第十五章 精斑检验

液）等也可形成类似结晶。同时，精液斑受到尿 液、血液等污染时，则不出现阳性反应。 结晶试验灵敏度低、特异性差，仅作为指向实验。
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过碘胆碱 29
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苦味酸结晶试验
原理：
精素分解产物与苦味酸生成精素苦味酸结晶
（青黄色有折光的十字、柱、星形结晶）
特点： 动物精液一般不出现阳性。
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三、锌检出法
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（四）精斑的DNA分析
精液中的DNA：精子、睾丸细胞、上皮细胞
精液DNA数据：
每个精子含DNA约2.5 pg
PCR分析所需精液量低于5 ul，仅需10个精子
正常成人每次射精约3~5 ml，约0.6~2亿个精子
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精子细胞核特点：
大量二硫键，能抵抗去污剂和外源性蛋白酶→ 提取DNA需加入还原剂（如DTT）→ 二步消化法 提取精阴混合斑精子DNA。
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第五节
血型：ABO系统等
精斑的个人识别
测定精液斑中的遗传标记：
血清型：维生素结合蛋白（DPB）、Km、Gm等 酶型：PGM1, 岩藻糖苷酶、黄递酶等 DNA分析：VNTR, STR, Y-STR等
选择原则：
①良好的遗传多态性；
②较稳定； ③检测方法标准化、简单、结果重复性好。
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（一）精斑的ABO血型测定
④检材浸出液混浊时，可水浴煮沸10min，离心，以 除去蛋白、细菌、酶类等干扰
注意：
抗血清效价一定要标化，一般以4为好。
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4.酶标抗体免疫测定法
精斑的ABO血型测定常用直接斑点ELISA
法、间接斑点ELISA法及斑点ELISA双抗夹
心法，尤以直接斑点ELISA法操作简单，常
作为首选方法。
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5.DNA分型
原理：
人体组织和体液中精液含锌量最高，精液中
的锌主要来自前列腺，此法适用于无精子精斑。
特点：
特异性很高，除乳汁（稀释后阴性），其它分
泌物、体液、排泄物均呈阴性。混入血迹不影响
结果。
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预试验注意：
除酸性磷酸酶检验外，其他各项试验灵敏度均不
高，预试验阴性的检材有时仍需进行确证试验。
精斑不一定要经过预试验后才进行确证试验，可
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凝固酶（精囊腺）5min内凝固成较冻状 中性蛋白酶及纤溶酶（前列腺）20-30min内液化成稀薄 半流动体
精子产生过程
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精斑检验的目的：
为案件侦查和审理提供线索和证据。
需解决的问题：
斑痕是否为精斑？若是精斑，确定精斑的个体来源。
精斑检验程序：
肉眼检验→预试验→确证试验→个人识别
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第二节 精液斑的肉眼检查
分泌型：分泌液与体液中检出ABH抗原
人体液、分泌液中的ABH血型物质是糖蛋 白，以水溶性形式存在，而分泌型精液中 的ABH血型物质的含量比红细胞中多且耐 热，非分泌型精液中ABH血型物质含量少， 常规方法不易检出。
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1.吸收试验 2.解离试验 3.中和试验
精斑中的水溶性ABH物质能与相应抗体特异 性结合，使抗体与指示红细胞的凝集反应能力降 低或完全消失，红细胞不凝为阳性反应，证明精 斑中含有与抗体相对应的抗原。
精斑的形态：
无固定形态，外观常因附着物不同而有差异， 在软质载体，如衣裤、纸张、床单上等，手触之 有硬感，新鲜精斑有特殊腥气味。 典型的精斑呈不规则地图状，在深色纺织品上 呈灰白色浆糊状斑迹；在浅色纺织品上，多呈黄 白色地图状，边缘色深。
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床单上精液斑
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精斑的分布：
多附着于犯罪嫌疑人或被害人的衣裤、 女性外阴部、大腿内侧、腹壁，偶见口腔 内、肛门。现场的被褥、草席、床板、毛 巾、纸张、沙土、丢弃的避孕套等。此外， 阴道擦拭物也是常见的精斑检材。
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一、酸性磷酸酶检验(acid phosphatase, ACP)
实验依据：

精斑中的酸性磷酸酶含量高：约是其他脏器的100倍；也远
远高于动物精液及其他动、植物组织中的含量，但猴与人相 似。

来源于前列腺 精斑中酸性磷酸酶稳定性好： 抗腐败---常温保存10年、夏季室温8周腐败；
耐高热---125℃加热30min仍可检出活性。
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床上的精斑在紫外灯下
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肉眼检验的意义：发现可疑精斑，确定 部位和分布情况，以便准确取材。
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第三节 精液斑的预试验
性质：筛选试验
