家蚕MLP基因的克隆及其结构分析
家蚕普通气味结合蛋白Ⅰ和Ⅱ的cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达
家蚕普通气味结合蛋白Ⅰ和Ⅱ的cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达作者:宋志冰指导老师:阚云超(南阳师范学院生命科学与技术学院2003级4班)摘要:利用RT-PCR 技术扩增了编码家蚕雌、雄虫触角普通气味结合蛋白Ⅰ和Ⅱ的cDNA 片段,将其克隆至pGEM-T载体,获得了普通气味结合蛋白Ⅰ和Ⅱ基因成熟蛋白阅读框序列。
将该基因重组到表达型质粒pET30a ( + ) 中,并转化入原核细胞中表达。
序列测定结果表明,家蚕触角普通气味结合蛋白基因的成熟蛋白阅读框全长分别为495 bp 和483 bp,各自编码164和160 个氨基酸残基。
推导的氨基酸序列与已报道的10 种昆虫普通气味结合蛋白Ⅰ和Ⅱ高度同源(73 %～98 %) ,并具有气味结合蛋白的典型特征。
经IPTG 诱导,普通气味结合蛋白Ⅰ和Ⅱ基因能在大肠杆菌BL21(DE3) 中表达。
关键词：普通气味结合蛋白; 触角; 基因克隆; 原核表达Cloning and sequencing of cDNA encoding general odorantbinding protein Ⅰand Ⅱin the Bombyx moriAuthor: Song ZhibingGuider: Kan Yunchao(The college of life science and technology of Nan Yang NormalUniversity Class4 Grade2003)Abstract: The cDNA encoding the general odorant binding protein ⅠandⅡ(named as GOBP1andGOBP2) was isolated from themale and female antennae of Bombyx mori by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) . The cDNA fragment wasfurther cloned into Pgem-T vector , and then constructed into expression vector pET-30a ( + ) for overexpression in prokaryotic cells. Structural analysis showed that the full length of mature GOBP1 and GOBP2 open reading frame (ORF) were 495 bp and 483bp, encoding 164 and 160 amino acid residues . The deduced amino acid sequence showed a high identity to the reported sequences ofGOBP1 and GOBP2 from other insects and shared the typical structural features of odorant binding proteins from other insects.Induced by IPTG, the full length of GOBP1 and GOBP2 were expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) ..Key words：general odorant binding protein ; antenna ; gene cloning ; prokaryotic expression1 引言昆虫气味结合蛋白(odorant binding protein ,OBP) 是一类低分子的水溶性酸性蛋白(Pelosi andMaida ,1995) ,在昆虫识别外界气味物质中起重要作用(Li and Prestwich , 1997 ;王睿等,1999) ,多在昆虫嗅觉感器中表达。
家蚕hop基因的克隆及序列分析
途径 ， 笔者在 电子 克隆 的基 础 上， 过 Ｒ 通 Ｔ—Ｐ Ｒ对 家 蚕 的 Ｃ
ｈｐ基 因（ ｍ ｏ ） ｃ Ｎ ｏ Ｂ ｈｐ 的 Ｄ Ａ进行克隆和序列分析 ， 有关研究结
果为进一步理解家蚕 Ｊ Ｋ Ｓ Ａ Ａ ／ Ｔ Ｔ途径提供 了帮助。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 试 剂 ．
录 。在果蝇中 ， Ｋ Ｓ Ａ Ｊ ／Ｔ Ｔ信号通路由 ３个 配体 （ ｎａｒ ， Ａ Ｕ ｐｉ ｄ ｅ
是近年来新发现的一条信号转 导途径 ， 是干扰素作用 的细胞 内信号转导途径 ， 广泛参与细胞增殖 、 分化、 凋亡 以及免疫调
是鳞翅 目昆虫 的模 式 种 ， 是重 要 的经 济 昆虫 ， 对 Ｊ Ｉ／ 也 但 ＡＬ
ＳＡ Ｔ Ｔ途径中相关基 因克隆 和鉴定方 面 的研 究还 没有 报道 。
立， 总体 过程为 ： 胞外信号 与细胞表面受体的结合 ， 致与受 导
体关联的 Ｊ Ｋ 激 活 ， Ａ ｓ 然后这些 激酶 自我磷 酸化 以及 磷 酸化
与它们关联的受 体 ， 成 Ｓ Ａ ｓ的 Ｓ 结构域 的停泊 位点 ； 形 ＴＴ Ｈ
在通常情况下 ， 在形 成受￣／Ａ Ｊ Ｋ复合 物之前 ，Ｔ Ｔ Ｓ Ａ ｓ以非 活 化 的单体形式存在 于细胞质 中， 一旦形成 受￣ ／Ａ Ｉ Ｊ Ｋ复合物 ， Ｌ
有 的 ＪＫ 中 ， Ａ ｓ 为与受体联 合所必需 ） １个 Ｓ ： 、 Ｈ 结构 域 、 个 １ 调节拟激酶 （ｅｕａ ｒ ｐｅ ｄ —ｋｎｓ） ｒ ｌｔ ｙ ｓｕ ｏ ｉａｅ 结构域 和酪氨酸激 酶 ｇ ｏ
（ — ｉ ｓ） 构 域 Ｙ ｋｎ ｅ 结 ａ …。为 了 进 一 步 研 究 家 蚕 的 Ｊ Ｋ Ｓ Ａ Ａ ／Ｔ Ｔ
途径的差异 ， 笔者在电子克隆 的基础上 ， 已克 隆了家蚕 Ｓ Ａ ＴＴ
家蚕组织蛋白酶D基因的克隆、序列分析及其表达谱研究
家蚕组织蛋白酶D基因的克隆、序列分析及其表达谱研究
家蚕组织蛋白酶D基因的克隆、序列分析及其表达谱研究
组织蛋白酶D(cathepsin D,CtD)是溶酶体内天冬氨酸内切蛋白酶,参与机体多种生理病理过程,尤其在昆虫的发育变态过程中起着重要作用.利用NCBI上登录的组织蛋白酶D基因核酸序列和家蚕Bombyx mori表达序列标签(expressed sequence tags,EST)数据库,进行电子克隆获得家蚕组织蛋白酶D(BmCtD)基因的全长cDNA(DQ010007).该cDNA大小为1 543 bp,其中ORF长1 152 bp,同源性分析表明BmCtD与其他物种的CtD具有较高的相似性.BmCtD的mRNA存在选择性拼接,另外一种mRNA形式命名为BmCtDⅠ.RT-PCR实验表明该基因在本实验所调查的家蚕不同发育时期和组织中都有表达.
