干细胞, 组织工程与再生医学

・述　评・
干细胞、组织工程与再生医学
杨志明
中图分类号:R318 文献标识码:C
在上世纪80年代提出的组织工程概念、90年代发现成体干细胞的可塑性之后,在研究中逐渐认识到细胞、支架材料、生物活性因子、干细胞在促进组织、器官愈合与再生治疗中的重要作用。

因此,Suh等[1]认为组织修复、组织工程与再生医学有不可分割的相关性。

Go ldfarb[2]认为组织工程、干细胞和克隆技术是再生医学发展的良机;H i pp等[3]提出组织工程、干细胞、克隆技术和单性生殖是一种新的治疗模式。

本期集中刊出了22篇干细胞和组织工程相关研究的论文,以一个侧面反映了我国干细胞、组织工程研究在发展再生医学中所作出的贡献。

1　细胞治疗
从胚胎或成人组织(器官)分离培养功能细胞在技术上已经十分成熟,制约临床应用的主要因素是大规模扩增技术,现已基本得到解决。

如从患者活检得到的皮肤或从包皮切除术中得到的皮肤分离培养成纤维细胞和表皮细胞,均可达到相当大的扩增量,已经可在体外培养成为单层表皮层用于皮肤的修复。

Grande (1989)首先用兔的自体关节软骨细胞移植修复关节软骨缺损,组织学观察证明有82%的软骨修复。

1997年美国FDA批准用于临床。

通过关节镜技术操作,创伤小,并发症少。

随访观察发现74%为透明软骨,组织学显示了接近正常的关节软骨结构,可用于15c m2全层软骨缺损的修复。

成体干细胞的研究近几年发展很快,已有不少临床应用的报道。

从脐带血中分离造血干细胞治疗血液病已取得成功。

从脑组织、脊髓组织中分离出的神经干细胞在动物实验中已证实具有促进神经再生能力。

从嗅鞘中分离出的嗅鞘细胞能生长出触突,穿过瘢痕组织生长,具有良好的促进中枢神经再生并重新建立传导功能的能力。

肌肉干细胞局部注射治疗肌营养不良
作者单位:四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室・干细胞与组织工程研究室
通讯作者:杨志明,教授,博士导师,研究方向:组织工程,E2m ail: o rthop@ 症;心肌缺血已有临床应用报道;自体骨髓间充质干细胞(m arrow m esenchym al stem cells,M SC s)通过局部心肌内注射、冠状动脉注射促进心肌再生与血管化已有大量研究及部分临床应用。

M SC s促进缺血肢体重建血循环在临床上已获得成功[4,5]。

无论是组织细胞或干细胞治疗,已经显示了良好的组织再生能力,但要使细胞治疗达到更好的临床效果,或完全再生一个新的组织或器官还有很大困难,主要存在以下问题:①细胞获取后的大量扩增、干细胞的定向诱导分化常需添加外源性物质,其安全性研究还停留在细胞水平。

是否会引起基因水平的改变尚未引起足够的重视。

②无论是组织细胞或干细胞,不管通过什么途径注入到体内,需要与受体组织细胞黏附、融合、发挥功能,但注入细胞与受体组织融合率极低,在心肌大约为7%,而且注入心肌的细胞能否转化为心肌细胞至今尚在争论中,因此,提高细胞治疗的效率是尚待研究的问题;如果采用静脉或动脉途径注射细胞,还需研究其靶向性。

③同种异体细胞移植具有来源广泛、获得容易及可以库存备用进行群体化治疗的优点,但必须克服其免疫排斥反应。

2　生物活性材料
生物材料促进组织愈合与再生的研究已有很长的历史,近10年来发现了很多具有引导或诱导组织再生的材料。

Chester和A n thony(2004)将组织工程材料分为3类:①天然衍生材料,如胶原、几丁质等;②脱细胞基质,如脱细胞膀胱黏膜下层、小肠黏膜下层、脱细胞骨等;③合成高分子材料(syn theses po lym er m aterials),如PLA、PGA、PL GA等。

胶原是人体细胞外基质的主要成分,是大量存在于多种组织的结构蛋白,约占总蛋白的25%,目前发现的胶原已有10余种类型,各种不同类型的胶原在组织中的分布、免疫原性及遗传基因也各不相同。

