蛋白质的双向电泳
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在双向电泳系统中无需浓缩胶，因为 第一向等电聚焦已经使得蛋白得到浓 缩
图像分析
常用软件： Image-Master (GE Healthcare) PDquest (Bio-Rad)
分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、 比较分析
小
通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同
位置从而实现蛋白质的双向分离
2DE图谱
硝酸银染色图谱
考马斯亮蓝染色图谱
双向电泳（DIGE）示意图
样品1： Cy3标记
将标记的 样品混合
双向电泳分离
样品2： Cy5标记
荧光扫描仪扫描
图像重叠分析
DIGE图谱
样品制备
双向电泳的最关键步骤之一
差异蛋白点选取 蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
生物学问题的解释
双向电泳(2DE/DIGE)
目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术
能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分 析
双向电泳（2DE）示意图
等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离
来自百度文库
提取的总蛋 白溶液
大 分子量
SDS-PAGE 分离，使得 蛋白质按分 子量大小排 序
制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质， 尽可能简单的操作步骤，注意防止样品 提取过程中的各种化学修饰，去除样品 中核酸、盐离子等干扰物质。
等电聚焦
通过10000V高压使得蛋白质按照其等电 点特性进行聚焦
步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、 低压维持
聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平 和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性， 在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢 失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品 类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度 来确定。
胶条平衡
等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳 之前需进行胶条平衡，以便于被分离 的蛋白质与SDS充分结合，保证SDSPAGE电泳的顺利进行
步骤：一般采用两步平衡法，用含 SDS、DTT、尿素和甘油等的缓冲液 先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT 后再平衡一次
SDS-PAGE电泳
使得蛋白质按照分子量的大小不同而 分离，与普通SDS-PAGE相似
蛋白质双向电泳
蛋白质组学（proteomics）
概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动 态变化的一门科学
研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的 定位、修饰；蛋白质之间的相互作用并根据 这些研究最终确定它们的功能
技术流程
提出 生物学问题
实验组和对照组 样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析
图像分析
常用软件： Image-Master (GE Healthcare) PDquest (Bio-Rad)
分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、 比较分析
小
通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同
位置从而实现蛋白质的双向分离
2DE图谱
硝酸银染色图谱
考马斯亮蓝染色图谱
双向电泳（DIGE）示意图
样品1： Cy3标记
将标记的 样品混合
双向电泳分离
样品2： Cy5标记
荧光扫描仪扫描
图像重叠分析
DIGE图谱
样品制备
双向电泳的最关键步骤之一
差异蛋白点选取 蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
生物学问题的解释
双向电泳(2DE/DIGE)
目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术
能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分 析
双向电泳（2DE）示意图
等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离
来自百度文库
提取的总蛋 白溶液
大 分子量
SDS-PAGE 分离，使得 蛋白质按分 子量大小排 序
制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质， 尽可能简单的操作步骤，注意防止样品 提取过程中的各种化学修饰，去除样品 中核酸、盐离子等干扰物质。
等电聚焦
通过10000V高压使得蛋白质按照其等电 点特性进行聚焦
步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、 低压维持
聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平 和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性， 在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢 失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品 类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度 来确定。
胶条平衡
等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳 之前需进行胶条平衡，以便于被分离 的蛋白质与SDS充分结合，保证SDSPAGE电泳的顺利进行
步骤：一般采用两步平衡法，用含 SDS、DTT、尿素和甘油等的缓冲液 先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT 后再平衡一次
SDS-PAGE电泳
使得蛋白质按照分子量的大小不同而 分离，与普通SDS-PAGE相似
蛋白质双向电泳
蛋白质组学（proteomics）
概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动 态变化的一门科学
研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的 定位、修饰；蛋白质之间的相互作用并根据 这些研究最终确定它们的功能
技术流程
提出 生物学问题
实验组和对照组 样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析