拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究

植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254Chinese Bulletin of Botany

收稿日期：　２００５－１２－２０；　接受日期：　２００６－０３－０７

基金项目：　科技部重大基础研究前期研究专项（９７３预研）　（２００３ＣＣＡ０１１００）＊　通讯作者　Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｚｎｙａｎｇ＠ｓｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

．研究报告．

拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究

王鹏程１ 王晨１ 米华玲２ 周根余１ 杨仲南１＊

（１上海师范大学生命与环境科学学院 上海 ２００２３４）（２中国科学院上海植物生理生态研究所 上海 ２０００３２）

摘要 生物信息学分析表明，　模式植物拟南芥叶绿体中含有大约４　０００多种蛋白质，　目前只分离得到１　０００多种，　其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白ＡＴ５Ｇ４８７９０进行了亚细胞定位研究。我们克隆了该基因５＇端长１７８　ｂｐ的ＤＮＡ片段，　与绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因构建重组载体ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ。转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察，　ＧＦＰ只在叶绿体中特异表达。实验结果表明，　ＡＴ５Ｇ４８７９０的确为叶绿体蛋白。本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。

关键词 融合蛋白，　亚细胞定位，　转运肽

Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein in

Arabidopsis thaliana

Ｐｅｎｇｃｈｅｎｇ　Ｗａｎｇ１，　Ｃｈｅｎ　Ｗａｎｇ１，　Ｈｕａｌｉｎｇ　Ｍｉ２，　Ｇｅｎｙｕ　Ｚｈｏｕ１，　Ｚｈｏｎｇｎａｎ　Ｙａｎｇ１＊

１

（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２３４）

２

（Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ，　２０００３２）

Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｈａｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ａｂｏｕｔ　４　０００　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ；　ｈｏｗｅｖｅｒ，　ｏｎｌｙａｂｏｕｔ　１　０００　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｖａｌｉｄａｔｅｄ．　Ｔｈｕｓ，　ｗｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｖｅｒｉｆｙｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ａｔ５ｇ４８７９０　ｗａｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ａｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ　１７８　ｂｐ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　５＇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｆｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ＧＦＰ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｏｎ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｌａｓｅｒ－ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ　Ａｔ５ｇ４８７９０　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｃａｎ　ａｌｓｏ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉ－ｇａｔｅ　ｏｔｈｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ，　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ， ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ

叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器，　由叶绿体膜、类囊体和基质３部分构成，　其主要功能是进行光合作用，　另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成（Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２００１）。在拟南芥中，　叶绿体蛋白质绝大部分由

核基因组编码在细胞质中合成，　叶绿体基因组编码８７个蛋白（Ａｂｄａｌｌａｈ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）。拟南芥基因组序列分析表明，　１４％左右的核基因编码的产物定位在叶绿体中（Ａｂｄａｌｌａｈ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）。进一步的生物信息学分析表明，　拟南芥中４　２５５个

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核基因组编码的蛋白质为叶绿体蛋白（Ｆｒｉｓｏ　ｅｔａｌ．，　２００４），　其中２５％蛋白质的功能尚不明确。

近年来，　亚细胞蛋白质组学的兴起为阐明细胞器的组成、蛋白质的功能提供了强有力的方法。Ｐｅｌｔｉｅｒ等（２０００）利用质谱和二维电泳，结合Ｎ－端Ｅｄｍａｎ测序分析，　系统地分离出豌豆的６１个内腔蛋白和类囊体外周蛋白。在模式植物拟南芥中，　Ｐｅｌｔｉｅｒ等（２００２）又分离出８１个内腔和类囊体周边蛋白，　Ｋｉｅｓｅｌｂａｃｈ等（２０００）利用蛋白质组学的方法对类囊体蛋白进行分析并确定了２个蛋白，　Ｆｅｒｒｏ等（２００３）利用液相色谱技术分离出１１２个叶绿体膜蛋白，　Ｓｃｈｕｂｅｒｔ等（２００２）则从类囊体腔中分离出３６个蛋白，　Ｆｒｉｓｏ等（２００４）利用多种方法从类囊体膜蛋白质组中分离出１５４个蛋白质，　Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ等（２００３）利用改良的二维电泳分离出了叶绿体膜蛋白３９２个，Ｋｌｅｆｆｍａｎｎ等（２００４）采用串联质谱技术（ＭＳ／ＭＳ）从拟南芥中分离出６９０个叶绿体蛋白。这些实验数据的积累，　为叶绿体蛋白质的亚细胞定位、功能注释和大规模的蛋白质分选提供了可能，　同时为优化叶绿体蛋白质的预测软件提供了基础。

