蛋白质一级结构的测定方法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
白质生理功能的必要基础。
蛋白质序列测定的基本战略和步骤
一 蛋白质序列测序的基本战略 1、直接法（测蛋白质的序列） 对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，
但目前只能测60个N端氨基酸。 2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列） 蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（database or
由于PTH－衍生物从多肽链上脱落下来 对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋 白质的一级结构。
（1）N-末端测定 C.二甲基氨基萘磺酰氯法
在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰 氯DNS-Cl）可以与N-端氨基酸的游离氨基 作用，得到丹磺酰-肽。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性 质，检测灵敏度可以达到110-9mol。
一级结构的测定方法ຫໍສະໝຸດ Baidu
1. 多肽链的分离 1）肽链的拆开
蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共 价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多 肽链，采用的化学处理方法有：
①过甲酸氧化
②巯基乙醇还原
③ Cleland‘s试剂的还原作用
稳定SH基的方法：
（A） 烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物
第二节 蛋白质一级结构 的测定
一、蛋白质一级结构定义(primary structure)
在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行 排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称 为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。 核心：蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序,包 括二硫键的位置。 意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋
当年Sanger分析胰岛素用了整整十年的时间，今天 运用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右的蛋 白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学 发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综 述及专著文献较多。
三 测定前的准备工作
测序前的准备工作：
蛋白质的纯度鉴定 要求：纯度97%以上，均一。
测定蛋白质的分子量
目前关于核酸的一级结构研究，由于Sanger等发 明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对比 之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸 迅速。
但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析 仪以及气相色谱、质谱(GC MS)等方法的相继出现。 使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种 蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少， 而且工作人员也大大减少。
databank）可以在Altas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff,M.O.ed. 1972-1978,Vols 1-5, Washington,DC:National Biomedical Researsh Foundation)中找到。然而现在大多数蛋白质序列 信息都 是从基因核苷酸序列（经过密码子）翻译成氨基酸序列的。
及－S－S－定位等。
蛋白质测序的一般步骤
（1） （2） （3） （4） （5） （6） （7） （8） （9）
测定蛋白质分子中多肽链的数目。 拆分蛋白质分子中的多肽链。 断裂链内二硫键。 分析多肽链的N末端和C末端。 测定多肽链的氨基酸组成。 多肽链部分裂解成肽段。 测定各个肽段的氨基酸顺序 确定肽段在多肽链中的顺序。 确定多肽链中二硫键的位置。
鉴定方法：
估算氨基酸残基数，确定肽
⑴ 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 链数
(PAGE)要求一条带，双向电泳。 方法： SDS-PAGE，凝胶
⑵ DNS—Cl（二甲氨基萘 过滤法，沉降系数法
磺酰氯）法测N端氨基酸。
(3) 亲和层析
(4) western 印迹法等
及测定的一般步骤
蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多 肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以
PDB(Protein Data Bank):蛋白质结构数据库 PDB 原来有由美国Brookhaven 国家实验室负
责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学 研究的需要，1998年由美国国家科学基金委员会、 能源部和卫生研究院资助，成立结构生物学合作 研究协会（Research Collaboratory for Structure Bioinformatics,RCSB） PDB由 RCSB 管理。
稳定SH基的方法：
（B）氨乙基化
非共价结合
尿素， SDS-PAGE，盐酸胍， 高浓度 的盐
2）末端分析
（1）N-末端测定 A. 二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)
（1）N-末端测定 B.氰酸盐法
异硫氰酸苯酯（PTC或PITC）与N末端的α －氨基发生的反应，生成PTC－钛,在弱酸 中自发环化转变成PTH－衍生物。该试剂 称为Edman试剂。
由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、 更有效、信息更多，因此有不少电子数据库问世， 储存的序列资料以惊人的速度不断扩充，并且个 人电脑可以方便利用。如果现在需要确定一个新 蛋白质的序列，研究者所做的第一件事就是将新 蛋白质的序列与数据库中的其它已知序列进行比 较，确定其中是否存在同源性。这些数据库中比 较有名的就是美国National Biomedical Researsh Foundation（国家生物医学研究基金 会）主持的PIR（Protein Information Resource，蛋白质信息库或Protein Identification Resouece 蛋白质鉴定库）,美国 政府支持的Gene Bank [Gene Sequence Data Bank（基因序列数据库）]，还有欧洲的EMBL （European Molecular Biology Laboratory,欧 洲分子生物学实验室数据库）。
PDB是目前最主要的蛋白质分子结构数据库
二、蛋白质一级结构的测定方法
研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元 结构从氨基酸算起，已有150年的悠久历史，直 到1955年，Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排 列顺序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。 这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。
