拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究

植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254Chinese Bulletin of Botany
收稿日期：　２００５－１２－２０；　接受日期：　２００６－０３－０７
基金项目：　科技部重大基础研究前期研究专项（９７３预研）　（２００３ＣＣＡ０１１００）＊　通讯作者　Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｚｎｙａｎｇ＠ｓｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
．研究报告．
拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究
王鹏程１ 王晨１ 米华玲２ 周根余１ 杨仲南１＊
（１上海师范大学生命与环境科学学院 上海 ２００２３４）（２中国科学院上海植物生理生态研究所 上海 ２０００３２）
摘要 生物信息学分析表明，　模式植物拟南芥叶绿体中含有大约４　０００多种蛋白质，　目前只分离得到１　０００多种，　其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。

本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白ＡＴ５Ｇ４８７９０进行了亚细胞定位研究。

我们克隆了该基因５＇端长１７８　ｂｐ的ＤＮＡ片段，　与绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因构建重组载体ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ。

转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察，　ＧＦＰ只在叶绿体中特异表达。

实验结果表明，　ＡＴ５Ｇ４８７９０的确为叶绿体蛋白。

本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。

关键词 融合蛋白，　亚细胞定位，　转运肽
Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein in
Arabidopsis thaliana
Ｐｅｎｇｃｈｅｎｇ　Ｗａｎｇ１，　Ｃｈｅｎ　Ｗａｎｇ１，　Ｈｕａｌｉｎｇ　Ｍｉ２，　Ｇｅｎｙｕ　Ｚｈｏｕ１，　Ｚｈｏｎｇｎａｎ　Ｙａｎｇ１＊
１
（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２３４）
２
（Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ，　２０００３２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｈａｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ａｂｏｕｔ　４　０００　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ；　ｈｏｗｅｖｅｒ，　ｏｎｌｙａｂｏｕｔ　１　０００　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｖａｌｉｄａｔｅｄ．　Ｔｈｕｓ，　ｗｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｖｅｒｉｆｙｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ａｔ５ｇ４８７９０　ｗａｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ａｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ　１７８　ｂｐ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　５＇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｆｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ＧＦＰ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｏｎ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｌａｓｅｒ－ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ　Ａｔ５ｇ４８７９０　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｃａｎ　ａｌｓｏ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉ－ｇａｔｅ　ｏｔｈｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ，　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ， ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ
叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器，　由叶绿体膜、类囊体和基质３部分构成，　其主要功能是进行光合作用，　另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成（Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２００１）。

在拟南芥中，　叶绿体蛋白质绝大部分由
核基因组编码在细胞质中合成，　叶绿体基因组编码８７个蛋白（Ａｂｄａｌｌａｈ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）。

拟南芥基因组序列分析表明，　１４％左右的核基因编码的产物定位在叶绿体中（Ａｂｄａｌｌａｈ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）。

进一步的生物信息学分析表明，　拟南芥中４　２５５个
２５０２３（３）
核基因组编码的蛋白质为叶绿体蛋白（Ｆｒｉｓｏ　ｅｔａｌ．，　２００４），　其中２５％蛋白质的功能尚不明确。

近年来，　亚细胞蛋白质组学的兴起为阐明细胞器的组成、蛋白质的功能提供了强有力的方法。

Ｐｅｌｔｉｅｒ等（２０００）利用质谱和二维电泳，结合Ｎ－端Ｅｄｍａｎ测序分析，　系统地分离出豌豆的６１个内腔蛋白和类囊体外周蛋白。

在模式植物拟南芥中，　Ｐｅｌｔｉｅｒ等（２００２）又分离出８１个内腔和类囊体周边蛋白，　Ｋｉｅｓｅｌｂａｃｈ等（２０００）利用蛋白质组学的方法对类囊体蛋白进行分析并确定了２个蛋白，　Ｆｅｒｒｏ等（２００３）利用液相色谱技术分离出１１２个叶绿体膜蛋白，　Ｓｃｈｕｂｅｒｔ等（２００２）则从类囊体腔中分离出３６个蛋白，　Ｆｒｉｓｏ等（２００４）利用多种方法从类囊体膜蛋白质组中分离出１５４个蛋白质，　Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ等（２００３）利用改良的二维电泳分离出了叶绿体膜蛋白３９２个，Ｋｌｅｆｆｍａｎｎ等（２００４）采用串联质谱技术（ＭＳ／ＭＳ）从拟南芥中分离出６９０个叶绿体蛋白。