作者：杨远萍刘春王子龙王根洪夏庆友 YANG Yuan-Ping LIU Chun WANG Zi-Long WANG Gen-Hong XIA Qing-You 作者单位：西南大学蚕学与生物技术学院,农业部蚕桑学重点实验室,重庆,400716 刊名：昆虫学报ISTIC PKU 英文刊名：ACTA ENTOMOLOGICA SINICA 年，卷(期)：2006 49(2) 分类号：Q966 关键词：家蚕组织蛋白酶D 克隆序列分析表达谱。
蚕丝合成相关基因的克隆与表达分析
蚕丝合成相关基因的克隆与表达分析近年来，世界各地都有着蚕丝生产和相关技术的研究。
随着人们对突破蚕丝生产领域的渴望的增加，基因克隆和表达分析的研究也越来越成为关注焦点。
蚕丝的产生与合成蚕丝纤维是一种天然的纤维，通常来自于家蚕的茧。
蚕丝是由蛋白质组成的，含有大量的谷氨酸和丝氨酸。
产生蚕丝的主要器官是蚕茧腺，该器官位于家蚕的头部发育器官附近。
当家蚕开始缠绕茧时，茧腺开始分泌蚕丝蛋白并卷曲成茧。
由于家蚕缺乏活性异肽酶，因此茧腺分泌的蛋白质以单一的方式排列，形成均一的纤维。
蚕丝合成相关基因的克隆蚕丝蛋白是构成蚕丝的主要成分，因此研究蚕丝合成相关的基因对于理解蚕丝形成机制具有重要意义。
目前已经通过测序技术鉴定出了许多家蚕蚕丝蛋白基因，这些基因编码的蛋白质具有多样性和复杂性。
其中，家蚕的蚕丝蛋白家族分为A、B、C三个亚家族。
每个亚家族都有多个基因，不同基因之间在基因结构以及编码的蛋白质序列上都有差异。
在克隆家蚕蚕丝蛋白基因的过程中，常常采用RT-PCR和RACE等技术。
基于已有的基因序列，可以通过NCBI数据库等资源获取基因的信息，从而为克隆工作提供有用的参考。
在克隆过程中，需要特别注意不同基因之间的共同点和差异点，避免误操作和病毒污染等问题。
此外，还需要保证所得到的基因与自然界中的蚕种具有同源性，以确保实验结果的可重复性和可靠性。
蚕丝合成相关基因的表达分析蚕丝蛋白基因的表达与调控是蚕丝合成过程的关键。
表达分析研究可以揭示不同组织器官和生长阶段蚕丝蛋白基因的表达模式，为优化蚕丝生产流程提供科学依据。
目前，常用的基因表达分析技术有Northern blot、RT-PCR、实时荧光定量PCR等。
基于实时荧光定量PCR的表达分析技术具有灵敏度高、特异性强、数据准确、通量大的优点。
在使用该技术时，需要先设计合适的引物和探针，遵循实验操作规范，并对实验结果进行质量控制和统计分析。
根据表达分析结果，可以通过基因转表达等手段调控蚕丝膜生产的重要基因，从而提高蚕丝的产量和质量。
家蚕基因定位克隆
突变在U位点在家蚕产生是因为机翼光盘蜕皮激素的压抑响应无翅蛹和蛾。
隐性等位基因发生自发并映射在家蚕遗传连锁群1013.0。
通过定位克隆，我们该负责基因是边缘（FNG）编码FNG糖基转移酶，它参与调节Notch信号通路。
在四个不同的等位基因，我们发现了大量缺失FNG基因k和无义突变中，邻，和n。
在野生型（WT）蚕，FNG积极表现在翼片，脑和生殖器官从第四到NAL龄，但几乎没有在测试的其他组织。
原位杂交结果显示，FNG mRNA在野生翼盘的背层。
在无翅（WG）的mRNA，FNG-介导的Notch信号通路的下游标记，被定位于在WT翼盘背腹边界，但在边路盘明显压抑。
虽然果蝇FNG 的无效突变导致胚后的杀伤力，在家蚕FNG功能丧失只影响翼形态发生，组织分化表明昆虫之间的FNG不同的重要作用.翼的形成是一个重要的形态学变化翅膀的翼成虫盘，以回应昆虫保幼激素，蜕皮激素和。
果蝇的翼盘是一个良好的研究模型系统识别-ING参与模式的形成众多基因和形态理解过程的基因调控。
然而，无论是在果蝇中发现的机制实际上是应用竹叶提取其它昆虫物种还有待。
此外，虽然许多研究显示蜕皮激素对体外培养的翼盘发展的影响，鲜为人知的是，激素介导翼和变态过程中组织分化的分子机制。
翼的突变体中的原因是到涉及''基因的功能丧失。
显然，我们在K翼光盘表达异常的基因，发现膜联蛋白B13（Anxb13）的表达完全。
通过比较野生型和通过使用Anxb13的cDNA 作探针进行杂交ķ的基因组结构，我们发现，在整个基因是从第k基因组丢失。
此外，我们已经发现，Anxb13位于染色体（LG10），其包含的轨迹上。
这些表明，该基因可能位于附近Anxb13。
我们承诺通过定位克隆，以确定该基因，开始在Anxb13基因，细菌染色体（BAC）文库筛选和鸟枪法测序的基础上。
首先，我们比较了在k个突变体与野生型的周围区域的结构。
我们检测到一个大的染色体缺失以k，其中包括Anxb13和其他4个基因。
家蚕谷胱甘肽转移酶基因的克隆、序列分析及其表达模式研究
; glutathione Stransferases; sequence analysis; expression pattern
谷胱甘肽 S 转移酶(GSTs, EC 2.5.1.18)是一类 重要的同工酶超家族，广泛分布在动物、植物、酵母、 细菌等生物体中，具有消除内源和外源性有毒物质 的功能(Hemingway, 2000；Sheehan , 2001)。依 据细胞定位，GSTs 主要存在于微粒体和细胞质中， 哺乳动物的线粒体中也有发现。胞质和线粒体 GSTs 是由同源或异源的单体组成的一系列二聚体蛋白，
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15 (4): 595~601
研究论文·
家蚕谷胱甘肽转移酶基因的克隆、序列分析及其表达模式 *
左伟东, 余泉友, 李 斌, 刘 志, 代方银, 鲁 成 **
(西南大学农业部蚕桑学重点实验室，重庆 400715)
分别取脂肪体，并立即置于液氮中保存备用。
1.3 总 RNA 的提取与 cDNA 第 1 链的合成
用 RNA 试剂盒 TRIzo（l Invitrogen）试剂提取各
组织的总 RNA。cDNA 第 1 链采用 Oligo (dT)18 和
AMV 反转录酶（Promega）按操作说明合成。1.4 家蚕 GST 基因克 Nhomakorabea及序列测定
摘要: 谷胱甘肽 S 转移酶(GSTs)是昆虫体内重要的解毒酶系，在对外源和内源化合物解毒代谢中起着重要的作用。以
GenBank 中已知的昆虫 GST 的氨基酸序列在家蚕（
)基因组序列中作 TBLASTN 检索，获得了多个可能的家蚕
GST 同源基因。对其中的一个 GST 新基因进行了 EST 分析和克隆，结果表明,该基因编码区全长 663 bp。以该基因推导的氨基
家蚕BmPP基因的克隆及在Bm-12细胞的表达
Ｌ Ｐ Ｓ激 活 。ＭＤ 一２还 能 拓 宽 Ｔ Ｌ Ｒ ４对 Ｌ Ｐ Ｓ结 构 的 识 别 范 围 。这 些 结 果 说 明 ＭＤ一 ２在 Ｔ Ｌ Ｒ ４介 导 的
阴性 细菌 的细胞 壁 组成成 分 ，对 哺乳 动物 而言 ， 是 一种 强 烈 的 内毒 素 （ ｅ ｎ ｄ ｏ ｔ ｏ ｘ ｉ ｎ ） ，可 导致 宿 主 细
克 隆至 ｐ Ｉ Ｅ ｘ 一 ４载 体上 转 染 家蚕 Ｂ ｍｌ ２细胞 ，４ ８ ｈ后 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ — ｂ ｌ ｏ ｔ ｔ ｉ ｎ ｇ检 测发 现 Ｂ ｍ Ｐ Ｐ 成 功表 达 并进一 步研 究 Ｌ Ｐ Ｓ诱 导 家蚕 细胞发 生免 疫反 应 的通路研 究提供 材 料 。
Ｌ Ｐ Ｓ信 号 通路 中具 有 重要 作 用 ，ＭＤ 一２可 以帮 助 Ｔ Ｌ Ｒ ４识 别 Ｌ Ｐ Ｓ ／ Ｌ Ｂ Ｐ Ａ ２ Ｄ１ ４复 合 物 ，并 将 Ｌ Ｐ Ｓ锁 定 在结 合位 点上 。
昆虫 主要 是 依 赖 于 其 先 天免 疫 系统 来 对 抗 微 生 物 的入侵 ，当病 毒 、细 菌 等病 原物 入 侵 昆虫 时 ，
胞因子失控性表达 ，介导严重感染 、多脏器损伤 、 败血症休克等多种疾病 的发生发展 旧。通过对小 鼠 的研究 发 现 Ｌ Ｐ Ｓ在 诱 导 小 鼠发生 免 疫 反 应 的过
程 中 ，Ｌ Ｐ Ｓ 的 识 别 需 要 脂 多 糖 结 合 蛋 白 质 （ １ ｉ ｐ ０ ｐ ｏ ｌ ｙ ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｉ ｄ ｅ ｂ ｉ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ，Ｌ Ｂ Ｐ ） 、 Ｃ Ｄ １ ４ 、ＭＤ 一２等 三 个 分 子 。 首 先 Ｌ Ｂ Ｐ与 Ｌ Ｐ Ｓ结
可 以结 合 在 Ｔ Ｌ Ｒ ４胞 外 区 ， 与 Ｔ Ｌ Ｒ ４呈 生 理 性 相
家蚕核多角体病毒p10基因的克隆和分子系统进化分析[1]
![家蚕核多角体病毒p10基因的克隆和分子系统进化分析[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/4253676da98271fe910ef95a.png)