磷酸苯二钠试验
酸性磷酸酶试验
α-磷酸萘酚-固蓝B试验
方法：
其它：碘化碘钾结晶试验、苦味酸结晶试 验、锌检出法等
特点：方法简便易行，灵敏度高，但特异性差
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抗人精血清沉淀反应
原理：
用特异性抗人精液血清与可疑精斑检材浸液作沉淀反应， 出现肉眼所见白色沉淀为阳性反应，证明检材含有人精液
方法：
环状沉淀反应，琼脂双向扩散试验，对流免疫电泳
注意：
用已知人精斑作阳性对照，检材无精斑部位作阴性对照
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前列腺特异性抗原p30的检测
前列腺特异性抗原（prostate specific antigen, PSA） 又称γ-精浆蛋白，由人类前列腺上皮细胞所分泌，是成年 男子精浆中特有的一类糖蛋白，分子量30 000，故名p30， 性质稳定，是确证精液斑的理想标记。常用检测方法有免 疫胶体金法和ELISA。 抗-p30血清具有高度的种属特异性和前列腺器官特异 性，灵敏度和准确性均高于精子检出法，不受精液中无精 子的影响。
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α -磷酸萘酚-固蓝B试验
原理：
ACP
α -磷酸萘酚
α -萘酚
固蓝B
偶氮化合物（紫红色） 特点：灵敏度好，特异性差阴道液等可能呈阳性反应。
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二、结晶试验
人精液中含有一些成分，与不同试剂结合，能 形成一定形态的结晶体，据此可推测精斑的存在。 但形成结晶体非精液斑所特有，人体其它器官
（肝肾）等浸出液以及其它分泌液（阴道液、尿
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尸体 上的 精斑
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强奸杀人现场遗留纸团
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紫外辅助检查：
原理： 精斑中的黄素在紫外线下呈银白色荧光，斑痕边缘呈浅紫蓝色 特点：

对检材无污损、无破坏，不影响进一步检验 特异性差（干扰物：阴道液、尿液、唾液、某些色素染料）
作用：仅能为进一步检验提供可疑部位 结果分析：
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阳性仅表明可能是精斑，阴性不能轻易否定精斑
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（一）胶体金法
原理及方法与胶体金法确证血痕一样，不同的
是精斑确证试验胶体金标记的是鼠抗人p30单克隆
抗体，检测线包被另一种鼠抗人p30单克隆抗体；
质控线包被羊抗鼠IgG抗体。
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（二）ELISA法
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三、其它确证精斑方法
乳酸脱氢酶-X：仅出现于人精子 微量元素检测法 抗人精子单克隆抗体免疫组化法
①PCR-直接测序法 ②PCR-RFLP法
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（二）精斑的血清型测定
精液中的多态性蛋白：Gm、Km、GC、血清类粘蛋白
（三）精斑的酶型测定
PGMl型测定 岩藻糖苷酶型 黄递酶型 γ-GGT型测定
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PGM1型测定
磷酸葡萄糖变位酶：普通凝胶电泳可检出7条谱带。
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DIA型
黄递酶型（diaphorase, DIA），DIA3仅存在于人类 精子和睾丸中，是男性生殖细胞特有的一种遗传标记，且 分型不受阴道液和其它体液的影响。
谢谢！
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剪取肉眼可见的斑痕直接进行确证试验。
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第四节 精斑的确证试验
精斑的确证试验是检验精斑中的特有成
份，其阳性结果可以确证精斑。主要有三
类方法：精子检出、免疫学检验和生物化
学检验。
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一、精子检出法
显微镜下观察到典型精子，即能确证人精斑。检 出精子是认定精斑最简便、最可靠的方法，可被 法医实验室广泛采用。 精子具有典型而稳定的形态，不易受其他因素影 响而改变。在精斑中的精子形态相当稳定，十余 年的陈旧精斑也可能查见精子。镜下观察精子是 无色的，一般情况下精子头部有折光，尾部很细。
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精液理化分析
细胞成分：
精子、睾丸细胞、白细胞、脱落柱状上皮细胞等
非细胞成分（90%是水）：
无机物：水、盐类、金属离子（锌） 糖类（果糖）、脂类、黄素、精胺、卵磷脂 共有蛋白:白蛋白、酸性磷酸酶(ACP)等 特有蛋白:PSA、DIA3等 精液功能蛋白：凝固酶、中性蛋白酶和纤溶酶等
有机物
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精子的形态特点
第十五章 精液斑检验
NSMC XDD
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精液（斑）检验是法医学鉴定实践中的一项重 要内容，与血痕检验占有同等重要地位，特别是 对有关性犯罪或有性犯罪嫌疑的案件，以及对死 亡性质不明的女尸检查，精液（斑）的检验尤为 重要。 精液（斑）的法医学鉴定，可为判断案件性质、 划定侦查范围、认定或排除犯罪嫌疑人提供重要 线索。在亲子鉴定或其它有关性功能鉴定中，有 时需对新鲜精液进行检验。
