环磷酰胺构建动物免疫抑制模型的研究进展

Chinese Journal of Veterinary Medicine

中国兽医杂志㊀2019年(第55卷)第2期

环磷酰胺构建动物免疫抑制模型的研究进展

伍维高,钟金凤

(湖南环境生物职业技术学院,湖南衡阳421005)

中图分类号:O571.21+1㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:05296005(2019)02008703

收稿日期:20180528

基金项目:湖南省教育厅项目(16C0563);湖南省科技厅项目(2017JJ5026)

作者简介:伍维高(1979-),男,畜牧师,硕士,研究方向为动物繁殖与生产,E-mail:30942422@

通讯作者:钟金凤,E-mail:498379002@

㊀㊀近几年来,动物疫病肆意流行,免疫接种成为预防传染病的有效措施之一,而免疫反应过程相当复杂,诸多因素会影响接种效果,如免疫抑制性疾

病㊁不良的饲养环境㊁微量元素和蛋白质的缺乏等,常导致免疫接种失败,给生产带来不可挽回的重大损失㊂为提高机体抗病力,增强动物免疫力,免疫增强剂得以广泛运用㊂为了进一步研究此类制剂,人为构建免疫抑制模型的研究手段得到了诸多研究者的青睐㊂而环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX),以其诱导动物产生免疫抑制作用效果显著,且成本低廉,越来越广泛地运用到制备动物免疫抑制模型中㊂为此,本文对环磷酰胺构建免疫抑制模型进行综述㊂

1㊀环磷酰胺的药理作用

经口服或静脉注射的环磷酰胺主要在肝脏进行代谢,生成低毒性的4-羟基环磷酰胺和醛磷酰胺,分布全身,进一步降解为磷酰氮芥㊁丙烯醛和去甲氮芥,结合于快速生长细胞的DNA 上,产生强烈的细胞毒性㊂极少部分可进一步氧化成4-酮环磷酰胺和羧基环磷酰胺,无毒性,随尿排出[1]

㊂

2㊀CTX 免疫抑制机理

2.1㊀环磷酰胺对免疫基因的影响

2.1.1㊀抑制抗菌蛋白基因表达㊀内源性抗菌蛋白是天然免疫的重要组成部分,其中杀菌/渗透增强蛋白(Bactericidal /permeability increasing protein,BPI)㊁防御素(Defensins,DF)以及血小板型磷脂酶A 2(Phospholipase A 2,PLA 2)备受关注

[2]

㊂大鼠连续

5d 腹腔注射环磷酰胺40mg /kg㊃bw,对照组注射等体积生理盐水,结果显示,对照组大鼠的睾丸㊁附

睾㊁胸腺㊁肝㊁小肠㊁大肠6种器官均表达BPI㊁β-DF-

1㊁血小板型PLA 2;而环磷酰胺组胸腺㊁肝无BPI 表达,睾丸㊁胸腺㊁肝无β-DF-1表达,睾丸㊁胸腺无血小板型PLA 2表达,其他有表达的组织中其含量比对照组低[3],试验提示,环磷酰胺可抑制体内抗菌蛋白基因表达㊂

2.1.2㊀影响免疫相关基因的表达㊀环磷酰胺对免疫相关基因有一定影响㊂经环磷酰胺处理的荷瘤鼠脾脏㊁骨髓和血浆相关多种免疫调节因子基因上调,包括危险信号㊁模式识别受体㊁炎症介质㊁生长因子㊁细胞因子㊁趋化因子和趋化因子受体[4]㊂通过基因芯片技术检测环磷酰胺干预的胚胎干细胞发现:自体免疫激活和移植排斥相关基因如CD 3㊁CD 28㊁CTLA 4㊁MHC II ㊁PRF 1㊁GZMB 和IL-2R 基因下调,而免疫相关受体基因如IL 1R 2㊁IL 18R 1和FLT 3上调[5]㊂

2.2㊀环磷酰胺对动物转录水平的影响2.2.1㊀抑制骨髓细胞相关mRNA 表达㊀环磷酰胺诱导骨髓抑制,造成骨髓细胞(BM)降低㊂雄性昆明种小鼠连续3d 腹腔注射150mg /kg㊃d 环磷酰胺,7d 后采骨髓细胞通过Real time PCR 检测发现,试验组BM 细胞钙敏感受体(Calcium-sensing recep-tor,CaSR)和丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activa-ted protein kinase,MAPK)mRNA 水平极显著高于对照组(P <0.01),引起BM 造血干细胞㊁间充质干细胞和内皮祖细胞增殖㊁分化和动员产生明显障碍[6]㊂

2.2.2㊀调节细胞凋亡相关mRNA 表达㊀环磷酰胺对细胞凋亡的影响主要体现在两方面:增加促凋亡基因mRNA 表达而抑制抗凋亡基因mRNA 表达,从而诱导细胞凋亡㊂SPF 级NIH 雄性小鼠于试验期第9㊁11㊁13天腹腔注射环磷酰胺10mg /kg,于14d㊁28d 取脾脏采用半定量RT-PCR 检测促凋亡基因-

Caspase-9mRNA 和抗凋亡基因-B 淋巴细胞基因2(B-cell lymphonma gene 2,BCL-2)的表达,两次结果均显示,模型组Caspase-9mRNA 表达较对照组显著升高而BCL-2mRNA 表达显著降低[7]㊂8~12周远7

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中国兽医杂志㊀2019年(第55卷)第2期Chinese Journal of Veterinary Medicine