第30卷第1期2009年1月 华南农业大学学报Journal of S outh China Agricultural University Vol .30,No .1Jan .2009 收稿日期:2008204210 作者简介:孙京臣(1971—),男,副教授,博士;姜丽华(1975—),女,硕士;*对本文具有同样贡献; 通讯作者:蔡平钟(1963—),男,研究员,博士,E 2mail:cai pzhong@ 基金项目:广东省自然科学基金(7006695);广东省科技计划项目(2007B020710013)家蚕核多角体病毒p 10基因的克隆和分子系统进化分析孙京臣1*,姜丽华1*,龙 虎1,吴 钢2,徐兴耀1,钟万芳3,蔡平钟3(1华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;2四川省蚕业管理总站,四川成都610041;3四川省农业科学院生物技术核技术研究所,四川成都610066)摘要:根据Gen Bank 中家蚕核多角体病毒T3株中p 10基因的保守序列,克隆得到了8个不同地区的家蚕核多角体病毒的p 10基因,并分别与Gen Bank 中的NP V p 10基因进行比对.结果发现p 10基因都含有1个213bp 的开放阅读框(ORF )共编码70个氨基酸,8株P10蛋白间氨基酸序列相似性为95%～100%,相似性高.与Gen Bank 中Ac 2MNP V 和BmNP V 的P10蛋白相比,8株BmNP V P10蛋白都缺失了3个保守结构域中的C 2端结构域,只含有2个保守结构域,即N 2端卷曲螺旋和Pr o 丰富区.关键词:家蚕核多角体病毒;p 10基因;基因克隆;序列对比;分子系统进化中图分类号:S884.1 文献标识码:A 文章编号:10012411X (2009)0120064205C lon i n g and M olecul ar Phylogeneti c Ana lysis of p 10Gene from B om byx m ori Nucleopolyhedrov i rusS UN J ing 2chen1*,J I A NG L i 2hua1*,LONG Hu 1,WU Gang 2,XU Xing 2yao 1,Z HONG W an 2fang 3,CA I Ping 2zhong3(1College of Ani m al Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2Sichuan Pr ovincial Ad m inistrati on of Sericulture,Chengdu 610041,China;3I nstitute of B i otechnol ogy and Nuclear Technique,Sichuan Acade my of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China )Abstract:According t o the sequence of p 10gene of B o m byx m ori nuclear polyhedr osis virus (BmNP V )is olate T3,eight p 10genes of BmNP V collected fr om different areas were cl oned and aligned res pectivelywith relevant sequences in GenBank T Mdatabase .The open reading fra me (ORF )of all p 10genes fr om the 8strains of BmNP V s include 213nucleotides,encoding a putative p r otein of 70a m ino acids .Multi 2p le align ment of the P10p r oteins indicated that the si m ilarities bet w een the 8strains are 95%2100%.The p 10genes in all of the 8strains of BmNP V s als o lacked the C 2ter m inal structure domain when com 2pared with Ac MNP V p 10gene and BmNP V p 10gene .Therefore,the p 10genes cl oned only contains t w o conserved domains,na mely the N 2ter m inal coiled 2coil domain,and a p r oline 2rich domain .Key words:B o m byx m ori nucleopolyhedr ovirus;p 10gene;gene cl oning;sequence alignment;molecularphyl ogenetic evoluti on 核多角体病毒(Nuclear polyhedr osis virus,NP V )属于杆状病毒科Bacul oviridae,ds DNA 病毒,具囊膜,基因组为90～60kb,约编码80～180种蛋白质[122].目前已对鳞翅目、双翅目和膜翅目等多个杆状病毒基因组进行了全序列测定[3].根据包涵体形成方式的不同杆状病毒可分为NP V s和G V s.NP V s主要存在于鳞翅目昆虫中,膜翅目、双翅目、鞘翅目、缨翅目(蓟马)和毛翅目昆虫中也鉴别到了NP V s[4].研究表明P10启动子是在昆虫细胞中克隆和大量生产外源蛋白质的合适位点[526].1984年Kuzi o等[7]完成了第一个p10基因Ac MNP V p10基因的序列测定,目前已有棉贫夜蛾Sp li M NP V[2]、甜菜夜蛾Se MNP V[8]、油桐尺蠖B sS NP V[9]和家蚕BmNP V[10]等多种单粒包埋型及多粒包埋型NP V的p10基因被鉴定和研究.家蚕核多角体病毒(B o m byx m ori nuclear polyhe2 dr osis virus,BmNP V)是家蚕主要病原之一,伴随家蚕5000多年漫长的进化,在自然界也形成了许多地理隔离株.迄今为止,已克隆了BmNP V中国镇江株(BmNP VZh)[6]、中国台湾株(BmNP VTa)、韩国株(BmNP VK)[9]、日本株(BmNP VT3)和印度株(BmN2 P V I n)的p10基因.已克隆的BmNP V p10有编码94Aa的(如:BmNP VZh、BmNP VK1、BmNP VK2和BmNP VK3)及编码70Aa的基因(如BmNP VTa、BmN2 P VD1、BmNP VK4和BmNP V I n等).笔者克隆了8个不同地区的BmNP V p10基因,并比较了他们与已报道的p10基因的相似性,对加深BmNP V基因组的认识和分析BmNP V的地理分化具有一定的意义.1 材料与方法1.1 病毒、载体和受体菌株BmNP V分离株由华南农业大学蚕丝科学系收集、繁殖、保存.试验所用病毒株有埃及株(BmEg)和中国的镇江株(BmZj)、山东株(BmSd)、安徽株(BmAh)、徐闻株(BmXw)、遂溪株(BmSx)、翁源株(BmW y)、广州株(BmGz).克隆载体质粒pGE M2T Easy Vect or为Pr omega公司产品.Escherichia coli T OP10为I nvitr ogen公司产品.1.2 D NA的提取纯化采用碱裂解法提取纯化BmNP V的基因组DNA.质粒DNA的提纯采用常规方法[11].1.3 p10基因PCR引物设计合成根据BmNP V T3株(GenBank登录号为L33180) p10基因的保守序列,用GeneFisher软件设计一对特异引物,由上海生物工程技术有限公司(Sangon)合成.p10上游引物(Fp10)为5′2AGCT AGTTTCGGTT2 GTG A23′,对应BmNP V T3株基因组DNA的第108069～108086个核苷酸.下游引物(Rp10)为5′2 ATGGGTTTGTTTGCAACA23′,对应BmNP V T3株基因组DNA的第108940～108957个核苷酸,预期扩增产物大小约为900bp.1.4 PCR反应及产物的回收、连接和转化50μL的PCR反应体系包括:4×dNTP(各215 mmol/L)4μL,Fp10(25pmol/μL)和Rp10(25 pmol/μL)各1μL,各BmNP V基因组DNA分别为1μL(5ng),Taq DNA poly merase1μL(3U),10×Re2 acti on buffer5μL,ddH2O37μL.PCR反应条件:94℃预变性1m in;94℃变性1m in,48℃退火1m in, 72℃延伸1m in,30个循环;72℃后延伸10m in. PCR产物回收按华美生物工程公司RESI N Column T M 琼脂糖DNA纯化系统的方法操作.PCR产物与载体连接、转化参考Pr omega公司试剂盒说明进行,连接产物转化感受态E.coli DH5α或T OP10,X2gal、I PTG 蓝白斑筛选法获得阳性克隆.1.5 扩增产物D NA序列的测定重组克隆经PCR鉴定后,阳性克隆由上海生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定.利用引物SP6、T7及M13+、M13-测序引物对重组质粒进行测序,为保证测序的准确性,在第1次测序反应基础上,又设计中间引物进行测序.基因探索者软件进行拼接得到全序列.1.6 D NA序列分析及氨基酸的对比分析用BLAST软件在Gen Bank数据库中进行序列比较分析,基因探索者软件及NCB I上的ORF finder 进行ORF分析,利用ClustalW(Eur opean B i oinf or ma2 tics I nstitute)和D ialign进行多序列的相似性比对.根据NP V p10基因编码区氨基酸序列的相似性,用Treevie w软件绘制P10蛋白分子进化系统树.2 结果与分析2.1 p10基因克隆和筛选用碱裂解法从8株纯化BmNP V多角体中提取的基因组DNA为模板,用Fp10和Rp10引物进行PCR克隆p10基因,12g/L琼脂糖凝胶检测(图1).M:PCR Marker(1543,994,697,515,377,231bp);1:BmSd;2: BmZj;3:BmEg;4:BmAh;5:BmGz;6:BmXw;7:Bm W y;8:BmSx图1 PCR克隆BmNP V p10基因的电泳图Fig.1 Agar ose gel electr ophoresis of BmNP V p10gene p r oductsa mp lified by PCR56 第1期 孙京臣等:家蚕核多角体病毒p10基因的克隆和分子系统进化分析 由图1可见,以Fp10、Rp10为引物,从8株Bm2 NP V中均扩增到了长度约为900bp的片段,与Bm2 NP V T3株(L33180)p10基因大小相符.回收目的PCR产物,经RESI N Colu mn T M琼脂糖DNA纯化系统纯化、克隆,然后从菌液中提取重组质粒为模板进行PCR检测.