薄层色谱法及其应用0802

显色
喷雾显色 多用玻璃喷瓶或其它专用的喷雾设备， 喷雾形成的雾滴应细小并且均匀。 浸渍显色 多在盛有显色剂的展开缸中进行。 蒸汽熏蒸显色 可在密闭的展开缸、干燥器等容 器中进行。
显色
显色是导致薄层扫描定量结果精密度下降的一 个重要原因，在操作时应特别注意。 喷雾显色时应确保喷出的雾滴大小均匀。薄层 板上的的显色剂也应确保均匀。 浸渍显色应防止显色溶液溶解样品所造成的样 品损失和色谱斑点变形。 如薄层板需加热，可使用烘箱或专用的薄层加 热台。应注意加热的均匀。
15-30分钟
展开
展开
方法2：在一侧槽内加 入展开剂，薄层板置 另一侧槽内，密闭容 器，放置15-30分钟， 再迅速将薄层板放入 装有薄层板的展开槽 内，密闭，展开；或 放置到规定时间后， 保持容器密闭，小心 倾斜展开容器，Байду номын сангаас展 开剂进入到放置有薄 层板的槽内，放平展 开容器，展开。
15-30分钟
薄层固定相
传统薄层板与高效薄层板的比较
TLC 平均粒度（μm） 颗粒分布（μm） 点样量（μl） 展距（cm） 分离时间（min） 检出限：可见光（ng） 荧光（ng） 10-15 宽 大 10-15 30-200 100-1000 1-100 HPTLC 3-7 窄 小 5-8 3-20 10-100 0.1-10
薄层色谱法及其应用
中国药品生物制品检定所
何轶 2004. 8
目录
薄层色谱法
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概述 薄层固定相 薄层点样 薄层展开 显色 记录
目录
薄层扫描法
• • • • •
简述 仪器组成 仪器性能检定 薄层扫描定量方法 注意事项
在2005版药典中拟修订的内容 CAMAG薄层分析仪器操作及注意事项
薄层固定相
A
HPTLC与普通TLC的差别
A: HPTLC Silica gel 60 （Merck） B:硅胶G预制板(青岛海 洋化工厂) 展开剂: 氯仿-甲醇-水 （15：5：1），10℃以 下放置后的下层溶液 显色: 10%硫酸：乙醇， 105℃加热约5分钟 检视: 可见光和紫外光 灯（366nm） 样品：1. 华重楼； 2. 华重楼；3.重楼皂苷I； 4. 重楼对照药材；5. 滇 重楼；6. 滇重楼；7. 滇 重楼
仪器
薄层扫描仪主要由光源、单色器、薄层板台、检测 器以及工作站组成。 光源 主要有钨灯、氘灯、汞灯和氙灯等。其中 汞灯为线光源，可发射特征辐射光谱。 单色器 用来提供一定波长的单色光。其结构与 一般的紫外分光光度计类似，通常由入射狭缝、 出射狭缝、平行光装置、色散元件等组成。薄 层扫描仪多采用光栅为其色散元件。
概述—薄层扫描法的分类及一般原理
按照扫描方式的不同，薄层扫描法可分为吸收法 与荧光法。 薄层扫描法吸收式测定可采用反射法以及透射法 两种方式进行扫描。透射法大多用于凝胶色谱的 扫描，非透明界质薄层板的扫描主要为反射式吸 收法或荧光法扫描。
概述—薄层扫描法的分类及一般原理
反射法测定
透射法测定
概述—薄层扫描法的分类及一般原理
薄层点样
10 15 ≤3 一般≥8 5-10 单位：mm
普通薄层板点样位置示意图
展开
选择大小适合的展开容器，将点有样品的薄 层板放入容器内的展开剂中，浸入深度以展开剂 液面距点样基线5mm为宜，密闭，展开。一般上 行展开8-15cm，高效薄层板上行展开5-8cm。在 溶剂前沿达到预定展距后，取出薄层板，晾干， 待检测。 展开方式主要有上行展开、下行展开、双向 展开、水平展开、环形展开等。目前国内多采用 上行展开。
薄层色谱法
概述
薄层色谱法 指以适宜的固定相涂布于玻璃板、 铝箔片或聚酯薄膜上使成一均匀的薄层，将供 试品与相应的对照物点于薄层板的一端，以适 宜的溶剂置展开容器中展开，使供试品中所含 的相应成分分离，采用适合的显色剂或显色方 法显色，将供试品色谱与对照物色谱相比较， 或采用薄层扫描仪扫描，以进行鉴别、检查， 或含量测定的方法。
显色
电动喷瓶
薄层加热台
自动浸板器
显色
Desaga Chromajet DS20 全自动定量控制喷雾系统 自动定量喷雾 可控制喷雾区域、喷雾速 度以及喷雾剂用量 有利与提高喷雾的重现性