交系昆明种小鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg,1次/d,连续3d,第10天取小鼠脾脏测定凋亡相关基因,结果显示,BAX(Bcl-2associated X protein)mR-

NA表达水平明显上升,而BCL-2mRNA表达明显下降[8]㊂

2.2.3㊀降低免疫相关受体mRNA表达㊀环磷酰胺可降低免疫相关受体mRNA的表达㊂树突状细胞相关C-型凝集素-1(Dectin-1)和Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)主要表达在免疫细胞上,为免疫相关受体,与免疫状态有关[9]㊂给予150mg/kg环磷酰胺的BALB/c小鼠与第4㊁7㊁9天取肺组织测定Dectin-1mRNA,结果显示,在第4㊁7天肺组织Dec-tin-1mRNA表达较对照组明显下降(P<0.05)[10]㊂24只昆明种小鼠(雌性)腹腔注射环磷酰胺150 mg/kg,4h后肺泡巨噬细胞TLR2mRNA表达与对照组相比极显著下降(P<0.01);8h后TLR4mR-NA表达极显著降低(P<0.01)[11]㊂

2.2.4㊀影响免疫因子mRNA表达㊀环磷酰胺对Th1㊁Th2类细胞因子mRNA表达均有不同程度影响㊂汪祯等[12]用SPF级昆明种小鼠按50mg/kg㊃bw剂量隔日腹腔注射环磷酰胺,共7次,14d后,无菌取脾脏测定IL-2mRNA㊁IL-10mRNA,结果显示, IL-2mRNA㊁IL-10mRNA表达水平与对照组相比显著下降;易有金等[13]腹腔注射40mg/kg㊃d环磷酰胺,结果显示,脾脏和胸腺中IL-2㊁IL-10㊁IL-12㊁IL-4㊁TNF-α和IFN-γmRNA的表达量降低,以上试验提示,环磷酰胺对Th1㊁Th2类细胞因子表达均呈现下调现象[14]㊂

2.3㊀环磷酰胺对动物蛋白水平的影响

2.3.1㊀抑制细胞周期相关蛋白表达㊀环磷酰胺降低着丝粒蛋白B(Centromere Protein,CenpB),Cen-pB是染色体着丝粒/动粒复合体上一种最重要的功能蛋白,其特异性结合位点位于着丝粒α1-卫星DNA上17bp的CenpB盒,参与着丝粒异染色质的形成,环磷酰胺可致CenpB蛋白含量异常,致细胞无法正常分裂㊂昆明种小鼠连续7d腹腔注射50 mg/kg㊃bw环磷酰胺,5d后取血通过Western Blot-ting方法检测CenpB蛋白,其含量显著低于对照组[15]㊂

2.3.2㊀增加细胞凋亡相关蛋白表达㊀环磷酰胺可通过增加细胞凋亡蛋白的表达影响Fas/Fas L系统介导的凋亡蛋白㊂SPF级ICR纯种雄性小鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg㊃bw,用流式细胞术检测Fas 抗原(CD95)介导细胞凋亡的蛋白,其表达量与对照组相比显著升高[16]㊂人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat加入环磷酰胺3mg/L,于12㊁24㊁48h收取细

胞,Western Blot检测FasL(Fas ligand,fas配体)和FADD(Floationg Point Addition,胞浆死亡信号衔接蛋白)表达,结果表明,未处理的细胞无FasL和FADD表达,而环磷酰胺处理组表达FasL和FADD,且表达水平随环磷酰胺刺激时间延长而增加[17]㊂除此,环磷酰胺能显著诱导Fas/Fas L下游蛋白Caspases产生[18],使凋亡不可逆进行㊂

3　环磷酰胺在动物上的应用

因环磷酰胺主要作用于快速生长细胞的DNA,并能从基因转录㊁翻译和蛋白表达等多方面产生细胞毒性㊂免疫细胞属于快速生长细胞,因此,环磷酰胺对免疫系统影响甚大,故可用环磷酰胺作为免疫抑制剂构建免疫抑制模型,这是环磷酰胺在动物上的主要用途㊂

3.1㊀环磷酰胺抑制动物免疫器官㊀在环磷酰胺作用下鸡表现出形态退行性改变,包括腔上囊囊泡不发达,即腔上囊初级滤泡严重萎缩,皮质和髓质间隔不明显且滤泡间结缔组织严重增值[19]㊂Marsh J 研究发现,脾脏内正常椭球相关细胞在环磷酰胺作用后1周变为空泡[20]㊂

3.2㊀环磷酰胺降低动物免疫细胞数量㊀连续3d 给7~8周龄雌性尼古拉斯火鸡注射环磷酰胺(0~ 100mg/kg㊃bw),测定血液学指标发现,环磷酰胺在初始注射后24~72h引起明显的白细胞减少㊁淋巴细胞减少㊁血小板减少和白细胞减少㊂但对单核细胞循环数㊁细胞体积㊁血浆蛋白无明显影响㊂同时,无法确定对嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的变化,因为它们在机体内的数量微量[21]㊂

3.3㊀环磷酰胺减少免疫分子产生㊀研究表明,环磷酰胺可减少免疫分子产生:用80mg/kg㊃bw环磷酰胺腹腔注射小鼠,同位素标记法显示24h和48h其肠道蛋白损失显著高于对照组,连续2d注射环磷酰胺(50mg/kg㊃bw),可造成肠黏膜SIgA损伤,肠道固有层IgA表达量减少[22]㊂环磷酰胺(10mg/ kg㊃bw)与单剂量长春新碱(0.025mg/kg㊃bw,静脉注射)和单剂量的L-天冬酰胺酶(400IU/kg㊃

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