这些实验数据的积累，　为叶绿体蛋白质的亚细胞定位、功能注释和大规模的蛋白质分选提供了可能，　同时为优化叶绿体蛋白质的预测软件提供了基础。

绝大多数叶绿体蛋白的Ｎ端具有转运肽（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ，　ＣＴＰ）序列特征，　通过对细胞质中合成的蛋白质前体的Ｎ端进行序列分析，　可以预测出构成叶绿体蛋白质组的蛋白质。

目前广泛应用的预测软件主要有ＳｉｇｎａｌＰ、ＴａｒｇｅｔＰ、ＬｕｍｅｎＰ、ＣｈｌｏｒｏＰ和ＰＳＰＯＲＴ等。

叶绿体蛋白质的亚细胞定位实验已有报道，　Ｍｉｔｓｕｄａ等（２００１）以ｃＤＮＡ与ｓＧＦＰ构建融合蛋白用于研究ＡＶＰ２基因在叶绿体中的定位，　Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ等（２００１）以ＡＰＧ２基因Ｎ端转运肽序列与ｓＧＦＰ构建融合蛋白研究其亚细胞定位。

我们利用包含转运肽的基因组ＤＮＡ序列建立了一套用于研究蛋白质在叶绿体中亚细胞定位的实验方法，　并成功得到了未知功能蛋白ＡＴ５Ｇ４８７９０定位在叶绿体中的信息。

１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 植物材料 野生型拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）　Ｃｏｌ－０，　由本实验室种植（培养室条件：　２２℃，　１６小时光照／８小时黑暗，　光通量密度１１０µｍｏｌ．ｍ－２．ｓ－１，　湿度约为３０％）。

１．１．２ 菌株和质粒 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α菌株由本实验室提供，　农杆菌ＡＳＥ菌株、含ＧＦＰ基因的质粒ｐＥＧＦＰ和植物双元表达载体ｐＭＯＮ５３０由中国科学院上海植物生理生态研究所黄海研究员提供。

１．１．３ 试剂 各种酶和生化试剂分别购自上海生工、大连宝生物和Ｓｉｇｍａ等公司。

１．１．４ 引物合成 包含基因Ａｔ５ｇ４８７９０　Ｎ端转运肽片段的引物５＇端：　ＡＴＧ　ＴＣＡ　ＣＣＧ　ＴＣＣ　ＴＴＣＴＣＣ；　３＇端　ＧＴＣ　ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＡＴＴ ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＡＴＡＣＣＣ　ＴＣ　（下划线表示引入ＮｃｏⅠ位点）；　ＧＦＰ内部引物序列为５＇端：　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＴＴＡ　ＧＡＴ　ＧＧＴＧＡＴ　ＡＡＴ；　３＇端ＡＴＡ　ＡＣＣ　ＴＴＣ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　ＧＧＣＡＣＴ　Ｃ。

１．２ 方法
１．２．１ 质粒提取、ＤＮＡ片段克隆和重组质粒鉴定　参照分子克隆实验指南（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，　２００２）。