从牛、猪、人的组织中提取的胶原在体内有良好的生物认知能力。

可由细胞中的溶酶体酶降解。

其降解速度可用控制其密度、交链方式、时间及孔隙率等来调节。

近来
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中国修复重建外科杂志2006年第20卷第2期
的研究证明,胶原具有良好的细胞黏附性、细胞趋化性及促进血管化能力,因此具有促进多种组织愈合及再生能力,也可单独或与其它材料复合作为细胞载体用于组织构建。

壳聚糖是从动物的甲、壳、骨中提取的多糖。

研究表明,具有促进骨和软骨再生、神经再生等多种生物活性。

单独应用或与胶原复合,作为组织工程皮肤的支架材料,已有产品进入临床应用。

脱细胞、去抗原处理的同种异体或异种骨,或经冷冻处理的同种异体骨已有长期临床应用历史[8],大量研究及临床应用证明,在骨组织内有引导和诱导骨再生作用。

作为支架材料构建组织工程骨已有数10例临床应用成功的报道。

脱细胞、去抗原处理的猪小肠黏膜下层(s m all in testinal subm uco sa,S IS)具有低免疫性,抗微生物活性和一定的生物力学强度,含成纤维细胞生长因子2(fib rob last grow th facto r2,FGF22)、转化生长因子Β(tran sfo rm ing grow th facto rΒ,T GF2Β)、血管内皮细胞生长因子(vascu lar endo theliar cell grow th facto r,V EGF)等多种生物活性因子,可降解[6],有良好的组织相容性以及引导或诱导组织再生等特点,近几年已成为组织再生和组织工程研究的良好支架材料,在组织工程皮肤、肌性管道、肌腱和软骨等研究与应用上表现出了很大优势[7,8]。

合成高分子材料如PLA、PGA和PL GA,以及以钙、磷为主的陶瓷材料、纳米材料已广泛用于组织工程研究,单独或与其它材料复合作为细胞载体,显示了良好的组织相容性及引导组织再生能力,在结构组织的工程化构建中显示了一定的优势。

生物活性材料无论作为构建组织工程植入物的支架或单独应用,其降解速率与组织再生速率的匹配至关重要。

Yannas等[9]提出一个理想的公式:t b t h=1,t b 为材料降解时间,t h为新组织形成所需的时间。

若比值<1,表明材料降解太快,组织再生不足,修复能力差;若比值>1,表明材料降解太慢,会妨碍新组织形成。

如何使材料的降解与组织再生速率达到平衡是今后组织工程与再生医学的研究重点之一。

3　生物活性因子
生物活性因子在组织愈合、再生中的作用已有大量研究。

如骨形成蛋白(bone m o rp hogenetic p ro tein, BM P)已有提纯的和基因工程生产的产品用于临床,其成骨作用是确定的。

但随着BM P的广泛应用,逐渐发现了一些并发症。

BM P的成骨作用主要在植入骨局部发生,但植入的BM P可被吸收入血而引发全身反应,如在韧带中发现了成骨现象[10];局部成骨过度而呈现出肿瘤化倾向;BM P的增加能加速动脉钙化的进程。

其主要问题是BM P在不同个体的敏感性难以预测。

将BM P基因转染细胞,再把细胞植入体内促进成骨是确定的[11]。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fib rob last grow th facto r,bFGF)早在90年代就已进入临床应用[12],具有明显的促进血管化及组织再生作用。

在临床应用中发现,一些分泌物较多的伤口,bFGF的促生长作用并不十分明显,可能与伤口中的炎性细胞或组织液中的蛋白溶解酶使bFGF的活性降低,致使促伤口愈合作用下降有关。

在组织愈合与再生中血管再生极为重要,已有不少研究证实V EGF、血小板源性生长因子、bFGF均有促血管生成作用。

将V EGF基因转染细胞,再植入体内,也发现有促血管生成作用。

但目前尚不完全清楚其在体内应用的最佳剂量,并有血管过度生长之虑。

R issanen等[13]和R u tanen等[14]研究发现,高剂量的V EGF能使组织产生水肿。

由于外源性生长因子应用的不确定因素较多,因此有不少学者主张促进细胞自分泌能力来增加临床应用的安全性,但目前仍不能确定增强细胞自分泌能力导入功能基因的方法是否安全可靠,尚需更深入的基础研究。

