在活细胞线粒体内通过空间限制酶标记映射的蛋白质组学

在活细胞线粒体内经空间限制性酶标记的蛋白质组学图谱

显微镜和质谱是两种互补的技术：前者在活细胞内提供时间与空间上的信息，但是这种技术在某一时间只能观察到极少数的重组蛋白。然而，后者能探测到成千上万的内源性蛋白，不过这种技术仅仅用于被溶解的细胞样品中。在这，我们将介绍一种技术。这种技术结合了上述两种技术的优势，为活细胞内的内源性蛋白的蛋白质图谱提供了空间与时间上的解决方案。我们的方法依赖于基因定位的过氧化物酶，这些酶与邻近的蛋白质进行生物素化，随后被纯化和质谱鉴定。我们用这种方法识别了人类线粒体基质中495种蛋白，包括31种以前认为与线粒体无关的蛋白质。这种标记方法很特殊，而且能够很好地辨别位于线粒体基质、线粒体膜间腔及线粒体内膜上的内膜蛋白。一些蛋白以前被认为存在于线粒体膜间腔或者线粒体外膜上，包括原卟啉原氧化酶，经过我们的蛋白质组学数据分析，它被重新认定存在于线粒体基质中，并且得到了电子显微镜证实。在活细胞中的过氧化物酶介导的蛋白质图谱的特异性，与它的容易使用性相互结合，为生物学家认识活细胞的分子组成提供了强有力的工具。

为了避免蛋白质组学在传统质谱技术中存在细胞器纯化相关的一系列材料损耗及一定限制的特殊性，我们寻求发展一种新方法。我们的方法包括标记连接像生物素这样的化学手柄的蛋白质，同时细胞仍活着，全部的膜、复合体及其空间关系都未被破坏。因此，在活细胞内，我们需要有一个基因定位的标记酶，这个酶能共价标记它的相邻物，且此酶与蛋白质距离不远。一种候选酶是混杂的生物素连接酶，但这种酶的标记速度极其缓慢（需要24小时）。通过一种半衰期只有几分钟的生物素-腺苷酸酯，可以使这种被提出的机制得以继续，但生物素-腺苷酸酯标记半径很大。另一种可能的候选酶是催化氮烯产生的辣根过氧化物酶，但是我们无法检测到这种标记，而且在哺乳动物的胞质溶胶中，辣根过氧化物酶无活性。

最近，我们产生了一种工程抗坏血酸过氧化物酶，让它作为电子显微镜的一种遗传标记。不像辣根过氧化物酶，工程抗坏血酸过氧化物酶在所有活细胞内都是有活性的。另外，工程抗坏血酸过氧化物酶不仅能催化用于电子显微镜对照的显色底物二氨基联苯胺的过氧化氢-依赖性聚合物，而且能氧化众多苯酚衍生物，从而产生苯酚氧自由基。这种自由基的寿命十分短暂（<1毫秒），它们的标记半径很小（<20纳米），而且它们能和酪氨酸、色氨酸、组氨酸及半胱氨酸等富电子氨基酸进行共价反应，这种化学反应构成了酪胺信号放大效应的基础，但它还并没在活细胞中得以应用。

为了检验工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）能否用于蛋白质组学的标记中，我们把工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）靶定于人类胚胎肾细胞（HEK）的线粒体基质中，在细胞培养基中通过加入生物素-苯酚和1毫摩尔的过氧化氢开始标记，最终通过细胞固定或裂解一分钟后结束标记。通过共聚焦显微镜成像或者随机光学重组显微镜观察，我们发现生物素化的蛋白质与线粒体- APEX复合结构之间存在紧紧的重叠部分。对细胞裂解物进行链霉素亲和酶印迹分析，表明许多内源性蛋白以APEX-和过氧化氢-依赖性的方式进行生物素化结合。

为了测试这种方法的一般性，我们也分析了在不同细胞区域内进行靶定工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）的其他构建复合体结构。在链霉素亲和酶印迹分析中，面向细胞质的7种不同的工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）融合体存在独特的“指纹”，这表明工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）仅仅和一小部分胞质蛋白进行了生物素化，可能这些工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）就在那些胞质蛋白附近。为了对工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）的这种小分子特性进行特征性分析，我们进行了另外的苯酚氧自由基的膜透性实验，以及这些共价结合物与氨基酸在体外形成反应实验（请参照补充材料和方法）

图一：在活细胞内标记线粒体基质蛋白质组。

A:标记计划。将工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）通过融合作用，连接到一个24-氨基酸的目标肽上，从而靶定于线粒体基质中。在活细胞内，通过加入生物素化的苯酚和过氧化氢的，开始标记一分钟。随后进行细胞裂解。生物素化的蛋白质通过与被链霉亲和素包裹的珠子回收，洗脱，在凝胶上分离，并由质谱鉴定。过氧化物酶生成的苯酚氧自由基的寿命很短，而且不能透过膜。因此，它只能与相邻物质进行共价结合，而不能与有一定距离的内源性蛋白结合。B，生物素。

