海南红树林土壤真菌群落的初步研究

收稿日期：２０１２－０３－２６基金项目：国家自然科学基金项目（３０７６０００１）；海南省高等学校科学研究项目（Ｈｊｋｊ２０１２－３２）；

海南医学院创新性实验项目（ＨＹＣＸ２０１０１０）

作者简介：林璐（１９９０－），女，福建龙岩人，在读本科生。

＊

通讯作者：饶朗毓（１９７９－），女，海南文昌人，讲师，硕士；海南省海口市城西学院路海南医学院病原生物学教研室，

５７１１９９，Ｅ－Ｍａｉｌ：４９５３３４３＠ｑｑ．ｃｏｍ．

海南红树林土壤真菌群落的初步研究

林璐，谭雄英，刘凌霄，牛莉娜，裴

华，王华民，饶朗毓＊

（海南医学院热带医学与检验医学院，海口５７１１９９）

摘要：目的探讨海南红树林土壤层中真菌的分布特征。方法对采集自红树林土壤中的真菌菌株进行分离及纯化培养，通过对菌株的形态和培养特征观察，结合分子生物学方法进行ｒＤＮＡＩＴＳ序列的测定及同源性分析，通过ＢＬＡＳＴ比对以及系统发育分析，确定其种属分类地位。结果从海南红树林土壤中共分离出３２５株真菌，共１４个属，其中青霉属９７株（２９．８４％）、木霉属７３株（２２．４６％）、曲霉属６５株（２０．００％）、拟青霉菌属（６．４６％）、枝孢属（４．３１％）。结论海南红树林土壤中真菌资源丰富，优势真菌种群为青霉属、木霉属和曲霉属。

关键词：土壤真菌；红树林；真菌群落；分布特征中图分类号：R379．9

文献标识码：A

文章编号：1001-7119(2012)09-0217-03

Preliminary Research on Fungi Community of Mangrove Soil in Hainan

LIN Lu,TAN Xiongying,LIU Lingxiao,NIU Lina,PEI Hua,WANG Huaming,RAO Langyu *

(School of Tropical Medicine and Laboratory Medicine ，Hainan Medical College ，Haikou 571199，China)

Abstract ：Objective ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｆｕｎｇｉｆｒｏｍｓｏｉｌｏｆｍａｎｇｒｏｖｅｉｎＨａｉｎａｎ．Methods ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｆｕｎｇｉｆｒｏｍｍａｎｇｒｏｖｅｓｏｉｌｓａｍｐｌｅｓｏｎｔｈｅＰＤＡｍｅｄｉｕｍ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｔａｘｏｎｏｍｉｃｓｔａｔｕｓｏｆｓｔｒａｉｎｓｂｙｍｅａｎｓｏｆｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｃｕｌｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｒＤＮＡＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｓｑｕｅｎｃｅａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．Results ３２５ｆｕｎｇｕｓｓｔｒａｉｎｓａｔｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｍａｎｇｒｏｖｅｓｏｉｌｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎ１４ｇｅｎｅｒａ，ｃｏｕｎｔｉｎｇPenicillium sp ．２９．８４％，Trichoderma sp ．２２．４６％，Aspergillus sp ．２０．００％，Paecilomyces sp ．６．４６％，Cladosporium sp ．４．３１％．Conclusion ＴｈｅｆｕｎｇｉｒｅｓｏｕｒｃｅｓｉｎｍａｎｇｒｏｖｅａｒｅａｂｕｎｄａｎｔｉｎＨａｉｎａｎ．Penicillium sp ．，Trichoderma sp ．ａｎｄAspergillus sp ．ｗｅｒｅｔｈｅｍａｉｎｇｅｎｅｒａ．

Key words ：ｓｏｉｌｆｕｎｇｉ；ｍａｎｇｒｏｖｅｓ；ｆｕｎｇｉｃｏｍｍｕｎｉｔｙ；ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ

红树林为世界四大高生产力的海洋生态系

统之一，具有沼泽化、有机质含量高等主要特征[1]，具有丰富的真菌资源。鉴于其独特的生态结构，红树林真菌群必然有其独特的分子适应机制，具备形成独特新颖的次级代谢产物的潜能。目前红树林中的真菌已有超过200种被分离鉴定，并陆续有一些新种被发现[2]。

