LCMS液质联用仪原理及基础知识介绍

LC/MS原理及基础知识介绍
沃特斯中国有限公司应用部
MS的历史
1910年 1917年 1918年
1943年 1953年 1955年 1960’s 60’s-70’s 70’s-80’s 1979年 1982年 1984年 1988年
…...
世界上第一台现代意义质谱仪在英国剑桥Cavendish实验室出现 电喷雾(Electrospray) 物理现象被发现 (并非为了 MS) 世界上第一台实际意义质谱仪在美国芝加哥大学实验室出现 (扇型磁场MS) 世界上第一台商业质谱仪 四极杆质量分析器质谱仪 飞行时间质量分析器质谱仪 开发GC/MS 大气压电离(APcI)源被发现(但并未被广泛应用) 开始广泛研究 LC/MS 传送带式 LC/MS 接口成为商业产品 离子束LC/MS接口出现 第一台电喷雾 MS仪宣告诞生 电喷雾离子源 MS 首次应用于蛋白质的分析
API电离源 (ESI+) 电离模式：软电离产生 [M+H]+ 准分子离子峰
10 0
%
0 12 0
[M +H]+ 163
O
H3C S H3C
[M +N a]+
18 5
NO
CH3
灭多虫
MW 162
[M +K]+
14 0
16 0
18 0
20 0
22 0
24 0
26 0
28 0
Waters China Ltd.
六极杆离子桥
4,000
2,000
0 100
[M+H]+
150
200
250
300
m/z
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多种CID方式： 一次进样得到全部质谱信息
C4H9-
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四极杆质量分析器
Resonant Ion Nonresonant Ion
Detector
Source
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Integrity® 质谱检测器
电子轰击电离源 (EI)
灯丝
70 eV
四极杆质量分析器
离子源
225 C
+++
++ + + +
++
+ +
+ +
+
++ +
++
-
--
第二级 0.1 Torr 第一级 5 Torr
热束®接口
(动量分离器)
FROM HPLC
涡轮 分子泵
离子检测器
+--++++++--+++++-
++
+ +-+-++-
+ 3) 离子从液滴表面 蒸发出来
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什么是APCI？
毛细管
APCI 电离方式产生离子
样品 M
1) 电离产生起决定作用的溶剂离子
x
M
x
xH+ M x
x
xH+
M
xx
3) 离子去簇后被传输
到质谱的质量分析器
x
XH+
MH+
xx
xH+
MH+
xx
放电针
2) 样品分子与反应离子发生反应， 形成离子簇
X = 溶剂分子，比如H2O, NH3 等等
一般适合分析挥发性化合物，也常分析从中性到极性的化合物 纯气相离子化过程，只产生极少的添加离子 谱图简单 流速范围大，从 0.2 到 2.0mL/min ，而不用分流
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dc and Rf voltages
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LC/MS联用中的转变过程
液相色谱的现实情况: 从高效液相色谱流出的化合物存在 于大气压条件下的溶液之中 质谱的现实情况: 在高真空工作条件下的质谱仅接受气相 的离子
因此液质联用的接口必须完成:
去除溶剂 保留样品 电离化合物
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191
O
91
79
107
M+ - 162
241
201 123 145
175
M+ -36
OH
366
341
M+ -18
384
M+
OH
402
OH
H
Waters Integrity LC/MS System, Pfizer, 1996
大气压电离技术
电喷雾电离(Electrospray Ionization - ESI) 大气压化学电离
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LC/MS中的液相色谱
High Performance Liquid Chromatography-高效液相色谱
液质联用的前提和基础=进样+分离 根据化合物的化学特性分离样品(比如极性化合物， 非极性化合物，酸性化合物，碱性化合物等等)
•分离技术 •分离效率高 •流动相参与分离 •连续流出，峰宽有限 •有时需要使用缓冲盐提高分离度 •高压环境工作(> 1000 psi)
Turbo Mechanical
Electron Multiplier Photomultiplier Microchannel Plate
•样品的引入模式 •溶剂的去除或抽
真空方式
•质子化模式
•离子分离模式 •质量分析器 •离子检测 •数据的采集及处理
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液质联用系统的常见部件
离子化
质质子量过过滤滤器器
离子检测器
数据采集及控制
离子源
分析器
检测器
数据处理
接口
样品引入
HPLC 色谱分离
质谱图
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从LC 到 MS 的转变 物态转变: 液态 - 气态 带电状态: “中性” - 离子 真空变化: 760 torr - 10-5 to 10-8 torr
CONH2
OH
200
225
250
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取样锥孔 30V
CID产生的过程
Analysis of Sulfamethazine by Electrospray
萃取锥孔
Intensity
NH 2
O
N
S
NH
N O
12,000 12,000
10,000
10,000 8,000
6,000
Alliance ZQ LC/MS 系统
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Waters ZQ...