Desaga Chromajet DS20
节约溶剂，环境污染小
记录
可使用胶片照相机、摄像头以及数码相机 等设备拍摄色谱结果，以光学照片或电子图形 文件保存。在紫外光下拍摄时，光源发出的紫 外光会干扰摄像设备感光，导致拍摄结果与肉 眼观察存在一定的色差，应使用适当滤光片滤 除紫外光。可见光下进行检视的薄层板也可采 用电脑扫描仪记录薄层色谱结果。
CAMAG Reporstar 3 薄层照相系统
记录
可见光
展开剂：氯仿-甲醇水 30：10：1 固定相：硅胶G预制 板 显色剂：2%对二甲 氨基苯甲醛的40% 硫酸溶液
366nm
样品：制剂及柴胡 对照药材
薄层扫描法
岛津-9301PC
CAMAG Scanner 3
概述
薄层扫描法 是指用一束一定波长、一 定强度的紫外或可见光对薄层板进行扫描， 测定薄层板上的样品斑点对光的吸收强度 或斑点经激发后所产生的荧光强度，所得 到图谱及积分数据可用于药品的鉴别、检 查及含量测定。Kubelka-Munk方程是薄层 扫描法定量的依据。
概述—薄层扫描定量原理
在采用反射式吸收法测定时，入射光照射到 薄层板上，一部分光透射过薄层板，一部分光 发生反射，此外还有大量的散射光。因此，薄 层扫描定量不遵从于Lambert-Beer定律，其样 品量与反射光强度符合Kubelka-Munk方程： (1-R)2/R=2.303εC/S
其中R为反射光强，ε为样品吸收系数 C为样品浓度，S为薄层板散射系数
倾倒
展开
展开
此外还有薄 层自动展开仪， 可将薄层板按预 定程序单次或多 次展开，提高薄 层展开的重现性。
CAMAG AMD2型自动多级展开仪
显色
薄层色谱可针对不同的样品采用不同的显色方法 和显色剂进行显色，从而可专门针对某一类化合 物进行检视，或对紫外和可见光下无吸收的化合 物检视。极大地提高了薄层检视的专属性与灵敏 度。这是薄层色谱法灵活性的一个集中体现。 显色的方法有：喷雾显色 、浸渍显色 以及蒸汽 熏蒸显色等。
薄层扫描可使用单波长和双波长进行测定。 单波长薄层扫描适合于分离度好，背景干扰少 的薄层。双波长薄层扫描时用测定波长和参比 波长分别扫描薄层板，测定样品斑点在两波长 下的吸收度之差。双波长扫描可减少分离度欠 佳的两组分间的相互干扰，减少薄层板的背景 干扰，操作时应选择待测斑点吸收较小或无吸 收的波长作为参比波长。 在CAMAG Scanner 3 型仪器中双波长扫描又称为背景校正模式 （Background Correction)。
概述—薄层扫描法的分类及一般原理
双波长测定对薄层扫描背景的影响
概述—薄层扫描法的分类及一般原理
参比波长
测定波长
双波长测定对薄层扫描背景的影响
概述—薄层扫描法的分类及一般原理
根据扫描时光束的轨迹不同，薄层扫描又可 分为线性扫描和锯齿扫描。 线性扫描时一般采用一束比待测斑点略宽的 狭窄光带沿展开方向做单向等速扫描，它适于形 状较规则斑点的扫描。 锯齿扫描使用的微小正方形光束在沿展开方 向运动的同时，在垂直于展开方向也进行往复扫 描，扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿形或矩形， 它对于形状不规则或浓度分布不均匀的斑点扫描 重复性较好，但扫描速度较慢。
概述—薄层扫描法的分类及一般原理
线性扫描
锯齿扫描
概述—薄层扫描法的分类及一般原理
线性扫描速度较快，但对形状不规则斑点扫描 结果容易产生误差。CAMAG的仪器即采用线性 扫描，在操作时应注意保证展开后斑点的均匀 性。只有好的薄层色谱结果才能有好的扫描定 量结果。 锯齿扫描对于形状不规则或浓度分布不均匀的 斑点扫描重复性较好，但扫描速度较慢。岛津 的CS-9301PC等仪器即可以采用此种扫描方式 进行扫描。
展开
边缘效应: 薄层展开后，位于薄层板边 缘的样品斑点比移值较处于中间的斑 点大的现象。边缘效应会使斑点扩散 变形，从而影响样品定性结果的判断。 薄层扫描定量时，斑点的形状直接影 响到扫描后的峰高和峰宽，从而影响 定量结果的准确性。
边缘效应示意图
预饱和是减少边缘效应的有效办法。
展开