B:（B）按照（A）过程，在标记人类胚胎肾细胞表达线粒体-工程抗坏血酸过氧化物酶（mito-APEX）后，生物素化的蛋白（进行中性亲和素染色）进行共焦荧光成像。我们通过有目的的性地去除生物素-苯酚或过氧化氢对实验进行控制。DIC，微分干涉对比。

C:（C）按照（B）过程，超分辨率（STORM）成像系统显示：链霉亲和素和工程抗坏血酸过氧化物酶（AF405/AF647）被定位在U2OS细胞的22纳米分辨率的位置上。样品在（B）中被反应出来。

D:生物素化标记线粒体基质蛋白的凝胶电泳分析的前（泳道1-3）和后（泳道4-6）链霉素亲和珠的富集。样品在（B）中被标记。生物素-苯酚和过氧化氢是酶作用物。哺乳动物细胞有4个内源性生物素化的蛋白，其中通过链霉亲和素电泳后，3个蛋白在阴性泳道（2和3）中被观察到。

E：电子显微镜下的人类胚胎肾细胞表达线粒体-工程抗坏血酸过氧化物酶（mito-APEX）。过氧化氢和二氨基联苯胺的固定细胞作为电子显微镜的对照组。工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）能催化二氨基联苯胺的聚合物变成一个特定的产物，随后用电子致密的OsO4进行染色。在线粒体基质中，明暗对比明显，此物质并非存在于线粒体膜间隙。

•生物素连接酶：能活化生物素形成生物素酰-5’-腺苷酸，将生物素特异地转移到生物素

受体蛋白（如AviTag融合蛋白）上，使蛋白生物素化。

•二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹（Western Blot,WB)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 、免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC)、斑点印迹(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等的染色和显色反应。

•酪胺信号放大技术（tyramide signal amplification,TSA）是上世纪90年代在传统酶促放

大理论基础上发展起来一种新的信号放大技术。其基本原理如下：在过氧化氢存在时，一些酶如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等可以催化一种酪胺的底物为一种非常活跃的短寿命中间体；在短时间内，中间体可以共价结合到周围蛋白的富电子表面形成酪胺化复合物，大量富集成以酶为中心的类似“岛”或者“树”状的聚集团（如图）；可以在酪胺上标记荧光或者其它标记物如生物素用于检测。

•酪胺信号放大技术不是检测技术，只是放大系统，它可以提高ELISA、IHC和ISH等的灵敏度10-100倍。另外，TSA作为扩大信号其理论本身不会增加非特异性信号，而不是像原位PCR那样扩增检测目标，所以不会造成检测偏差和假阳性。

•但是，若靶标本底生物素水平较高或者抗体交叉反应比较高，同样实验背景会成倍地放大。TSA导致新问题需要采用产生更低背景的实验材料或方法，来降低检测技术的非特异性背景，为TSA放大系统提供足够的空间。如在分子杂交中使用DNP标记的TSA Plus，由于DNP是生物体内罕见的分子，检测背景很低，性噪比就高。

•TSA应用范围广泛，ELISA, 免疫组化（IHC），原位杂交（ISH），芯片检测和其它任何使用HRP或AP的检测方法中都可以应用，它的放大效应可以使ELISA双抗体夹心法检测样品浓度从皮克级（10－12）别提高到飞克级别（10－15）。

•TSA应用在传统ELISA上开发出超敏ELISA，这使检测人体内飞克级别的细胞因子成为可能，有利地促进科学深入研究人体内微量蛋白的作用。超敏ELISA还可以间接节省客户研究所用的宝贵样品，客户在有限的样本中检测更多蛋白指标。

•辣根过氧化物酶链酶亲和素结合物可以用于生物素标记的抗体、核酸、蛋白或其它生物素标记分子的检测。具体用途包括Western blot、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、斑点杂交、化学发光检测等。HRP StreptavidinConjugate用高纯度的链酶亲和素和超纯的辣根过氧化物酶交联而成，确保产生最低的本底和最高的灵敏度。

链酶亲和素Streptavidin的分子量为60kD，可以高度特异性地和生物素结合。链酶亲和素是一个4聚体蛋白，可以同时结合4个生物素分子。链霉亲和素，从Streptomyces adidinii 中纯化获得，和鸡蛋清来源的Avidin(亲和素)在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性。和Avidin不同的是，Streptavidin是一种非糖基化蛋白，并且基本不带电荷。Avidin的pI=～10.5，在中性PH条件下呈碱性。由于Streptavidin和Avidin相比在中性条件下不带电荷，因此Streptavidin的非特异性结合比Avidin低很多，这样检测时的非特异性背景就低很多。因此目前在生物素检测时通常使用Streptavidin替代Avidin。

辣根过氧化物酶即horseradish peroxidase(HRP)，可以在Western、EMSA、Southern或