１．２．２ ＤＮＡ片段回收 采用ＢｉｏＤｅｖ公司回收试剂盒，　并按其说明书进行操作。

１．２．３ 农杆菌介导拟南芥的转化 参照浸花法（Ｃｌｏｕｇｈ　ａｎｄ　Ｂｅｎｔ，　１９９８）进行。

１．２．４ 转基因Ｔ０代种子筛选 种子用７０％乙醇＋０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００混合液浸泡１０分钟，　无菌水冲洗４次，　用Ｔｏｐ　ａｇａｒ（０．１％琼脂水溶液）均匀涂布在卡那霉素抗性（５０　µg．ｍＬ−１）的ＰＮＳ固体培养基上，　４℃春化２天后，　在培养室中培养。

１．２．５ 转基因植株的ＰＣＲ检测 以筛选出来的Ｔ１代植株的总ＤＮＡ为模板，　采用ＧＦＰ引物进行ＰＣＲ扩增。

２５１２００６王鹏程　等：　拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究
１．２．６ 转基因植株的激光扫描共聚焦显微镜的观察 用激光扫描共聚焦显微镜（ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ，　Ｚｅｉｓｓ）观察叶肉细胞中ＧＦＰ的表达，　观察时物镜放大倍数为４０倍，　激发光波长为４８８　ｎｍ，带通ＢＰ　５０５￣５３０　ｎｍ，　长通ＬＰ　５６０　ｎｍ。

２ 结果
２．１ 叶绿体亚细胞定位双元表达载体的构建
利用ＫｐｎⅠ和ＥｃｏＲⅠ限制性内切酶消化质粒ｐＥＧＦＰ，　获得包含ＧＦＰ基因的７５０　ｂｐ片段，　将其插入到相同内切酶消化的质粒ｐＭＯＮ５３０中，构建成用于叶绿体定位的双元载体ｐＭＯＮ５３０－ＧＦＰ（图１）。

２．２ Ａｔ５ｇ４８７９０亚细胞定位表达载体的构建
通过ＴａｒｇｅｔＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒ－ｖｉｃｅｓ／ＴａｒｇｅｔＰ）预测，　发现未知蛋白ＡＴ５Ｇ－４８７９０Ｎ－端４８ａａ具有转运肽结构。

以Ｃｏｌ－０基因组ＤＮＡ为模板，　ＰＣＲ扩增一段包含转运肽的ＤＮＡ序列，　长度为１７８　ｂｐ，　将其命名为ｃＴＰ。

ｃＴＰ与ｐＭＤ１８－Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ　连接，　构建Ｔ－Ａ克隆并经Ｍ１３引物鉴定方向，　将正向插入克隆命名为ｃＴＰ－Ｔ。

ｃＴＰ－Ｔ质粒经过ＫｐｎⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切与用相同酶切过的载体ｐＭＯＮ５３０－ＧＦＰ连接构建表达载体ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ（图２）。

２．３ 转基因植株的获得
将质粒ｐＭＯＮ５３０－ＧＦＰ与ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ分别导入农杆菌ＡＳＥ，　采用农杆菌介导法转化拟南芥。

Ｔ０代种子萌发经卡那霉素抗性筛选后，　分别得到Ｔ１代植株１１３棵（图３Ａ）和４２棵（图３Ｂ），　转化效率分别为０．５％和０．３％。

经移栽后，　转基因植株表型正常。

２．４ 外源基因整合及表达检测结果２．４．１ 目的基因ＰＣＲ检测 我们对筛选出来的Ｔ１代植株各取２０株采用ＧＦＰ内部引物进行分子检测。

在转基因ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ中，ＰＣＲ检测结果全部呈阳性（图４给出部分结果）；在转基因ｐＭＯＮ５３０－GＦＰ植株中，　ＰＣＲ检测１９株为阳性，　转基因假阳性比率较低。