绝大多数叶绿体蛋白的Ｎ端具有转运肽（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ，　ＣＴＰ）序列特征，　通过对细胞质中合成的蛋白质前体的Ｎ端进行序列分析，　可以预测出构成叶绿体蛋白质组的蛋白质。目前广泛应用的预测软件主要有ＳｉｇｎａｌＰ、ＴａｒｇｅｔＰ、ＬｕｍｅｎＰ、ＣｈｌｏｒｏＰ和ＰＳＰＯＲＴ等。叶绿体蛋白质的亚细胞定位实验已有报道，　Ｍｉｔｓｕｄａ等（２００１）以ｃＤＮＡ与ｓＧＦＰ构建融合蛋白用于研究ＡＶＰ２基因在叶绿体中的定位，　Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ等（２００１）以ＡＰＧ２基因Ｎ端转运肽序列与ｓＧＦＰ构建融合蛋白研究其亚细胞定位。我们利用包含转运肽的基因组ＤＮＡ序列建立了一套用于研究蛋白质在叶绿体中亚细胞定位的实验方法，　并成功得到了未知功能蛋白ＡＴ５Ｇ４８７９０定位在叶绿体中的信息。１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 植物材料 野生型拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）　Ｃｏｌ－０，　由本实验室种植（培养室条件：　２２℃，　１６小时光照／８小时黑暗，　光通量密度１１０µｍｏｌ．ｍ－２．ｓ－１，　湿度约为３０％）。

１．１．２ 菌株和质粒 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α菌株由本实验室提供，　农杆菌ＡＳＥ菌株、含ＧＦＰ基因的质粒ｐＥＧＦＰ和植物双元表达载体ｐＭＯＮ５３０由中国科学院上海植物生理生态研究所黄海研究员提供。

１．１．３ 试剂 各种酶和生化试剂分别购自上海生工、大连宝生物和Ｓｉｇｍａ等公司。１．１．４ 引物合成 包含基因Ａｔ５ｇ４８７９０　Ｎ端转运肽片段的引物５＇端：　ＡＴＧ　ＴＣＡ　ＣＣＧ　ＴＣＣ　ＴＴＣＴＣＣ；　３＇端　ＧＴＣ　ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＡＴＴ ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＡＴＡＣＣＣ　ＴＣ　（下划线表示引入ＮｃｏⅠ位点）；　ＧＦＰ内部引物序列为５＇端：　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＴＴＡ　ＧＡＴ　ＧＧＴＧＡＴ　ＡＡＴ；　３＇端ＡＴＡ　ＡＣＣ　ＴＴＣ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　ＧＧＣＡＣＴ　Ｃ。

１．２ 方法

１．２．１ 质粒提取、ＤＮＡ片段克隆和重组质粒鉴定　参照分子克隆实验指南（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，　２００２）。

１．２．２ ＤＮＡ片段回收 采用ＢｉｏＤｅｖ公司回收试剂盒，　并按其说明书进行操作。

１．２．３ 农杆菌介导拟南芥的转化 参照浸花法（Ｃｌｏｕｇｈ　ａｎｄ　Ｂｅｎｔ，　１９９８）进行。

１．２．４ 转基因Ｔ０代种子筛选 种子用７０％乙醇＋０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００混合液浸泡１０分钟，　无菌水冲洗４次，　用Ｔｏｐ　ａｇａｒ（０．１％琼脂水溶液）均匀涂布在卡那霉素抗性（５０　µg．ｍＬ−１）的ＰＮＳ固体培养基上，　４℃春化２天后，　在培养室中培养。１．２．５ 转基因植株的ＰＣＲ检测 以筛选出来的Ｔ１代植株的总ＤＮＡ为模板，　采用ＧＦＰ引物进行ＰＣＲ扩增。