解决外源性生长因子安全性问题的另一条途径是将临床上已经常规应用的某些药物深入研究其类生长因子作用,如四环素在一定剂量下有明显的促骨生长作用[15,16],苯妥因的促上皮生长作用等[17]。

4　细胞、支架材料复合体的临床应用
细胞、支架材料复合体是将细胞、支架材料、生物活性因子经过组装后形成。

经过20多年的研究,已有较多的临床应用,显示了良好的促进组织再生与愈合能力。

上世纪90年代,V acan ti用软骨细胞与PGA支架复合培养构建的组织工程软骨修复Po land综合征的胸廓畸形获得成功,再生的肋软骨起到正常胸廓支架的保护作用,使患儿心肺功能得到显著改善。

1997年组织工程皮肤已被FDA批准进入市场。

国内由金岩研究的组织工程皮肤已完成了临床试验,显示了良好的皮肤修复效果。

组织工程骨在2000年就有临床应用报道。

Q uarto等[18]用自体M SC s与羟基磷灰石复合构建的组织工程骨修复3例长骨缺损,均达到完全的骨再生;V acan ti等[19]用自体桡骨骨膜成骨细胞与珊瑚构建组织工程骨修复1例指骨缺损,恢复了部分手指捏持功能;杨志明(2000)先后用同种异体骨膜成骨细胞或自体M SC s与脱细胞骨基质支架材料复合,构建组织工程骨修复不同部位、不同年龄的骨缺损、骨不
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愈合,均获得了良好的骨再生[20,21]。

沈兵等[22]在将组织工程骨和自体髂骨移植临床疗效的对比研究中发现,组织工程骨植骨具有自体骨移植的全部优点,并减少了自体骨植骨的并发症。

德国学者尝试了自体M SC s与脱细胞骨基质材料复合构建骨、软骨复合物,修复1例掌指关节,1例胫骨下端骨软骨复合缺损,早期效果良好。

杨志明(2001)报道了同种异体肌腱细胞与碳纤维+PGA复合构建的组织工程肌腱修复喙锁韧带损伤,3～6个月后取微量组织,经STR检测,发现非自体等位基因存在,表明植入的同种异体细胞存活,并发挥组织修复和再生功能[23]。

2005年又报道了用类似的技术修复7例5～7c m长跟腱缺损,经B超及M R I检查,证实获得了跟腱的完全再生,术后6～8周可恢复接近正常的步态[24]。

尽管已有不少细胞与支架材料复合构建的组织工程植入物成功地进行了临床应用,但细胞与支架材料的相互作用及可能产生的影响尚研究很少,尤其在某些功能基因的表达及遗传物质的改变方面尚需深入研究[25,26]。

组织工程产品要实现产业化,还需研究包装、贮存、运输及复苏技术[27,28]。

5　展望
在10多年的研究及近几年的临床实践中,已经证明干细胞、组织工程植入物在组织器官的愈合、再生中发挥了重要作用。

虽然有些科学问题尚待阐明,有些技术难题尚待攻克,但其发展趋势必然会为病损组织器官的愈合、再生创造出更多、更新、更实用的治疗方法,在挽救患者生命、减少伤残及最大限度地恢复功能方面发挥巨大作用。

因此有人预言,组织工程的出现是“一场意义深远的医学革命”;对成体干细胞可塑性的认识及人胚胎干细胞的建系及定向分化,为细胞治疗奠定了基础,使医学研究进入了“再生医学的新时代”。

