular immune), the devouring experiment (macrophage abilities), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (humoral immunity), double AGAR diffusion test (humoral immunity) test the change of immune functions in mice. Results: The tube turn experimental results for all negative, devouring experiment is only a group of control for positive, ELISA experimental results only a group of control for positive, double expanding experimental results only a group of control for positive. Conclusion: Only the humoral immune experiments have two positive results .The test failure, failed to prove cyclophosphamide on immune function in mouse inhibitory effect.keywords:cyclophosphamide; immunosuppression die; immune function testing 环磷酰胺是一种烷化剂，1958年首次人工合成，主要用于肿瘤免疫，对多种肿瘤有明显的抑制作用，已有研究显示CTX具有抑制小鼠肝癌的作用，能够明显促进肝癌细胞的凋亡[1]。
血必净对免疫抑制脓毒症模型的保护作用
血必净对免疫抑制脓毒症模型的保护作用张晶晶;陈旭义;黄梦强;刘英富;孔宪斌;霍景瑞;王蕾;刘颖;陈锋;杨晓晖;田毅;孙世中【摘要】目的观察血必净对免疫抑制脓毒症小鼠的影响.方法使用随机数字表法将152只小鼠分为对照组(Control)、免疫抑制组(IM)、免疫抑制脓毒症模型组(ISM)、血必净治疗组(XT),每组38只小鼠.IM组沿下腹正中线旁边腹腔注射环孢素A免疫抑制,25 mg/kg,隔日1次,共3次.ISM组免疫抑制后沿下腹正中线旁边腹腔注射300 μL浓度为1×109 CFU/mL的大肠杆菌44102;XT组免疫抑制脓毒症造模后30 min,沿下腹正中线旁边腹腔注射血必净4mL/kg,30 min后按相同剂量重复注射1次;Control组注射等体积的生理盐水.(1)造模8h,各组取4只小鼠,进行血细菌培养.(2)造模12h,各组取10只小鼠,使用流式细胞法检测外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+.(3)造模12h,各组取10只小鼠,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6.(4)造模12h,各组取4只小鼠,采用蛋白免疫印迹法测定高迁移率蛋白(HMGB1).(5)造模12h,各组取10只小鼠,使用全自动分析仪检测外周血丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、血肌酐(CR).结果与ISM组相比,XT组的CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值明显升高,血细菌培养数量明显降低;肝肾功能指标ALT、AST、CR、BUN和炎症指标TNF-α、IL-6、HMGB1均明显下降.结论血必净能够明显调节免疫抑制脓毒症小鼠的免疫系统,对抗细菌,抑制炎症反应,并对重要器官有保护作用.【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2018(046)009【总页数】5页(P932-936)【关键词】脓毒症;免疫抑制剂;疾病模型,动物;小鼠,近交BALB C;血必净注射液;环孢素A【作者】张晶晶;陈旭义;黄梦强;刘英富;孔宪斌;霍景瑞;王蕾;刘颖;陈锋;杨晓晖;田毅;孙世中【作者单位】沧州医学高等专科学校科技实验中心,061001;武警后勤学院附属医院;天津医科大学研究生院;沧州医学高等专科学校科技实验中心,061001;天津中医药大学研究生院;沧州医学高等专科学校科技实验中心,061001;沧州医学高等专科学校科技实验中心,061001;沧州医学高等专科学校科技实验中心,061001;沧州医学高等专科学校科技实验中心,061001;沧州医学高等专科学校科技实验中心,061001;沧州医学高等专科学校科技实验中心,061001;武警后勤学院附属医院【正文语种】中文【中图分类】R459.7脓毒症是公认的世界性难题［1］，且治疗费用非常高昂［2］。
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（immunity）