DNA提取方法： 有机溶剂法：纯度高，损耗大 Chlelex-100法：纯度低，仅适用于PCR 其它
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DNA IQ™系统
Promega 公 司 的 DNA IQTM系统通过 独特的顺磁性树脂 提供了一个从各种 法医样品中简易， 快速，有效地定量 提 取 纯 化 DNA 的 方 法。
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Differex™ 系统
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正常未经染色精子形态
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精斑检材的处理：
上清：抗人精沉淀试验； 中和试验
沉渣：涂片，染色，检 验精子
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藻红染色法：
精子头部和尾部均染成红色。
亚甲蓝染色法：
精子头后部染成深蓝色，头前部、尾部不
着色或浅染。
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亚甲蓝染色精子
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HE染色法：
①苏木素染液
②0.5％伊红染液
③1％盐酸酒精溶液
结果判定：
阳性：立即出现红色，表明检材可能是精斑。
阴性：呈橙黄色，表明检材不是精斑或ACP被破坏。
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由左至右：强阳性、阳性、弱阳性、阴性
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注意事项：
①应同时剪取无斑痕处检材及已知精斑作阴性和阳性对照。 ②被水洗过淡质精斑，应适当延长缓冲液浸泡时间。 ③怀疑为假阳性，可适当加温或延长放置时间。 ④试验灵敏度高（剪取检材顺序：先空白、次可疑精斑、最 后已知精斑） ⑤特异性较差。
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方法：
精斑浸出液→凹玻板倍比稀释至1：2048，加入效价
为4的抗血清（A、B、H）各1滴→室温30min →加
2％的指示红细胞，摇匀→静置30min →观察结果
结果判定：
精液检材与基质的抑制凝集相差3级以上→阳性
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特点：
①准确性较吸收法高
②可与精斑确证试验同时进行
③能判断分泌能力强弱，并能区分是否是分泌型
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磷酸苯二钠试验(Kind-King法)
原理： 精液中的酸性磷酸酶可分解磷酸苯二钠，产生 萘酚，后者经铁氰化钾作用并与氨基安替比林结 合，生成红色醌类化合物。
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方法：
取可疑斑痕0.1×0.1cm（最好取斑痕边缘部位）
置试管内，加缓冲液3-4滴，37℃温箱内5-10分钟
后，加等量显色液。
Promega公司的Differex™ 系统使用标 准的蛋白酶 K 消化并结合相分离与差速离 心的方法来分离精子及上皮细胞DNA。
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Y染色体DNA检测特点：
男性所特有，Y-STR单倍型遗传 检测Y-STR，无需分离男女成分 Y-STR呈父系遗传
检测Y-STR标记意义在于排除同一性
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第一节 概述
精液: 男性各附属性腺分泌物所形成的复杂混合物，精囊 液约占50％～80％，前列腺液占15％～30％，尿道球 腺液，尿道旁腺液约占5％。
精液斑： 精液浸润或附着于基质上，干燥后形成的斑痕。
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精子
精液
精浆
男性生殖细胞，含亲代遗传 物质，由睾丸产生，每次射 精大概有0.6-2亿个精子。 男性附属性腺分泌物的混合 液，输送精子，为精子提供 营养，激发精子活力等。
空泡状，含多种 水解酶和糖蛋白 细胞核，致密， 重要成分是DNA
线粒体鞘
正常精子分头、体、 尾三部分，长约 60μm，外形似蝌蚪, 头部长3～5μm，宽 2 ～ 3μm, 厚 l ～ 2μm, 正 面 观 呈卵 圆 形 ， 侧 面 观 呈梨 形 ， 主 要 由 顶 体和 致 密 的 精子细胞核组成。
精子尾部断落，常只检见精子头部，应与 阴道滴虫、酵母菌等鉴别。典型的精子头 部呈椭圆形，着色特殊。若发现几个典型 的精子头部也可确证为精斑。
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二、免疫学试验
优点:
①灵敏度高
②适用于输精管结扎术者和精子缺乏症患者的精斑
方法：
抗人精血清沉淀反应 胶体金法 前列腺特异性抗原的检测
ELISA法
镜检：精子头前半部不着色或浅染，后半部 呈蓝色，尾部红色
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酸性品红亚甲基蓝染色法 镜检：精子头部呈红色，尾部呈蓝色
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性交后精子存活时间： 阴道 3-8h 宫颈 2-5天 子宫、输卵管 1-10天 在性犯罪案件中，取阴道试子的时间越早越 好，提取部位为阴道后穹窿。
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精斑陈旧、取材部位不准或遇到少精子症 者，只要找到一个完整的典型精子，即能 确证人精斑。