6　参考文献
1Suh H.T issue resto rati on,tissue engineering and regenerative m edicine.YonseiM ed J,2000,41(6):6812684.
2Go ldfarb DA.T issue engineering stem cells,and cloning: oppo rtunities fo r regenerative m edicine.J U ro l,2005,173(4):
1431.
3H i pp J,A tala A.T issue engineering,stem cells,cloning,and parthenogenesis:new paradigm s fo r therapy.J Exp C lin A ssist
R ep rod,2004,1(1):3.
4吴雁南,杨晓风,王红梅,等.干细胞治疗下肢缺血性疾病疗效观察.中国修复重建外科杂志,2005,19(12):101921021.
5郭连瑞,谷涌泉,张建军.自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足13例报告.中华糖尿病杂志,2004,12(5):3132316.
6罗静聪,杨志明.小肠黏膜下层的制备及其特性研究进展.中国修复重建外科杂志,2003,17(5):4252428.
7Badylak SF,K ropp B,M cPherson T,et a l.Sm all intesti onal subm uco sa:a rap idly reso rbed bi o scaffo ld fo r augm entati on cystop lasty in a dog model.T issue Eng,1998,4(4):3792387.
8R eco rd RD,H illegonds D,Si m mons C,et a l.In vivo degradati on of 14C2labeled s m all intestinal subm uco sa(S IS)w hen used fo r urinary bladder repair.B i om aterials,2001,22(19):265322659.
9Yannas I V.Studies on the bi o logical activity of the derm al regenerati on temp late.W ound R epair R egen,1998,6(6):5182523. 10T anaka H,N agai E,M urata H,et al.Invo lvem ent of bone mo rphogenic p ro tein22(BM P22)in the patho logical o ssificati on p rocess of the sp inal ligam ent.R heum ato logy(O xfo rd),2001,40
(10):116321168.
11李建军,王文军,景元海,等.重组pc DNA3.12hBM P22转染人骨髓基质干细胞对增殖及血管内皮生长因子表达的影响.中国修复重建外科杂志,2004,18(2):1002103.
12付小兵,沈祖尧,陈玉林,等.碱性成纤维细胞生长因子与创面修复——1024例多种心对照临床实验结果.中国修复重建外科杂志, 1998,12(4):2092301.
13R issanen T T,M arkkanen JE,A rvek,et a l.F ibroblast grow th facto r4induces vascular perm eability,angi ogenesis and arteri ogenesis in a rabbit h ind li m b ischem ical model.FA SEB J, 2003,17(1):1002102.
14R utanen J,R issanen T T,M arkkanen JE,et al.A denoviral catheter2m ediated intram yocardial gene transfer using the m ature fo rm of vascular endo thelial grow th facto r2D induces trans m ural angi ogenesis in po rcine heart.C irculati on,2004,109(8):10292 1035.
15陈旭,杨志明,谢慧琪,等.WO21对成骨细胞的生物学效应研究.
中国修复重建外科杂志,2005,19(10):8222825.
16梁军,杨志明,李秀群,等.WO21生物衍生组织工程骨支架材料的制备及性能研究.中国修复重建外科杂志,2005,19(6):4642467. 17岑英,俞宝木梁,任森林.苯妥英外用对兔创面愈合的实验研究.中国修复重建外科杂志,1994,8(1):31233.
18Q uarto R,M astrogiacomo M,Cancedda R,et a l.R epair of large bone defects w ith the use of auto logous bone m arrow strom al cells.N Eng J M ed,2001,334(5):3852386.
19V acanti CA,Bonassar L J,V acanti M P,et al.R ep lacem ent of an avulsed phalanx w ith tissue engineered bone.N Engl J M ed,2001, 344(20):151121514.
20杨志明,赵雍凡,谢慧琪,等.组织工程肋骨移植修复胸壁巨大缺损.中国修复重建外科杂志,2000,14(6):3652368.
21杨志明,黄富国,秦廷武,等.生物衍生组织工程骨的初步临床应用.中国修复重建外科杂志,2002,16(5):3112312.
22沈兵,谢富林,谢清芳,等.自体髂骨移植与组织工程骨的临床应用对比研究.中国修复重建外科杂志,2002,16(6):4292431.
23杨志明,谢慧琪,项舟,等.组织工程化人工肌腱修复喙缘韧带损伤及其体内检测.中华骨科杂志,2002,21(2):69272.
24李箭,杨志明,谢慧琪,等.组织工程肌腱修复陈旧性跟腱断裂伴缺损的疗效观察.中国修复重建外科杂志,2005,19(8)6392641.
25祁杰,杨志明,谢慧琪,等.成骨细胞与生物衍生支架材料相互作用的基因表达研究.中国修复重建外科杂志,2005,19(7):2632268. 26奚廷斐,杨晓芳.生物材料生物相容性的分子水平评估研究.生物医学工程学杂志,1999,16(Supp l):63266.
27罗晓中,杨志明,邓力,等.低温保存组织工程骨修复骨缺损的实验研究.中国修复重建外科杂志,2005,19(7):5692573.
28王欣,华泽钊,杨光辉,等.DM SO浓度及降解速率对组织工程化真皮超低温保存效果的影响.细胞生物学杂志,2003,25(5):3092 312.
(收稿:2005212208)
(本文编辑:俞军)
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