“Immune”是从拉丁字“immunis”衍生而来，其原意是免除服役 或免除课税之意。 免疫：指机体接触“抗原性异物”或“异己成分”的一种特异性 生理反映，其作用是识别和排除抗原性异物，以此维持机体的生 理平衡。这些维持机体稳定性的反应，通常对机体是有利的；但 在某些条件下也可以是有害的。所以免疫的现代概念可以概括的 指机体识别和排除抗原性异物的功能。
1997年Thomas A. Fey等人再次对该模型进行了优化
实验动物：受体鼠（Balb/c）(10±2)周、体重(20±2)g 、雄性 供心鼠（C57BL/6J ）48小时内 性别不限
手术器械：眼科剪、刀片、缝针、缝线 镊子、培养皿、纱布、棉签
注射器（1ml） 试剂： 10%乌拉坦
1%新洁尔灭酊
Hank’s液 仪器：生理记录仪或心电图机或体显微镜
1、受体鼠经10%乌拉坦(10毫克/10克体重)腹腔注射麻醉
2、1%新洁尔灭酊耳廓局部消毒，剃毛 3、持眼科剪于耳廓背侧中线之前1/3处作一与耳廓中线垂直
处作一3-4毫米长的切口，勿损伤耳廓静脉
4、持镊子向耳尖方向钝性分离皮下组织，使 之成一管腔(见图1)
• BAlb/c小鼠腹腔注射硫代乙醇酸钠 溶液1.5ml，四小时后断颈处死，浸 于75酒精溶液中消毒。向腹腔内注 射消毒Hank’s液约8ml，轻揉小鼠 腹部，剪开小鼠腹部外层皮肤，用
注射器将腹腔液抽出，置于消毒离
心管中。收集的腹腔液经离心 (2000r/min，5min)沉淀后，用 Hank‘s液洗两次，用含10%小牛血 清的RPMI1640培养液重悬制成细 胞悬液 (2 x 106细胞/ml) 。
加100μl细胞悬液于96孔板中（每孔 含5×105个 ）。每孔加25 μl ConA或 LPS （ ConA 浓度 5μg/mlLPS浓度
10 μg/ml）,每孔加10 μl药物（3个 复孔）37℃，5%CO2培养48小时。
结束培养前4小时每孔加5mg/ml MTT 10μl ，1000r/min离心30分钟，弃上清 每空加入DMSO200μl 溶解，振荡， Biorad酶标仪在波长570nm处测OD值。
抑制率：
ConA或LPS对照平均OD 给药组平均OD C o n A 或 L P S 对 照平 均 O D
动物：BAlb/c小鼠
仪器：注射器、96孔板、Biorad酶标仪、表面皿 试剂：Hank’s液、RPMI-1640培养液、3%硫代乙醇酸钠
溶液(1.5ml) 0.1%中性红、细胞溶解液（乙醇：乙酸=1：1）
1、移植术后当天给药，每日给药
2、术后第六日起每天记录移植心肌组织的心电信号
3、测试异位心电图时，正负电极分别置于移 植心脏两侧，接地极连接在小鼠后肢(图2)
动物：小鼠 药品：ConA或LPS MTT 仪器：200目钢网、注射器芯、96孔板、Biorad酶标仪、表面皿 试剂：Hank’s液、RPMI-1640培养液、DMSO、红细胞裂解液
4、将新生供鼠置于碎冰中一分钟后用75%酒精皮肤消毒， 剖胸摘取心脏。将心脏置于无菌Hank’s液内搏动1-2次以 排空心腔余血。
5、移植时，用刀片把供心纵向剖成为基本等大二半，肌纤 维成一斜面。将心肌组织移植填入受体鼠耳腔内，将皮肤 切口缝合一针。（心肌组织的离体时间不超过2分钟）
6、用手指轻按局部，使移植物与受鼠之周围组织贴紧。
免疫抑制剂？
对NK细胞无明显抑制作用，但可间接 通过干扰IFN-γ的产生而影响NK细胞 的活力
——小鼠耳后心肌组织移植模型
——脾淋巴细胞对丝裂原的增殖反应 ——巨噬细胞吞噬试验
1963年Fulmer等人就已经开始研究心肌组织的移植，并对其 进行了深入的研究
1971年Judd和Trentin两人又对模型进行了精处死后，将小鼠全身浸入75％乙醇中浸泡2－ 3分钟消毒，无菌条件下取出脾脏，用注射器芯经200目无 菌不锈钢筛网研磨，过尼龙膜使之成单细胞悬液， Hank‘s 液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min离心5分钟， 弃上清；加红细胞裂解液10ml，混匀脾细胞，静止4-5分钟， 待红细胞完全破碎，1000r/min离心5分钟，弃上清去除红 细胞，Hank’s液洗2-3遍，用RPMI1640培养液重悬细胞， 计数调整细胞浓度为3×106个/ml。
• 每孔加100μl细胞悬液于96孔板中，每孔加10μl待侧药物（5 个复孔）， 37℃，5%CO2培养24小时，弃去上清液，每空 加入0.1%中性红0.1ml，37 ℃培养30min,弃去中性红，并用 Hank’s液冲洗三次，以除去未被吞噬的中性红。每孔加入细 胞溶解液（乙醇：乙酸=1：1） 100μl ，静置过夜，轻度震 荡后，用Biorad酶标仪在波长540nm处测OD值。
免疫系统中的免疫细胞和免疫分子之间，以及与其它系 统如神经内分泌系统之间的相互作用，使得免疫应答以最恰当 的形式维持在最适当的水平。
免 疫
免疫增强剂
调
节
剂 免疫抑制剂
选择性抑制T细胞，作用于T细胞活化的早期，对B细胞抑制 作用较弱
抑制巨噬细胞产生IL-1
抑制抗原或有丝分裂素激活淋巴细胞 表达IL-2受体
抑制率：细胞悬液对照平均OD 给药组平均OD 细胞悬液对照平均OD