结果8个重组质粒均能得到约为900bp 的片段,显示重组质粒中均成功插入了p10基因.2.2 p10基因序列测定及相似性对比分析序列拼接后,经相似性比对,克隆到的PCR产物分别为完整的p10基因和部分p26、p74基因.p10基因的大小分别是:BmEg(AF533970)为877bp; BmXw(AF536206)、BmGz(AF533971)、BmW y (AF533972)和BmSx(AY163811)为888bp;BmZj(AF533973)、BmAh(AF533974)、BmSd(AF533975)为889bp,ORF均为213bp,编码70个氨基酸,与BmNP V T3株(BmT3,L33180)克隆的p10基因编码氨基酸长度相同,而Zhang等[6]以江苏省镇江分离的BmNP V株得到的p10基因(BmZh)编码94个氨基酸.根据序列测定结果进行核苷酸相似性分析的结果见表1.从表1可以看出,克隆的BmNP V p10基因间核苷酸相似性为98%～99%,其中BmSd和BmZj的相似性为100%,与已报道BmT3、BmZh、Ac MNP VC6(Ac6)之间的相似性为93%～99%.因而笔者克隆的8株BmNP V p10基因编码蛋白质在已克隆的昆虫p10基因中是较短的.表1 NPV p10基因核苷酸相似性的比较Tab.1 S i m il ar ity of NPV p10gene Nucleoti de sequence% p10基因BmXw BmEg BmGz BmW y BmZj BmAh BmSx BmSd BmZh AcC6 BmT398999898989899989594 BmXw989899999999999593 BmEg9898989999989594 BmGz98989998989593 BmW y989999989594 BmZj98991009594 BmAh99989594 BmSx999694 BmSd9594 BmZh93 利用ClustalW软件对本试验的8株BmNP V的P10蛋白与其他NP V的P10蛋白氨基酸序列进行比较(图2).从图2可知,NP V p10基因编码的氨基酸残基数目差别较大,最长的编码105个氨基酸[12],最短的编码70个氨基酸.其中本研究从8株BmNP V 中扩增的p10基因及BmT3、Bm I n、BmK4、SlI n的p10基因都编码70个氨基酸,而BmZh、BmK1、BmK2、BmK3的p10基因都编码94个氨基酸,前者与后者相比少了末端的24个氨基酸,在P10蛋白的3个保守结构域中,前者比后者缺少碱性C2端结构域,有研究表明C2端结构域为P10纤维体形成所需要的[13],这种C2端缺失对P10蛋白的影响有待进一步的研究.本研究获得的8株BmNP V p10基因编码的氨基酸相似性较高,仅有几处差异.其中,BmXw和BmGz 的相似性最低,为95%,但与Zhang等[6]克隆的P10蛋白的相似性为91%～92%,与BmK1、BmK3的相似性为85%～88%,与BmK2的相似性较低,为67%～70%;与Mc A、Mc BSl Ch、SlI n、Sp li之间的相似性都低于50%.而BmNP V与Ac MNP V之间的P10蛋白的相似性达85%～88%.2.3 NPV p10基因的分子系统进化关系根据NP V p10基因编码氨基酸序列,利用Tree2 vie w软件绘制了36种昆虫P10蛋白的分子进化系统树.由图3可以看出,编码70个氨基酸的BmNP V P10(BmK42BmSd)系统聚类的距离都小于0.1.其中,BmK4、BmSx、BmAh、BmW y、BmT3、BmEg和BmZj、BmSd的距离系数为0,说明它们在进化上亲缘关系非常近;BmXw又与BmSd、BmZj亲缘关系较接近.BmK1与BmK3、BmK2三者之间的关系非常接近;在系统树中处于最接近的分支的依次还有Mc A和Mc B、Sl Ch和Sp li,它们的相似性分别为89%、96%、53%、98%.66 华 南 农 业 大 学 学 报 第30卷 “:”表示有保守的置换;“.”表示有半保守的置换;“-”表示与其他序列相比有缺失Bm I n:BmNP V I n (U46757);BmK1:BmNP VK1(AF247681);BmK2:BmNP VK2(AF247682);BmK3:BmNP VK3(AF247683);BmK4:BmNP VK4(AF247684);BmZh:BmNP VZh (S76783);Ep:EpNP V (AY043265);Mc A:NP V (U59461);Mc B:NP V (U75930);Sl Ch:Sl ChNP V (AF037263);SlI n:Sl ChNP V (X92713);Sp li:Sp li M NP V (X99377)图2 已克隆杆状病毒NP V p 10基因编码氨基酸序列的相似性比较Fig .2 Si m ilarity of NP V p 10a m ino acidsequencesAc:Ac MNP VC6(L22858),Ag:Ag MNP V (AY055828),Ah:Ah MNP V (AP006270),Ap:ApMNP V (AB106130),B s:B s NP V (AF034410),Cf:Cf M NP V (AF512031),Ep:EpNP V (AY043265),Ha:Ha NP V (AF265354),Hc:Hc NP V (AF302233),Hz:Hz NP V (AF334030),Ld:Ld MNP V (AF081810),Op:OpMNP V (U75930),Pn:PnNP V(U50441),Ro:Ro MNP V (AY145471),Se:Se MNP V (AF169823),Tn:TnS NP V (AF150991).图3 NP V P10蛋白分子进化系统树Fig .3 Molecular phyl ogenetic tree constructed based on NP VP10am ino acid sequences3 讨论本试验克隆的8株BmNP V p 10基因在ORF 的第209bp 后缺失了一个dATP,产生了终止密码子T AA (G ),从而使翻译提前终止,导致编码区减少了24个氨基酸残基.缺失部分是P10蛋白3个保守结构中的C 2端结构域,有研究表明,C 2端结构域是P10纤维体形成所需要的[13],这种缺失所带来的杆状病毒在形态、毒性上的变化及导致这种缺失形成的原因条件等有待进一步的研究.BmEg 株p 10基因在终止密码子T AA 后66～67bp 处缺失了1个10bp 的序列,其中包括poly (A )信号序列.在BmZh 和AcC6相应序列中,这10个核苷酸的位置恰好包含了终止密码子T AA.8株p 10基因的终止密码子也有差别,其中BmZj 株、BmSd 株、BmXw 株p 10基因的终止密码子为T AG,其余5株的为T AA.用Treevie w 软件绘制了P10蛋白的分子进化树,它在一定程度上反映了这些杆状病毒NP V 的亲缘关系,但并不能代表整个NP V 的分子系统发育状况,只有通过多个基因甚至整个基因组的进化分析,才能准确地确立杆状病毒的分子进化系统树[14]. 农林害虫的防治是21世纪面临的最重要的研究课题之一.随着生活水平的提高,无公害农产品的生产和消费越来越受人们的关注.而杆状病毒杀虫剂等生物农药的研究和应用可以为无公害农产品生产提供物质保障.多角体蛋白和P10蛋白不是病毒复制所必需的,杆状病毒表达系统利用杆状病毒这2个病毒76 第1期 孙京臣等:家蚕核多角体病毒p 10基因的克隆和分子系统进化分析 蛋白在昆虫细胞感染的晚期能大量复制的能力,它们的启动子能驱动外源基因的高水平表达[15].因而p10基因的强启动子在构建杆状病毒表达载体,外源、昂贵、稀有蛋白表达和生产及杆状病毒杀虫剂的改造方面有广泛的应用,日益受到人们的重视.参考文献:[1] MURPHY F A,F AUQUET C M,B I SHOP D H,et al.V irustaxonomy:Six report of the internati onal comm ittee on tax2onomy of viruses[J].A rch V ir ol,1995,144(Supp l10):206522070.[2] T O I STER2ACH I T UV M,F AKT OR O.Transcri p ti onal anal2ysis and p r omoter activity of the Spodoptera littoralis multi2cap sid nucleopolyhedr ovirus ecdyster oid UDP2glucosyl2transferase gene[J].J Gen V ir ol,1997,78(2):4872491.[3] LAUZ ON H A M,LUC AROTTI C J,KRE LL P J,et al.Se2quence and organizati on of the N eodiprion lecontei nucle2opolyhedr o virus genome[J].J V ir ol,2004,78(13):702327035.[4] FE 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焰】(上接第63页)[11]陶国祥.云南省秃杉气候区划的研究[J].林业调查规划,2001,26(4):9215.[12]陈建新,王明怀,殷祚云,等.广东省秃杉引种栽培效果及栽培区划分研究[J].林业科学研究,2002,15(4):3992405.[13]罗良才,徐莲芳.秃杉木材物理力学性质的研究[J].云南林业科技,1982(10):5220.[14]林金国,陈瑞英,彭彪,等.福建秃杉木材物理力学性质的研究[J].福建林学院学报,1997,17(3):2232226.[15]张连翔,梅秀艳,姜镇荣.小叶杨生长规律的研究[J].防护林科技,2001(2):10212.[16]全国杉木种源试验协作组.杉木种源早期选择研究[J].林业科学研究,1994,7(专刊):932100.[17]全国马尾松种子园课题协作组.马尾松种子园建立技术论文集[M].北京:学术书刊出版社,1990:127. 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家蚕基因特异性CAPs标记获得及其分子系统学应用
将L 再用 琼脂糖 , \ 扩增产物用限制性内切酶酶切 $ 凝胶电泳将 ] 用溴 化乙锭 染色 * 观察 ( G M 片段分开 $ , M L >标记所采用的 L , \ 引物是针对特定的基 因序 列而设计 $ 序列源 自 基 因 组 数 据 库 * D ] G M 序列以及