２．４．２ 报告基因ＧＦＰ表达 我们对ＰＣＲ检测出的阳性植株用激光共聚焦显微镜观察ＧＦＰ的表达实验，　结果显示在４８８　ｎｍ的激发光下，　扣除野生型Ｃｏｌ－０叶绿素自发绿色荧光背景（图６Ａ￣Ｃ），　在ｐＭＯＮ５３０－ＧＦＰ转基因植株中，　观察到绿色荧光在细胞质中呈弥散性分布（图６Ｄ￣Ｆ）；在ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ转基因植株中，　ＧＦＰ信号
图１ 叶绿体亚细胞定位双元载体ｐＭＯＮ５３０－ＧＦＰ的构建
Ｆｉｇ．　１ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭＯＮ５３０－ＧＦＰ图２ 双元表达载体ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ的构建Ｆｉｇ．　２ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ
Ｍ．λＤＮＡ／ＰｓｔⅠ　Ｍａｒｋｅｒ；　Ｌｉｎｅ１−２．　ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ／ＫｐｎⅠ＋ＥｃｏＲ
Ⅰ
２５２２３（３）
与叶绿素自发荧光共定位在叶绿体中（图６Ｇ￣Ｉ）。

这些结果表明，　ＧＦＰ蛋白不含有信号肽序列就不会进入细胞器中，　基因Ａｔ５ｇ４８７９０中的ｃＴＰ具有转运肽的功能，　能将蛋白质定位在叶绿体中。

３ 讨论
蛋白质在细胞器中的定位对于明确其功能和参与的代谢途径有着非常重要的作用。

虽然预测拟南芥中有４　０００多种叶绿体蛋白，　但是得到实验验证的只有１　０００多个。

一方面，　仅
核酮糖－１，　５－二磷酸羧化酶（ｒｉｂｕｌｏｓｅ－１，　５－ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，　ＲｕＢＰａｓｅ）系统就占叶绿体可溶性蛋白质的５０％￣８０％；　另一方面，　一些叶绿体蛋白质丰度特别低，　膜蛋白的分离也很困难，　因此很难用蛋白质组学方法进行验证。

我们采用的实验方法是蛋白质组学等方法的有力补充，　载体构建过程简单，　所采用的报道基因采用ＧＦＰ突变系ＥＧＦＰ（Ｐｈｅ－６４　ｔｏ　Ｌｅｕ；　Ｓｅｒ－６５　ｔｏ
Ｔｈｒ），　荧光强度、发光效率更高，　是一种方便、经济的实验方法。

大规模进行蛋白质的亚细胞定位时，　可以在５＇引物引入ＫｐｎＩ位点，　转基因时也可以采用基因枪轰击烟草瞬间表达方法快速的获得亚细胞定位的信息。

我们的实验是基于ＴａｒｇｅｔＰ软件预测出基因具有Ｎ－端转运肽序列，　未预测出转运肽信息的蛋白质采用本实验方法时需要通过ＲＴ－ＰＣＲ克隆ｃＤＮＡ与构建ＧＦＰ融合蛋白。