氨肽酶法
蛋白质序列测定的基本战略和步骤
一 蛋白质序列测序的基本战略 1、直接法（测蛋白质的序列） 对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，
但目前只能测60个N端氨基酸。 2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列） 蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（database or
由于PTH－衍生物从多肽链上脱落下来 对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋 白质的一级结构。
（1）N-末端测定 C.二甲基氨基萘磺酰氯法
在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰 氯DNS-Cl）可以与N-端氨基酸的游离氨基 作用，得到丹磺酰-肽。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性 质，检测灵敏度可以达到110-9mol。
一级结构的测定方法ຫໍສະໝຸດ Baidu
1. 多肽链的分离 1）肽链的拆开
蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共 价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多 肽链，采用的化学处理方法有：
①过甲酸氧化
②巯基乙醇还原
③ Cleland‘s试剂的还原作用
稳定SH基的方法：
（A） 烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物
第二节 蛋白质一级结构 的测定
一、蛋白质一级结构定义(primary structure)
在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行 排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称 为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。 核心：蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序,包 括二硫键的位置。 意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋
当年Sanger分析胰岛素用了整整十年的时间，今天 运用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右的蛋 白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学 发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综 述及专著文献较多。
三 测定前的准备工作
测序前的准备工作：
蛋白质的纯度鉴定 要求：纯度97%以上，均一。
测定蛋白质的分子量
目前关于核酸的一级结构研究，由于Sanger等发 明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对比 之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸 迅速。
但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析 仪以及气相色谱、质谱(GC MS)等方法的相继出现。 使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种 蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少， 而且工作人员也大大减少。
databank）可以在Altas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff,M.O.ed. 1972-1978,Vols 1-5, Washington,DC:National Biomedical Researsh Foundation)中找到。然而现在大多数蛋白质序列 信息都 是从基因核苷酸序列（经过密码子）翻译成氨基酸序列的。
及－S－S－定位等。
蛋白质测序的一般步骤
（1） （2） （3） （4） （5） （6） （7） （8） （9）
测定蛋白质分子中多肽链的数目。 拆分蛋白质分子中的多肽链。 断裂链内二硫键。 分析多肽链的N末端和C末端。 测定多肽链的氨基酸组成。 多肽链部分裂解成肽段。 测定各个肽段的氨基酸顺序 确定肽段在多肽链中的顺序。 确定多肽链中二硫键的位置。
鉴定方法：
估算氨基酸残基数，确定肽
⑴ 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 链数
(PAGE)要求一条带，双向电泳。 方法： SDS-PAGE，凝胶
⑵ DNS—Cl（二甲氨基萘 过滤法，沉降系数法
磺酰氯）法测N端氨基酸。
(3) 亲和层析
(4) western 印迹法等
及测定的一般步骤
蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多 肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以
PDB(Protein Data Bank):蛋白质结构数据库 PDB 原来有由美国Brookhaven 国家实验室负
责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学 研究的需要，1998年由美国国家科学基金委员会、 能源部和卫生研究院资助，成立结构生物学合作 研究协会（Research Collaboratory for Structure Bioinformatics,RCSB） PDB由 RCSB 管理。
稳定SH基的方法：
（B）氨乙基化
非共价结合
尿素， SDS-PAGE，盐酸胍， 高浓度 的盐
2）末端分析
（1）N-末端测定 A. 二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)
（1）N-末端测定 B.氰酸盐法
异硫氰酸苯酯（PTC或PITC）与N末端的α －氨基发生的反应，生成PTC－钛,在弱酸 中自发环化转变成PTH－衍生物。该试剂 称为Edman试剂。
由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、 更有效、信息更多，因此有不少电子数据库问世， 储存的序列资料以惊人的速度不断扩充，并且个 人电脑可以方便利用。如果现在需要确定一个新 蛋白质的序列，研究者所做的第一件事就是将新 蛋白质的序列与数据库中的其它已知序列进行比 较，确定其中是否存在同源性。这些数据库中比 较有名的就是美国National Biomedical Researsh Foundation（国家生物医学研究基金 会）主持的PIR（Protein Information Resource，蛋白质信息库或Protein Identification Resouece 蛋白质鉴定库）,美国 政府支持的Gene Bank [Gene Sequence Data Bank（基因序列数据库）]，还有欧洲的EMBL （European Molecular Biology Laboratory,欧 洲分子生物学实验室数据库）。
PDB是目前最主要的蛋白质分子结构数据库
二、蛋白质一级结构的测定方法
研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元 结构从氨基酸算起，已有150年的悠久历史，直 到1955年，Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排 列顺序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。 这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。
氨肽酶法