家蚕基因特异性 , M L >标记获得及其分子系统学应用 !# 期 !!!!!!!!! 黄健华等 #
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已克隆的 \ M L ] 条 带 等( 它 揭 示 的 是 特 异 性 L , \ 扩增片段中限制性 酶 切 位 点 变 异 的 信 息 $ 因而成为 检测 单 核 苷 酸 多 态 性 的 一 种 良 好 方 法
遗传稳定 !! 分子标记在生 物 体 中 具 有 数 量 丰 富 * 以及操作简便等 特 点 ( 目 前 $ 分子标记在家蚕研究 中被用 于 遗 传 图 谱 构 建 遗传多样 性 研 究
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注$ 如M P W L* \ M L ]* . . \* J . . \ 等 等( 本 文 提 及 的 , M L >! , F 7 < K 7 8M @ F C ? C 7 8L 4 F @ 4 5 A C D. 7 2 7 = D 7" 3 : 3 Z 也是一 种 以 L 又称为 L , \ 为基础的分子标记! , \ 0
’ ’ ’! ’ $ $ S T M G ;+ C < = 0 S 2 < U J M V/ 2 7 0 / C < W JU 2 0 1 < = X S M G ;Y 4 = B $ B$ ! ’ $ X S M V1 7 C 0 ; 2 4 S T M G ;Y 4 = 0 L C = B B $
家蚕精氨酸激酶基因的克隆,基因结构与表达分析
中国农业科学 2006,39(11):2354-2361 Scientia Agricultura Sinica收稿日期：2005-12-27；接受日期：2006-03-18基金项目：国家自然科学基金(30370805;B30080023)，国家重点基础研究发展计划“973”(2005CB121003)，浙江省自然科学基金(Y304352)作者简介：王华兵(1981-)，男，江苏洪泽人，硕士研究生，研究方向为基因工程与生物反应器。
whbwry@ 。
通讯作者徐豫松（1962-），浙江兰溪人，副教授，博士，研究方向为基因工程与生物反应器。
Tel: 0571- 86971658; E-mail: xuyusong@家蚕精氨酸激酶基因的克隆、基因结构与表达分析王华兵，徐豫松（浙江大学动物科学学院，杭州 310029）摘要：【目的】克隆家蚕精氨酸激酶基因，分析其基因结构与表达特性,为揭示无脊椎动物体内能量代谢调节规律提供重要基础。
【方法】通过分析家蚕EST、利用RACE 法和基因组文库筛选法克隆了家蚕精氨酸激酶（Bm AK,Bombyx mori arginine kinase）基因,并对其基因结构和表达特性进行了分析。
【结果】克隆了Bm AK 基因, cDNA全长为1 268bp,编码355个氨基酸，具有精氨酸激酶典型的酶活性部位氨基酸序列，酶活性中心位点氨基酸和能形成离子偶结构氨基酸；该基因由2个外显子和1个内含子组成；5′调控序列存在BRCZ、E74A、FTZ 等多个潜在转录因子结合位点，但没有TATA 盒启动子序列；该基因的表达在不同组织和不同发育时期存在明显差异。
【结论】Bm AK 具有精氨酸激酶的典型特征，Bm AK 基因表达随发育时期不同而发生变化，基因的表达可能受蜕皮激素调控。
关键词：家蚕；精氨酸激酶；基因结构；表达；转录因子cDNA Cloning, Genomic Structure and Expression ofArginine Kinase Gene from Bombyx mori (L.)WANG Hua-bing, XU Yu-song(College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310029)Abstract : 【Objective 】In order to clarify regulation mechanisms of energy metabolism of invertebrates, the arginine kinase gene in the silkworm,Bombyx mori was cloned and analyzed.【Method 】Based on the information of silkworm ESTs, the full-length cDNA of arginine kinase gene was cloned using the strategy of rapid amplification of cDNA ends, and then the genomic structure of Bm AK was analyzed. Further, the expression of Bm AK was examined.【Results 】Bm AK cDNA has 1268 bp and contains an open reading frame encoding a 355 amino acid protein. Bm AK contains the active sequence, the active site and a pair of highly conserved amino acids that form an ion pair. The Bm AK gene contains only 2 exons and 1 intron. The Bm AK promoter contains no TATA box, but potential binding sites for the transcription factors in both forward and reverse orientation:BRCZ 、E74A 、FTZ, etc. The expression level of Bm AK in different stages and tissues was obviously different.【Conclusion 】Bm AK has typical character of arginine kinase. The analysis on the transcription factor binding sites and the expression pattern of Bm AK showed that the developmental expression of Bm AK gene might be under control of ecdysone.Key words : Bombyx mori ; Arginine kinase; Gene structure; Expression; Transcription element0 前言【本研究的重要意义】精氨酸激酶是无脊椎动物体内主要的磷酸原激酶，它通过催化精氨酸和ATP 之间的可逆性反应，将能量存储于磷酸精氨酸的高能磷酸键中，或将磷酸精氨酸分解产生ATP [1]。
家蚕基质金属蛋白酶基因的克隆与表达分析的开题报告
家蚕基质金属蛋白酶基因的克隆与表达分析的开题
报告
一、课题背景
家蚕（Bombyx mori）是我国重要的经济昆虫，在养殖过程中，常受到各种病原体的侵袭。
基质金属蛋白酶（MMP）作为解剖学和生物化学研究中的重要点，参与了家蚕的组织重构和免疫反应。
因此，研究家蚕基质金属蛋白酶基因的克隆和表达，对于探讨家蚕的免疫反应机制和疾病防控具有重要意义。
二、研究内容和目标
本课题旨在克隆家蚕基质金属蛋白酶基因，进行序列分析并进行亚细胞定位研究。
同时，对家蚕不同发育阶段和不同组织中基质金属蛋白酶的表达量进行研究，探讨其在家蚕组织重构和免疫反应中的作用。
三、研究方法
1. 家蚕基质金属蛋白酶基因的克隆和序列分析
使用特异引物扩增家蚕基质金属蛋白酶基因，经PCR扩增后, 将产物纯化后进行克隆，逐个测序，并进行序列分析。
2. 亚细胞定位研究
将家蚕基质金属蛋白酶基因进行克隆并构建相关质粒，转染至细胞中，通过共定位染色体（DAPI）染色、荧光定标或免疫组织化学等方法研究其亚细胞定位。
3. 基质金属蛋白酶的表达分析
通过RT-qPCR 方法分析家蚕不同发育阶段和不同组织中基质金属蛋白酶的表达水平；利用Western blot方法检测蛋白表达水平，并进行蛋白纯化和质量分析。
四、预期成果
通过本课题的研究，预期获得家蚕基质金属蛋白酶基因序列信息、基因在细胞内的亚细胞定位研究结果以及家蚕不同发育阶段和不同组织中基质金属蛋白酶的表达水平，进一步明确家蚕免疫反应机制和病害防控措施，为家蚕养殖健康发展提供理论基础和科学依据。
家蚕新突变体二龄不眠蚕基因的定位克隆及功能研究
家蚕新突变体二龄不眠蚕基因的定位克隆及功能研究家蚕(Bombyx mori)作为一种重要的经济型鳞翅目昆虫,有着特殊的研究价值,已经成为重要的实验材料,前期积累了大量的关于基因的功能研究和相关的基础研究成果,使家蚕已经发展成为进行鳞翅目研究的模式生物。
家蚕为完全变态发育昆虫,蜕皮是其生长、发育、变态的重要生理过程,是家蚕个体生长发育成熟所必需的。
家蚕二龄不眠蚕突变体(non-molting in the 2nd instar,nm2)发育到二龄将眠期后不能蜕皮而死亡,是在家蚕品种资源C603中发现的一种新不眠蚕突变体。
本研究对该突变体进行遗传分析,采用图位克隆的方法对nm2基因进行定位克隆,构建遗传连锁图,进一步采用qRT-PCR、2-DE、RNAi、蜕皮激素和环己酰亚胺添食等方法对候选基因进行表达分析和功能验证,以阐述该突变体发生的分子机制。
主要的研究结果如下:一、nm2突变体的遗传分析家蚕二龄不眠蚕突变体是从家蚕品种资源C603中分离获得的一个自然突变体,该突变体在1龄期能全部正常就眠,发育到2龄将眠期皮肤光滑有光泽,进食量减少,不能正常入眠蜕皮,维持二龄将眠蚕状态6~8d后陆续死亡。
遗传分析表明该突变是由常染色体上的一个隐性遗传基因控制的,具有隐性纯合(即nm2nm2)致死性。
二、nm2突变基因的定位构建P1、P2、F1、BC1F和BC1M群体,用P1、F1和P2筛选获得家蚕每个连锁群上的SSR多态性分子标记,然后分别用有分离的BC1F 和BC1M群体中正常型和突变型2种个体进行验证。