为进一步确定某蛋白质的亚细胞定位还需要分离亚细胞结构并制备蛋白质的抗体进行免疫印迹实验。

此外，　对于具有导肽等信号肽的线粒体及其他亚细胞组成蛋白的定位也适用。

通过该实验，
确定未知功能蛋白
ＡＴ５Ｇ４８７９０定位于叶绿体中，　为阐明该蛋白质生物学功能以及参与的生命活动过程奠定了基
图３ 转基因Ｔ１代植株卡那霉素抗性筛选结果
Ａ．　转入ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ质粒；　Ｂ．　转入ｐＭＯＮ５３０－ＧＦＰ质粒
Ｆｉｇ．　３ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　（Ｔ１）　ｏｎ　ｔｈｅ　ＫＡＮＲ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ．　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈ　ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ（Ａ）　ａｎｄ　ｐＭＯＮ５３０－ＧＦＰ（Ｂ）
图４ ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ转基因植株ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ．　４ ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ
Ｍ．　ＤＬ２０００　Ｍａｒｋｅｒ；　Ｌｉｎｅ　０．　Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ；　Ｌｉｎｅ　１．　Ｐｌａｓ－ｍｉｄ　ｏｆ　ｐＥＧＦＰ；　Ｌｉｎｅ　２−１０．　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ
Ａ
Ｂ
２５３２００６王鹏程　等：　拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究
图５ 转基因拟南芥细胞中荧光的观察
Ａ∼Ｃ．　野生型Ｃｏｌ－０荧光观察；　Ｄ∼Ｆ．　转基因ｐＭＯＮ５３０－ＧＦＰ植株荧光观察；　Ｇ∼Ｉ．　转基因ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ植株荧光观察；　其中，　Ａ、Ｄ和Ｇ为ＧＦＰ绿色荧光，　Ｂ、Ｅ和Ｈ为叶绿素自发荧光，　Ｃ、Ｆ和Ｉ分别为叠加后的结果
Ｆｉｇ．　５ Ｔｈｅ　ｆｌｕｏｒｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｃｅｌｌｓ
Ａ−Ｃ．　Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　Ｃｏｌ－０　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；　Ｄ−Ｆ．　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｐＭＯＮ５３０　－ＧＦＰ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；　Ｇ,Ｉ．　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；　Ａ，　Ｄ，　Ｇ．　Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；　Ｂ，　Ｅ，　Ｈ．　Ｃｈｌｏｒｏ－ｐｈｙｌｌ　ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；　Ｃ，　Ｆ，　Ｉ．　Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ
础，　其他分子生物学技术的应用包括ＲＮＡ干涉对该基因的研究有可能深入揭示其编码的蛋白质在叶绿体及光合作用过程中的作用。