预饱和：可在加入展开剂后使展开容器密闭，放置15-30 分钟，待溶剂蒸汽平衡后，迅速放入点有样品的薄层板， 立即密闭，展开。必要时可放置适当大小的滤纸促使展开 缸内蒸汽达到饱和。
B
薄层点样
以使用的器具不同，点样可分为手动和自动点样。 手动点样 主要使用的器具有微升毛细管、微量 注射器或配合与之相应的手动点样仪等。 自动点样 采用半自动点样仪或全自动点样仪， 按预设程序自动点样。
薄层点样
手动点样毛细管
CAMAG Linomat5 半自动点样仪
CAMAG ATS4 全自动点样仪
薄层点样
以点样方式的不同可分为接触式点样和喷雾点样两种。 接触式点样 将吸有样品溶液的毛细管或针头与薄层
板表面接触，从而使样品在薄层板上形成圆点状的点。 多采用定量毛细管、微量注射器手动点样，有的仪器 也可进行自动接触式点样。
喷雾点样 点样针针杆匀速缓慢下推，针头部形成的
小液滴被喷头喷出的气流吹落到薄层板上，机械控制 薄层板匀速摆动，则形成均匀的条带状原点。必须采 用仪器进行。
薄层点样—喷雾点样原理
针杆 运动方向
点样针 喷头(气流) 薄层板
薄层点样—喷雾点样的优点
喷雾点样的优点： 点样过程中，点样器不与薄层板接触， 防止薄层板物理损伤。 样品密集，有利于展开后检视。 减少样品横向、纵向扩散，样品斑点窄， 展开后分离度提高。 自动化程度高，样品溶液不易在针壁上 残留，可提高点样的准确度与重现性。
薄层点样
点样时应注意选择适宜的溶剂，溶剂对样品的溶解 度以及溶液粘度等均会对点样质量产生影响。 高效薄层板载样量较普通薄层板小，容易引起过载， 应适当调整点样量。 除另有规定外，点样基线距底边10-15mm，高效薄 层板一般基线距底边8-10mm。接触式点样原点直径 一般不大于3mm，喷雾式点样所得条带宽度一般为 5-10mm，高效薄层板条带宽度一般为4-8mm。点间 距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜，一般不少 于8mm，高效薄层板样品间隔不少于5mm。
薄层固定相
按照固定相的种类，薄层板可分为正相薄层板（如 硅胶薄层板、聚酰胺薄层板）、反相薄层板（如C18 键合相薄层板）等。 硅胶薄层板是目前使用最广的薄层板，有硅胶G板、 硅胶GF254板、硅胶H板和硅胶HF254板等规格。 高效薄层板（HPTLC，High Performance TLC）所使 用的固定相较普通薄层板平均粒度小，颗粒分布范 围窄，因此在相对短的展开距离中可以达到更好的 分离效果。
记录
由暗箱及摄像设备组成。 暗箱 配备可见光、254nm和365nm紫外光光 源以及相应的滤光片。 摄像设备 有胶片照相机、摄像头以及数码相 机等。其中数码相机以低廉的价格、清晰的 成像，以及与计算机的接口便利等优点已经 成为应用的主流。
记录
CAMAG Reporstar 3 薄层照相系统由 暗箱和数码相机组 成。可提供可见光 以及366、254nm 的紫外光。采用 WinCats工作站控 制，可以满足GLP 要求。
概述
1938年 N. A. Izmailor和 M. S. Schraiber首次在显 微镜载玻片上涂布的氧化铝薄层分离了多种植物 酊剂中的成分，标志着薄层色谱法的诞生。 薄层色谱法具有设备简单、操作方便、分离速度 快等优点，从而发展很快，并在中草药的定性定 量分析中得到了广泛应用。 80年代以来，高效薄层板的出现以及薄层自动化 仪器的使用，极大地提高了薄层分析结果的重现 性和准确度。有的学者称之为现代薄层色谱技术 （ Modern TLC) 或 仪 器 化 薄 层 色 谱 技 术 （Instrumental planar chromatography)。
薄层点样
接触式点样：多采用定量毛细管、微量注射器手 动点样，有的仪器也可进行自动接触式点样。 接触式点样应注意： 正确选择溶解样品的溶剂 原点直径一般以3mm为宜 防止点样毛细管损伤薄层表面 尽量避免多次点样 防止点样环形色谱效应
薄层点样—点样环形色谱效应
点样环形色谱效应： 在点样的同时，样品在原点呈环状展开，如 果样品在溶剂中的溶解度很大，原点将变成空心 环，称为“点样环形色谱效应”。它会对展开造成 不良影响。应选择样品组分溶解度相对较小的溶 剂以避免此现象的产生。