将BC1F群体中同一蛾区的10个二龄不眠蚕突变体和10个正常个体用作连锁分析,结果表明nm2基因位于家蚕第5连锁群;用BC1M群体中594个突变型个体进行精细定位,结果显示nm2基因位于多态性标记S2529-27与S2529-32之间,这两个多态性标记之间相距约275.6kb,其中有13个候选基因。
三、nm2突变基因的鉴定采用RT-PCR方法将13个候选基因进行转录水平表达的比较分析,BMgn002601和BMgn002602在正常型个体和突变个体间有表达差异。
家蚕丙酮酸脱氢酶激酶基因的克隆与原核表达
程紧密地连接起来 ， 在细胞线粒体呼吸链能量代谢 中起
关键作用 Ｊ 。而丙酮 酸脱氢酶激酶（ Ｄ ） Ｐ Ｃ的 ＰＫ是 Ｄ
负调控酶， 催化 Ｐ Ｃ磷酸化使其失活 ， Ｄ 在新 陈代谢调节
中起着极其重要 的作用 。 。家蚕丙酮 酸脱氢 酶激酶
（ ｍ Ｄ 的活性 受葡 萄糖代 谢产 物 的影响 ， 酮酸、 Ｂ Ｐ Ｋ） 丙 ＮＤ Ａ 以及辅酶 Ａ都能抑制 Ｂ Ｐ Ｋ的活性 ， ｍＤ 而乙酰辅酶
ＷＡ Ｇ Ｌ — ａｇ ， Ｈ Ｎ Ｘｎ － ｉ ’ ， Ｕ Ｎ ｏｇ ， Ｈ Ｏ Ｑａ —ｌ ｇ’ Ｎ ｉ ｇｎ Ｓ Ｅ ｉｇ ｊ ａ Ｈ Ａ Ｇ Ｙ ｎ Ｚ Ａ ｉ ｏ ｉ ｎ （ ． ｉ ｇｕＵ ｉ ｒｉ ｉ ｃ ＆ Ｔ ｃｎｌ ｙ Ｚ ｅｊ ｇ １０３ Ｃ ｉａ ２ ｅ ｅｈ ｒ ｅｅｒｈＩｓｔｔ， ｈｎｓ ｃｄｍ １ Ｊ ｎｓ ｎｖ ｓｙｏ Ｓ ｅ ｅ ｅｈｏ ｇ ， ｈｎｉ ２０ ， ｈｎ ； ．Ｓｒ ｕ ｕａ Ｒ ｓａ ｔｕ Ｃ ｉ ｅＡ ａｅ ｙ ａ ｅ ｔ ｆｃｎ ｏ ｎ ａ ２ ｉ ｌ ｃ ｎｉ ｅ ｅ
江西农业学报
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家 蚕丙 酮酸 脱氢 酶激 酶基 因的克 隆 与原核 表达
家蚕cncckeap1-are通路的关键基因克隆及其功能分析
Cloning and functional analysis of key genes in CncC/keap1-ARE pathway, Bombyx moriAbstractSilkworm is an important silk insects, but also an important model insect of lepidoptera. Due to the widespread use of chemical pesticides in agriculture and forestry production, which resulted in contaminated mulberry silkworm poisoning and seriously affected the healthy development of the sericulture. CncC/keap1-ARE is an important signal transduction pathway involved in insect antioxidant and detoxification, which had been studied in Drosophila melanogaster and Tribolium confusum.In this study, the CncC and Keap1 genes were cloned and their amino acid sequences were analyzed. Through phylogenetic tree analysis and multi species sequence comparison, we found that the Neh1 motif of CncC was highly conserved in all species. DLG motifs of Neh2 in mammals was instead by DMG motif in Lepidoptera. The Cullin3 binding site and the DGR region of Keap1 were identified. These two sites played an important role in the ubiquitination of Keap1 regulated CncC.The expression characteristics of CncC and Keap1 were highly expressed in the first instar larvae, and the expression of CncC and Keap1 was higher in the gonad, metabolic and neural tissues. The highest expression of the two genes in the nervous system was the main reasons for the high expression of CncC and Keap1 in the first instar silkworm.The CncC and Keap1 transcription levels were significantly up-regulated 29.664 -fold and 25.479 -fold after 24 hr phoxim treatment was detected by qRT-PCR. The analysis of gene expression profile of the fat body of Bombyx mori.showed that the gene of thioredoxin reductase and glutathione S- transferase gene increased by 1.365 -fold, 1.335 -fold, 1.642 -fold and 1.765 -fold. The superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione S- transferase Delta (GSTd) and thioredoxin reductase (TPx) were up 1.365 -fold, 1.335 -fold, 1.642 -fold and 1.765 -fold in phoxim group. Quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to verify the transcriptional expression of SOD, CAT, GSTd and TPx genes, and the results were consistent with the transcriptome data. The levels of reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H2O2) were measured by 1.598 -fold, 1.946 -fold and 1.506 -fold, respectively. At the same time, the transcriptional level of CYP450 gene (cyp4m5, cyp6ab4, cyp4l6,cyp6ae2, cyp6a8, cyp9g3 and cyp306) which regulated by CncC, was found to be significantly up-regulated after treatment with phoxim in CYP450. The experimental results showed that the treatment of phoxim induced oxidative stress, the expression of CncC was up-regulated, and the transcriptional level of detoxification enzymes and antioxidant enzymes were up-regulated.Nanoparticles TiO2 (TiO2 NPs), as one of the most important nano materials, was widely used in the field of biology. Previous studies had shown that TiO2NPs could effectively slow down the oxidative stress induced by phoxim in Bombyx mori. TiO2 NPs can effectively reduce the damage of organophosphorus pesticides in the silk gland and nerve tissue. Fat body is an important metabolic detoxification organ in the silkworm, but TiO2 NPs treatment would affect the metabolism of pesticides in the fat body of Bombyx mori had not been reported. In this study, the SOD, CAT and GSTd transcription levels of the silkworm with TiO2 NPs treatment were decreased. The levels of ROS, MDA and H2O2 were restored to normal level with TiO2 NPs pretreatment and after 24 hr phoxim treatment. The