参考文献
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２５４２３（３）
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Ｆｅｒｒｏ，　Ｍ．，　Ｓａｌｖｉ，　Ｄ．，　Ｂｒｕｇｉｅｒｅ，　Ｓ．，　Ｍｉｒａｓ，　Ｓ．，Ｋｏｗａｌｓｋｉ，　Ｓ．，　Ｌｏｕｗａｇｉｅ，　Ｍ．，　Ｇａｒｉｎ，　Ｊ．，　Ｊｏｙａｒｄ，Ｊ．，　ａｎｄ　Ｒｏｌｌａｎｄ，　Ｎ．　（２００３）．　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｌｏ－ｒｏｐｌａｓｔ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　２，　３２５－３４５．
Ｆｒｉｓｏ，Ｇ．，Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉ，Ｌ．，Ｙｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｐｅｌｔｉｅｒ，Ｊ．Ｂ．，　Ｒｕｄｅｌｌａ，　Ａ．，　Ｓｕｎ，　Ｑ．，　ａｎｄ　Ｗｉｊｋ，　Ｋ．Ｊ．　（２００４）．Ｉｎ－ｄｅｐｔｈ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｙｌａｋｏｉｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ：　Ｎｅｗｐｒｏｔｅｉｎｓ，　ｎｅｗ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，　ａｎｄ　ａ　ｐｌａｓｔｉｄ　ｐｒｏｔｅｏｍｅｄａｔａｂａｓｅ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１６，　４７８－４９９．
Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ，　Ｊ．Ｅ．，　Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎ，　Ｃ．Ｇ．，　Ｒａｙ，　Ｗ．Ｋ．，ＭｃＡｎｄｒｅｗ，　Ｒ．Ｓ．，　Ｏｓｔｅｒｙｏｕｎｇ，　Ｋ．Ｗ．，　Ｇａｇｅ，　Ｄ．Ａ．，　ａｎｄ　Ｐｈｉｎｎｅｙ，　Ｂ．Ｓ．　（２００３）．　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ　ｅｎｖｅｌｏｐｅｍｅｍｂｒａｎｅ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ　ｔｏ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．　Ｊ．　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｒｅｓ．　２，　４１３－４２５．
Ｋｉｅｓｅｌｂａｃｈ，　Ｔ．，　Ｂｙｓｔｅｄｔ，　Ｍ．，　Ｈｙｎｄｓ，　Ｐ．，　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃ．，　ａｎｄ　Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，　Ｗ．Ｐ．　（２０００）．　Ａ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｈｏ－ｍｏｌｏｇｕｅ　ａｎｄ　ｎｏｖｅｌ　ｐｌａｓｔｏｃｙａｎｉｎ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｂｙ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｔｏ　ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｔｈｙｌａｋｏｉｄ　ｌｕｍｅｎ．　ＦＥＢＳＬｅｔｔ．　４８０，　２７１－２７６．
Ｋｌｅｆｆｍａｎｎ，Ｔ．，Ｒｕｓｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｄ．，ｖｏｎＺｙｃｈｌｉｎｓｋｉ，Ａ．，　Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ，　Ｗ．，　Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，　Ｋ．，　Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．，　ａｎｄ　Ｂａｇｉｎｓｋｙ，　Ｓ．　（２００４）．　Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｐａｔｈｗａｙ　ａｂｕｎ－ｄａｎｃｅ　ａｎｄ　ｎｏｖｅｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．　Ｃｕｒｒ．　Ｂｉｏｌ．　１４，
３５４－３６２．
Ｍｉｔｓｕｄａ，　Ｎ．，　Ｅｎａｍｉ，　Ｋ．，　Ｎａｋａｔａ，　Ｍ．，　Ｔａｋｅｙａｓｕ，　Ｋ．，ａｎｄ　Ｓａｔｏ，　Ｍ．Ｈ．　（２００１）．　Ｎｏｖｅｌ　ｔｙｐｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ　Ｈ（＋）－ＰＰａｓｅ　ｉｓ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｇｏｌｇｉａｐｐａｒａｔｕｓ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４８８，　２９－３３．
Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ，　Ｒ．，　Ｎａｇａｔａ，　Ｎ．，　Ｉｔｏ，　Ｔ．，　Ｔａｋａｈａｓｈｉ，　Ｓ．，Ｈｏｂｏ，　Ｔ．，　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，　Ｋ．　（２００１）．Ａｎ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ａ　ＴａｔＣ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ａ　Ｄｅｌｔａ　ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｉｎ　ｔｈｙｌａｋｏｉｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８，１０４９９－１０５０４．
Ｐｅｌｔｉｅｒ，Ｊ．Ｂ．，Ｆｒｉｓｏ，Ｇ．，Ｋａｌｕｍｅ，Ｄ．Ｅ．，Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，Ｐ．，　Ｎｉｌｓｓｏｎ，　Ｆ．，　Ａｄａｍｓｋａ，　Ｉ．，　ａｎｄ　ｖａｎ　Ｗｉｊｋ，　Ｋ．Ｊ．（２０００）．　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ：　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｌｕｍｅｎａｌ　ａｎｄｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｔｈｙｌａｋｏｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１２，　３１９－３４１．
Ｐｅｌｔｉｅｒ，Ｊ．Ｂ．，Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ，Ｏ．，Ｋａｌｕｍｅ，Ｄ．Ｅ．，Ｙｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．，Ｆｒｉｓｏ，Ｇ．，Ｒｕｄｅｌｌａ，Ａ．，Ｌｉｂｅｒｌｅｓ，Ｄ．Ａ．，Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，Ｐ．，ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ，Ｇ．，ａｎｄ　ｖａｎ　Ｗｉｊｋ，　Ｋ．Ｊ．　（２００２）．　Ｃｅｎｔｒａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆｔｈｅ　ｌｕｍｅｎａｌ　ａｎｄ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｔｈｙｌａｋｏｉｄ　ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅ－ｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１４，　２１１－２３６．
Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，　Ｍ．，　Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，　Ｕ．Ａ．，　Ｈａａｓ，　Ｂ．Ｊ．，　Ｆｕｎｋ，Ｃ．，　Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，　Ｗ．Ｐ．，　ａｎｄ　Ｋｉｅｓｅｌｂａｃｈ，　Ｔ．　（２００２）．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｍａｐ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｌｕｍｅｎ　ｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７７，　８３５４－８３６５．
（责任编辑：　于昕）。