海南岛是红树林及其湿地资源保护的重要地区，对其微生态环境的研究尚在起步阶段，具有巨大的开发及应用前景。对这一独特的生态环境内的微生物资源进行收集、鉴定和保存亟待全面开展。因此，本研究从海南省红树林采集土壤样本进行微生物的分离，并对获得的真菌菌株进行分离和鉴定，了解红树林生态环境中真菌的分布特征，为红树林真菌的活性筛选以及后续的活性代谢产物研究奠定基础。

第２８卷第９期２０１２年９月

科技通报

BULLETIN OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Vol.28No.9Sep.2012

第28卷科技通报

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1土壤样本

采集于海南省演丰红树林国家自然保护区表土下5～20cm深度的土壤。

1.1.2试剂及培养基

大豆粉；葡萄糖；酵母粉；可溶性淀粉；蒸馏水；KH2PO4；琼脂糖；核酸染料；PCR试剂盒；海水马丁氏(Martin)培养基；马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。

1.2仪器设备

超净工作台(海尔HRCJ-2D)，恒温培养箱(上海申贤恒温DHP-240)，低速台式离心机(TDL-40B-Ⅱ)，PCR扩增仪(杭州博日TC-96/T/H)，分析天枰，水平电泳槽，稳流稳压电泳仪，凝胶成像系统。

1.3实验方法

1.3.1菌株的分离及纯化

称取10g土壤样本加入100mL无菌陈海水中，充分振荡后取上清制成10-2～10-4不同稀释度，各取100μL涂布于分离培养基上，28℃培养，待长出菌落挑取边缘菌丝接种于新的PDA培养基上，连续纯化几代，得到纯化菌株。

1.3.2形态学观察

菌株点植在PDA培养基上，28℃培养。从培养的第3d开始每天观察菌落特征。同时采用平皿插片法，28℃培养6d，在光镜下观察菌体特征。

1.3.3rDNA ITS序列测定及分析

采用改进的液氮研磨法提取真菌染色体DNA，以真菌通用引物ITS-1和ITS-4进行PCR 扩增，产物测序获得的rDNA ITS序列与GenBank 中的核酸数据进行同源性分析。测序结果采用ClustalX2软件进行多重序列对比，用MEGA4软件以N-J法绘制系统发育树。

2结果与分析

2.1菌株分离

共分离得到真菌325株，根据培养特征初步分类归纳，记作group1～14。

2.2形态学特征

以下为部分菌株在PDA培养基上的菌落及镜下形态特征。

菌株B036：2d见菌落生长，8d直径达7～8 cm。菌落扁平、质地疏松、绒毛状，呈放射状排列，淡紫色。产孢旺盛，肉眼可见紫色孢子密集。光镜下分生孢子穗半球形至球形，分生孢子梗光滑；顶囊球形；分生孢子头疏松放射状，见图1-A。

菌株B051：生长迅速，气生菌丝散生，布满整个培养基，呈絮状，培养3d，菌丝白色，沿平皿周围生长，培养至第7d出现绿色菌丝，第14d菌丝减少。背面呈现淡紫罗兰色至深紫罗兰色。分生孢子为绿色，近球形，具有突起，壁光滑，瓶梗烧瓶形，见图1-B。

菌株B032：菌落初为白色，棉絮状或粉状，背面为粉红色，第8d菌落大小达5.8cm。菌丝发达，光滑，无色，产孢梗单生，直或弯曲，分生孢子呈球形，聚集成团，见图1-C。

菌株B016：生长迅速，形成棉毛状的气生菌丝，菌落反面颜色从无色到浅黄色、黄色、琥珀色、黄绿色。光镜下，分生孢子近球形，壁光滑透明。形成厚壁孢子，表面光滑。分生孢子梗有粗直的主轴，有多级分枝，在远端变短变细，见图1-D。

图1真菌菌株的菌落形态(a)和显微形态(b,1000×) Fig.1The colonial morphology(a)and micromorphology(b,

1000×)of the fungi strains

2.3rDNA ITS序列测定及同源性分析

提取得到的标本rDNA ITS基因的PCR反应电泳结果，片段大小在500～750bp之间。获得的序列通过GenBank上BLAST进行同源性比对，将与菌株对应的得分最高的已登记菌株列表。结合菌株的菌落、显微形态特征，对照《真菌鉴定手册》[3]和《常见与常用真菌》[4]，14组真菌分别鉴定为14个菌属，其分布情况见表1。

2.4系统发育树的构建

以上述相似性高的相关种属的ITS

序列作为

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