results showed that TiO2 NPs could alleviate the oxidative stress induced by phoxim. Further elucidate the mechanisms of TiO2 NPs+phoxim groups, transcription level of P450 gene family were detected. The results showed that the expression of cyp4m5, cyp6ab4, cyp6a8 and cyp9g3 in TiO2 NPs+phoxim group were increased by 2.784 -fold, 3.047 -fold, 2.254 -fold and 4.253 -fold. The high expression of P450 family genes that improve the ability of body fat metabolism of phoxim. TiO2 NPs was able to induce the expression of some antioxidant genes in the fat body of Bombyx mori, and to alleviate the accumulation of superoxide caused by phoxim. At the same time, TiO2 NPs treatment could effectively alleviate the oxidative stress caused by phoxim poisoning.In this study, the full-length sequences of CncC and Keap1 were cloned and the basic functional domains of two genes were analyzed. It found that the oxidative stress induced by CncC could be induced by the treatment of phoxim, which induced the expression of detoxification enzymes and antioxidant genes regulated by CncC downstream. TiO2 NPs pretreatment could effectively alleviate the oxidative stress caused by phoxim in Bombyx mori. The regulation mechanism of CncC/keap1 signaling pathway in the fat body of Bombyx mori was clarified.Keywords: silkworm, CncC, keap1, phoxim, TiO2NPsWritten by: Jingsheng HuSupervised by: Weide Shen目录前言 (1)第一章综述 (3)1 Nrf2与keap1的研究现状 (3)1.1 Nrf2和keap1的简介 (3)1.2 Nrf2和keap1的结构分析 (3)1.3昆虫Nrf2/keap1信号通路研究 (4)1.4 CncC/keap1在鳞翅目昆虫中研究的重要性 (5)2 Nrf2与keap1的功能研究 (6)2.1 Nrf/keap1信号通路的调控蛋白 (6)2.2 Nrf2的激动剂和抑制剂的研究 (9)3总结与展望 (9)第二章家蚕CncC与keap1的克隆及序列分析 (11)1 前言 (11)2 实验材料与方法 (12)2.1 家蚕品种和饲养方法 (12)2.2 RNA抽提 (12)2.3 RNA的纯化实验 (12)2.4 Race实验技术 (13)2.5 RNA的反转录 (14)2.6 3’ RACE的实验方法 (15)2.7 巢式PCR (15)2.8 琼脂糖凝胶电泳 (15)2.9 割胶回收 (15)2.10 感受态细胞制备 (16)2.11 连接转化 (16)2.12 挑斑菌检和质粒抽提 (17)2.13 质粒酶切鉴定 (17)2.14 实时荧光定量PCR (17)2.15 序列分析和进化分析 (18)2.16 统计分析 (18)3 实验结果 (18)3.1 序列克隆及分析 (18)3.2 序列的物种对比分析 (22)3.3 CncC和keap1在各个龄期和组织中的转录水平 (23)4讨论 (24)第三章外源物对CncC/keap1信号通路的影响 (27)1 前言 (27)2 实验材料和方法 (28)2.1 家蚕饲养和取材 (28)2.2 RNA测序分析 (28)2.3 RNA的抽提纯化和cDNA的第一链合成 (29)2.4 实时荧光定量PCR (29)2.5 氧化应激检测 (29)2.6 统计分析 (29)3 实验结果 (29)3.1 辛硫磷添食对五龄家蚕脂肪体CncC与keap1的转录水平的影响 (29)3.2 TiO2NPs和辛硫磷处理24hr后下游抗氧化基因和解毒基因的转录水平 (30)3.3 氧化应激水平 (31)4 讨论 (32)总结 (35)参考文献 (36)攻读学位期间公开发表的论文及项目 (46)附录 (48)致谢 (49)前言CncC（cap ‘n’ collar isoform-C）在细胞的氧化应激反应过程中发挥重要的作用。
家蚕基因组特征及其与昆虫群体特征关系分析
家蚕基因组特征及其与昆虫群体特征关系分析家蚕作为重要的农业害虫和经济昆虫，其生物学特征和群体行为一直备受关注。
在过去的几十年中，随着分子生物学技术的发展，人们逐渐了解到家蚕基因组的结构和功能。
本文将对家蚕基因组特征及其与昆虫群体特征关系进行分析。
一、家蚕基因组特征家蚕基因组大小约为432 Mb，含有31000个基因。
家蚕基因组由26条染色体组成，其中23条常染色体和3条性染色体。
性染色体具有稳定的性别决定系统，即XX/XY型。
家蚕基因组具有高程度的同源性，即不同染色体之间的相似性很高。
此外，家蚕基因组还具有一些显著的特征，如基因密度较高、反转录转座子较少、基因家族较多等。
二、家蚕基因组与昆虫群体特征关系家蚕的个体群体特征受到基因组的控制，家蚕基因组特征的分析对于探究昆虫群体特征及其遗传机制非常重要。
下面将就家蚕基因组与昆虫群体特征关系展开分析。
1.基因家族与种群结构基因家族是基因在进化过程中出现的相似同源基因，常常在类群之间共享。
家蚕基因组中存在许多基因家族，如翅膀发育、酪氨酸激酶、轮廓蛋白、钙离子通道等。
这些基因家族对于昆虫的种群结构和进化具有重要作用。
研究发现，家蚕基因组中的基因家族具有相对稳定的存在形式和在进化中的遗传规律，这与昆虫的种群结构和进化过程密切相关。
2.性染色体与性别决定机制昆虫性别决定机制多种多样，包括XO型、ZW型和XX/XY型等。
家蚕属于后者，即存在明显的两性染色体。
家蚕的性染色体对于种群遗传和个体性格决定等方面都具有重要影响。
近年来，基因组学研究表明，家蚕性染色体中的许多基因与性别决定、生殖调控等方面相关。
3.基因互作网络与群体行为基因互作网络是基因在细胞内相互作用的复杂网络结构，是昆虫行为等高级生命现象的遗传基础。
家蚕基因组研究表明，家蚕基因互作网络复杂且多样，其中一些基因同样与昆虫行为相关。
这暗示着家蚕基因组对于群体行为如繁殖、聚集等方面的调控作用。
4.基因组表观遗传与适应性基因组表观遗传是指基因组在细胞内对非编码DNA的化学修饰，包括乙酰化、甲基化、磷酸化等，从而影响基因的表达。
家蚕MLP基因的克隆及其结构分析
HEREDITAS (Beijing) 2007年9月，29(9): 1097―1102 ISSN 0253-9772 研究报告收稿日期: 2007−02−09; 修回日期: 2007−03−13基金项目: 国家自然科学基金项目(编号：30371087)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目资助(编号：2006AA10A119) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30371087) and the National Hi-Tech Research and Development Program (863) of China (No. 2006AA10A119)]作者简介: 刘岩(1976−), 女, 河南温县人, 助研, 博士, 研究方向：昆虫分子生物学。
E-mail: mayanly@ 通讯作者: 孟智启(1953−), 男, 浙江杭州人, 研究员, 研究方向：昆虫分子生物学。
E-mail: mengzq2001@DOI: 10.1360/yc-007-1097家蚕MLP 基因的克隆及其结构分析刘岩, 牛宝龙, 翁宏飚, 沈卫锋, 何丽华, 齐晓朋, 孟智启浙江省农业科学院蚕桑研究所, 杭州 310021摘要: 利用生物信息学的方法快速获得家蚕MLP (Muscle LIM protein, MLP)基因cDNA 电子序列, 经RT-PCR 生物验证正确, 登录GenBank (No. DQ311195)。
MLP 基因cDNA 长2 327 bp, ORF 全长1 485 bp, 编码产生494个氨基酸。
该MLP 基因组DNA 含有11个外显子, 10个内含子, 所有内含子/外显子边界都符合典型的GT/AG 剪切模式。
MLP 基因编码的蛋白富含Gly (14.4%), 分子量约为53.03 kDa, 等电点(PI )为8.29。
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HEREDITAS (Beijing) 2007年9月，29(9): 1097―1102 ISSN 0253-9772 研究报告收稿日期: 2007−02−09; 修回日期: 2007−03−13基金项目: 国家自然科学基金项目(编号：30371087)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目资助(编号：2006AA10A119) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30371087) and the National Hi-Tech Research and Development Program (863) of China (No. 2006AA10A119)]作者简介: 刘岩(1976−), 女, 河南温县人, 助研, 博士, 研究方向：昆虫分子生物学。