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同一样品的质谱图可能并不一样！
Sample Description
SALICYLAMIDE 1 (0.067) Cn (Cen,2, 80.00, Ar)
100
138.0
前级泵
前级泵
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EI 的宝贵遗产
191
91
79
107
123 135
175 145
M+ - 162
241
201
M+ -36
366
M+
341
M+ -18
384 402
Gamabufotalin (III)
O
High Res Mass Spec, Brown, Kamano, Pettit, Org. Mass Spec., 1972
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LC/MS中的质谱
Mass Spectrometry-质谱
质量是物质固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱 分析物被转化为气相离子而被分析 这些离子按其质荷比 (m/z)被分离而被检测 质谱图即是相关的离子流对m/z的图
•灵敏度高 •定性/定量本领高 •脉冲扫描采集数据 •高真空环境工作 •溶剂参与反应
8,000 4,000
Sulfamethazine
Parent Ion Region
MW 278
Positive ion mode, ESI, 2 ul/min, 50% MeOH:49% H2O:1% HOAc
2,000
6,000
277 278 279 280 281 282
m/z
4,000
CH 3
LC/MS 面临的挑战
LC/MS 接口必须使流动的液流达到 MS 可接 受的压力 (10-5 - 10-6 torr) 同时以极小的谱带 展宽尽可能多地输送样品到MS
进样方式比较
毛细管 GC, 1mL/min (气体) 微柱 LC, 10 µL/min
对真空泵的要求 *
(liters/sec)
~400 ~5,000
Scan ES+ 1.19e8
%
0
85.2 88.1 90.1 93.9 95.8 100.2102.0
80 85 90 95 100 105
110.2 114.0 110 115
121.2 123.9 120 125
133.0 137.0 130 135
138.9 143.0
140 145
149.3 m/z
OH
OH H
OH
TIC 色谱
保留时间
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质谱的种类及相关联用技术
GC LC CE Flow Inj Probe
PB/EI ESI APCI TSP FAB MALDI
Quadrupole Magnetic Sector Time of Flight Ion Trap FT-MS
O
N
S
NH
N
O 186 Sulfamethazine
CH 3 CH 3
10,000 8,000 6,000
Fragment Ion Region
MW 186
C6H8N3O2S
4,000
2,000
183 184 185 186 187 188
m/z
Intensity
碰撞诱导解离使 碎片离子在进入 质谱前就已经产生
CH 3
[M+H]+
六极杆－离子桥 2,000
0
100
150
200
250
300
m/z
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优异的CID技术（可编程）
Analysis of Sulfamethazine by Electrospray
取样锥孔 70V
萃取锥孔
156 92
NH 2
10,000 8,000 6,000
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LC/MS 数据形式
91 79 107
191
M -162
241
201 123 145Leabharlann 175100150
TIC
200
250
m/z
M -79 323
M -36
366
M+
M -18 402
341
384
300
350
G a m a b u fo ta lin
( III)
O
O
150
Figure 1. Wiley Library Reference Spectrum of Salicylamide
92
120
137
39 16 28
65 80
25
50
75
100
125
150
175
2-Hydroxybenzamide MW: 137 Form: C7 H7 NO2 CAS Reg No: 65-45-2
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热束接口原理：喷雾作用和动量分离
Stage 2, 压力为1.5 Torr 并且 剩余的1 0%溶剂和氦气被去 除。脱离溶剂的样品离子被
动量分离器部加分速)到达S并质t且ag谱e9离01%,子压的源力溶(高为剂真和5空T载o气rr (第1 & 2级) (He)被去除
雾化室
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API接口：Z-Spray 接口
毛细管喷口
取样锥孔
可清洗的金 属挡板
萃取锥孔
RF六极杆 －离子桥
双正交采样技术可避免污染及提高灵敏度
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MKII:LCMS接口技术的新突破
Diphenhydramine in 10mM Phosphate Buffer
填充柱 LC, 1 mL/min
~50,000
*为了保持 3 x 10-6 torr (4 x 10-6 mbar)的真空
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接口
EI电离源的液质联用接口-热束接口(TB) 雾化, 去溶剂然后电离
ESI和APCI接口- Z Spray 雾化，去溶剂和电离同时完成
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LC/MS 系统构成
EI电离源
样品引入
液质联用接口
至 真空
离子源
质量分析器 检测器
高真空部分
API电离源
样品引入
离子源
液质联用接口 至
真空
质量分析器
检测器
高真空部分
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传统的样品电离方式：EI源
灯丝 -
挡板
+
M
样品进入
-
离子去
·分析器
(Atmospheric Pressure Chemical Ionization - APCI)
相转化过程
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什么是电喷雾电离(ESI)？
毛细管+4kV
2)
--+ -
+ -
+
+
+ - ++
--+ -
+ -
+
+
+ + -+
1) 含各种离子
的液滴
随着液滴的挥发,电荷密度增大, 离子集中到液滴表面
集电极 离子聚 焦透镜
EI源：电子轰击电离源 可得 经典的质谱谱图
可查询质谱库，质谱结果可用 工业标准谱库检索，是绝对的 化合物鉴定
相对易得，耐受性好
谱图可解析，阐明结构信息
但是，电离效率较差，测定的 分子量范围、流速范围有限； 可测的化合物类型有限
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EI源LC/MS系统：Waters Integrity 系统
Inj. # 1 Inj # 509 >25Hrs.
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液质联用技术的应用范围
100,000
生
Electrospray
物 大
分
子
分子量
Particle Beam GC
APcI
0 共价型
极性
注意座标：不是化合物种类的数量！