E-mail: mayanly@ 通讯作者: 孟智启(1953−), 男, 浙江杭州人, 研究员, 研究方向：昆虫分子生物学。
E-mail: mengzq2001@DOI: 10.1360/yc-007-1097家蚕MLP 基因的克隆及其结构分析刘岩, 牛宝龙, 翁宏飚, 沈卫锋, 何丽华, 齐晓朋, 孟智启浙江省农业科学院蚕桑研究所, 杭州 310021摘要: 利用生物信息学的方法快速获得家蚕MLP (Muscle LIM protein, MLP)基因cDNA 电子序列, 经RT-PCR 生物验证正确, 登录GenBank (No. DQ311195)。
MLP 基因cDNA 长2 327 bp, ORF 全长1 485 bp, 编码产生494个氨基酸。
该MLP 基因组DNA 含有11个外显子, 10个内含子, 所有内含子/外显子边界都符合典型的GT/AG 剪切模式。
MLP 基因编码的蛋白富含Gly (14.4%), 分子量约为53.03 kDa, 等电点(PI )为8.29。
通过BLAST 分析发现该基因编码的家蚕肌肉LIM 蛋白, 含有5个保守的LIM 结构域, 家蚕的另一种LIM 蛋白(AAR23823)含一个LIM 结构域, 两者可能是通过可变剪切产生; 后者可能通过竞争作用调节前者在肌细胞中的功能。
MLP 的克隆为进一步研究其体内功能奠定了基础。
关键词: 家蚕; MLP ; 表达序列标签(EST); LIM 结构域Cloning and structural analysis of MLP in the silkworm, Bombyx moriLIU Yan, NIU Bao-Long, WENG Hong-Biao, SHEN Wei-Feng, HE Li-Hua, QI Xiao-Peng, MENG Zhi-QiSericulture Research Institute , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou 310021, ChinaAbstract : The LIM domain is found in a wide variety of eukaryotic proteins that regulate gene expression and cell differ-entiation during development. Muscle LIM protein (MLP ) gene in Bombyx mori has been cloned by blasting its EST data-base and PCR test in present report. The resulting sequence covers 2 327 bp of cDNA (GenBank accession No. DQ311195). It has a complete open reading fragment and encodes a 494 amino acid protein. Genomic DNA sequence contains 11 exons and 10 introns, with intron splicing following the GT-AG rule. M.W. and PI of the predicted MLP in Bombyx mori are 53.03 kDa and 8.29 respectively. A single LIM domain linked to a glyscine-rich region is found in a previously deposited LIM protein (AAR23823) in Bombyx mori . MLP identified in this report encodes a protein with five tandem LIM-glycine modules. The two LIM proteins could be produced by alternative splicing and both are probably involved in muscle cell differentiation. This work provides foundation for further research on the in vivo function of MLP.Keywords: Bombyx mori ; MLP ; expression sequence tag (EST); LIM domainLIM 是3种转录因子线虫Lin-11、鼠Isl-1和线虫Mec-3名称首字母的缩写[1,2]。
LIM 家族蛋白都含有一个或多个保守的LIM 结构域。
LIM 结构域是由一段富含半胱氨酸的(CX2CX16-23HX2CX2CX2C- X16-23CX2-3(C/H/D))序列组成[3,4], 其中保守的半胱氨酸、组氨酸及天冬氨酸残基形成具有Zn 2＋结合1098 HEREDITAS(Beijing) 2007第29卷口袋的稳定的三级结构[4~7]。
借此结构域, LIM蛋白参与蛋白质与蛋白质之间的相互作用, 调节胚胎发育、细胞分化和细胞骨架形成等。
LIM家族蛋白可以分为两大类: 一种是与功能结构域相关的LIM蛋白, 包括LIM同型域蛋白(LIM homeodomain, LIM-HD)和LIM激酶(LIM kinase, LIM-K); 另一类就是只含有LIM结构域的蛋白质(LIM only protein, LIMO)。
CRP家族蛋白有两种形式的LIM结构域, 每个都含一富含甘氨酸的LIM区域[8,9], CRP家族蛋白参与脊椎动物肌肉细胞分化。
MLP(muscle LIM protein)属富含半胱氨酸蛋白(cysteine rich protein, CRP)家族, 参与肌肉的分化[10]。
Stronach等[11]在果蝇中鉴定出两种MLP蛋白, Mlp60A蛋白含一个富含甘氨酸的LIM结构域, Mlp84B蛋白含有5个富含甘氨酸的LIM 模块。
Hwang等[12]克隆到一种长622 bp的家蚕LIM 同源蛋白的cDNA, 它编码产生94个氨基酸的家蚕LIM同源蛋白, 该蛋白含有1个甘氨酸丰富的LIM结构域。
除此之外, 人们对家蚕LIM相关基因的了解仍很有限。
为探究家蚕基因组是否含有5个LIM结构域模块的Muscle LIM protein, 本文以果蝇的MLP基因序列为信息模板, 对家蚕EST库进行同源比对, 经过反复的延伸和比对, 获得了家蚕MLP基因的全长cDNA序列; 经生物验证并对MLP基因结构进行了分析。
1材料和方法1.1试剂与菌种DNA连接试剂盒购自TaKaRa(大连)公司; 质粒提取和胶回收试剂盒购自上海鼎国公司; RNA提取试剂盒购自V-gene; DNA Marker、Taq DNA Ploymerase、dNTP Mix购自TaKaRa(大连) 公司; RevertAid TM M-MuLV Reverse Transcriptase和RNase抑制剂购自Fermentas公司; 宿主菌E. coli TG1由本实验室保存。
1.2供试材料蚕由浙江省农科院蚕桑所蚕种室提供, 品种为P50。
1.3 MLP基因的快速电子拼接电子克隆根据物种间同源基因的核酸序列相对保守并有一定同源性的特点, 以果蝇Mlp84B同源基因的cDNA序列为模板, 用BLAST(http://www.ncbi. /BLAST/)程序检索GenBank中的家蚕EST公共序列, 把检出序列拼接成contig后, 以此contig为被检序列再次进行Blast, 重复上述操作, 直至所有检出的重叠EST或连续体序列不能继续延伸[13,14]。
最后对获得的电子克隆基因(家蚕MLP)的特性进行初步分析。
1.4 MLP拼接基因的生物验证1.4.1 引物设计根据电子克隆所得的家蚕MLP基因序列, 利用Primer premier(version 5.0)软件设计引物P1~P4 (表1), 其中引物P1/P2用于扩增和P3/P4引物对分别用于扩增MLP基因的上段和下段。
1.4.2 家蚕组织总RNA的抽提取蚕蛹(P50)数只, 置入研钵内; 迅速加入液氮并研成粉末, 然后加入1 mL Trizol, 用研钵棒混匀后移入1.5 mL离心管中; 4℃, 12 000×g离心5 min, 将上清移入一新的1.5 mL离心管中; 加入200 µL氯仿, 涡旋器上振荡混匀30 s, 室温放置2～3 min, 4℃, 12 000×g离心15 min; 将上清移至一新的1.5 mL离心管中, 加入0. 0.5 mL异丙醇, 室温放置10 min, 4℃, 12 000×g离心10 min; 移去上清液后加入1 mL 75％乙醇, 涡旋器上振荡后4℃, 7 500×g离心5 min后, 弃去上清; 待稍干后, 加入适量RNase- free HB2O溶解备用。
1.4.3 RT-PCR扩增家蚕MLP基因RT参照Fermentas公司试剂操作说明书步骤进行。
表1实验所用引物Table 1 Primers used for PCR引物名称Primer引物序列Sequences(5′→3′)引物长度Length of rimer (bp)产物名称Product产物大小Length of product (bp)P1 CAATGCCTTTCAAACCCGCTGATA 24P2 GCAGTATCAATCACGGTGGTCTTAG 25MLP-up 628 P3 CTAAGACCACCGTGATTGATACTGC 25P4 AAACTAAGGGCCCAGACACA 20MLP-down 1,164第9期刘岩等: 家蚕MLP基因的克隆及其结构分析 1099以实验家蚕的cDNA为模板, 用设计的引物扩增特异性片段。