Bio-Plex 核酸偶联操作手册

Bio-Plex核酸偶联操作手册
1，原理介绍
Bio-plex液相悬浮芯片系统提供了多达100种的羧基微球，用户可以自己偶联探针或蛋白，用于检测目标核酸或蛋白。

本手册介绍的是核酸偶联的操作步骤。

核酸的偶联需要首先合成2种寡聚核苷酸片断，分别是
1，捕获探针：一段带有5’氨基修饰的C6或C12手臂的寡核苷酸。

这段序列需要与待检测的序列反向互补。

Note：关于究竟用C12 还是用C6作为手臂，有人认为C12 会提供更好的结果，但是也有人认为两者之间并没有什么差异；但是没有人认为C12 会得到不好的结果，所以用C12做手臂是一种比较安全的选择。

2，验证探针：一段带有5’生物素标记的片断，序列与捕获探针反向互补。

这段序列用于验证偶联的效率。

如下图所示，列出了捕获探针和验证片断的例子：
表1，捕获探针和验证探针示意（序列按照5’-3’的方向）
下图是整个偶联过程的示意图：
2.0材料
2.1寡核苷酸，如Biosearch Technologies或者Integrated DNA Technologies；
2.2 微球偶联所需试剂
√试剂供应商/货号数量
1.5ml离心管USA Scientific 1415-2500 多个
EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐）Pierce 77149 2X10mg （一次
偶联所需）
血球计数器VWR 15170-172 1
MES （2-吗啉乙磺酸）Sigma M2933 25g
5N NaOH Fischer SS256-500 500ml
Tween 20 Sigma P9416 50ml
SDS，10% 溶液Sigma L4522 100ml
TE buffer，pH8.0，100X Sigma T9285 100ml
2.3 杂交检测所需试剂
√试剂供应商/货号数量
Sarkosyl（N-月桂酰肌氨酸）Sigma L9150 50g
5M TMAC（四甲基氯化铵）Sigma T3411 500ml
链霉亲和素-藻红素（SA-PE），1mg/ml Prozyme PJ31S 1mg
3.0 微球偶联
以下是微球偶联过程中所需的试剂，按照下表列出的数量，然后加分子生物学级的水至250ml的体积。

0.1M MES pH4.5 （偶联缓冲液），250ml
试剂目录号终浓度每250ml所需量MES Sigma M2933 0.1 M 4.88g 调整pH至4.5，0.22um的膜过滤除菌，4度保存。

0.02% Tween 20 （清洗缓冲液I），250ml
试剂目录号终浓度每250ml所需量Tween 20 Sigma P9416 0.02% 50ul
0.22um的膜过滤除菌，室温保存
0.1% SDS （清洗缓冲液II），250ml
试剂目录号终浓度每250ml所需量SDS，10% Sigma L4522 0.1% 2.5ml
0.22um的膜过滤除菌，室温保存
TE，pH8.0 （样品稀释液），250ml
试剂目录号终浓度每250ml所需量
TE buffer，pH8.0，100X Sigma T9285 1X 2.5ml
0.22um的膜过滤除菌，室温保存
4.0 杂交验证
以下试剂用于验证杂交效率。

按照所列出的体积混合所需试剂，在需要水的地方，请使用分子生物学级的水。

20% Sarkosyl，250ml
试剂目录号终浓度每250ml所需量Sarkosyl Sigma L9150 20% 50g
H2O 250ml终体积
0.22um的膜过滤除菌，室温保存
1.5XTMAC杂交缓冲液（稀释微球），500ml
试剂目录号终浓度每500ml所需量
5M TMAC Sigma T3411 4.5 M 450ml
20% Sarkosyl Sigma L9150 0.15% 3.76ml
1M Tris-HCl，pH8.0 Sigma T3038 75mM 37.5ml
0.5M EDTA，pH8.0 Gibco 15575-038 6mM 6ml
H2O 2.74ml
室温保存
1XTMAC杂交缓冲液（杂交液），250ml
用83ml水稀释167 ml 1.5X TMAC
试剂来源每500ml所需量
1.5XTMAC 见上167ml
H2O 83ml
室温保存
5.0 微球偶联步骤
5.1 重要提示
1，不要用TE悬浮氨基偶联的微球。

2，EDC非常易于吸潮，而且一旦与水接触后很快失去活性。

所以一定要防止EDC变潮。

瓶子刚从冰箱拿出来，没有恢复到室温的时候不要打开。

3，偶联的过程反应迅速，所以每一管加了EDC之后要立刻混匀。

4，微球应该尽可能得避光。

在孵育或者每个步骤之间放置的过程中，尽量避光以防止荧光淬灭。

可以用锡箔纸。

5，为了防止破坏沉淀，尽量不要用顶端太锐利的枪头，或者用凝胶点样专用枪头。

6，
5.2 准备
1，按照0.1nmol/l的浓度用水稀释探针。

2，确保已经准备好了第二页所列出来的全部材料；
3，确保已经准备好了第三页中所列出的全部试剂；
4，按照下表确定反应体积。

表2，反应体积
微球体积样品数量
100ul ~200
200ul ~400
400ul ~800
1ml ~2，000
5ml ~10，000
10ml ~20，000
2，如果使用的体积不是表中标出的部分，请根据表格中的数据调整体积。

3，在实验开始前，取2份新鲜的EDC粉末，使之恢复到室温。

（大概需要30-60分钟）
5.3 微球偶联步骤
1，蜗旋仪上以最高转速悬浮微球，然后在超声清洗仪上超声微球30s；
2，取400ul微球到USA scientific离心管中。

3，1-2分钟最高转速离心；
4，弃上清，用45ul 0.1M，pH4.5 的MES重悬微球，彻底蜗旋，使微球分散。

5，加入2ul探针。

6，制备新鲜的EDC溶液（10mg/ml），加入2.5ul EDC至微球中，彻底混匀。

7，室温黑暗推荐下孵育30min。

8，制备新鲜的EDC溶液（10mg/ml），加入2.5ulEDC至微球中，彻底混匀。

9，室温黑暗条件下孵育30min。

10，加入1ml 0.02% Tween 20，稍微蜗旋混匀。

11，最高转速离心1-2min。

12，弃上清，用0.1%SDS重悬沉淀40s。

13，最高转速离心1-2min。

14，用80ul pH8.0 TE buffer 重悬沉淀。

15，蜗旋仪上最高转速蜗旋30s。

16，4℃ 黑暗条件下储存。

表3，以上步骤所需的体积。

根据微球的体积确定每部所需的体积
微球体积pH4.5 0.1M MES 探针（0.1nmol/ul）EDC（10mg/ml）TE
100ul 8.5ul 1ul 0.5ul 20ul
200ul 22ul 2ul 1.25ul 40ul
400ul 45ul 2ul 2.5ul 80ul
1，000ul 37ul 10 ul 2.5ul 200ul
5ml 22ul 25ul 2.5ul 1，000ul
10ml 44ul 40ul 5ul 2，000ul
5.4 微球计数
通过计算微球的数量来估算微球的回收率。

每孔至少要有40，000个微球。

通过血球计数器来计算偶联微球的数量。

1，在蜗旋仪上重悬微球，40s。

2，用双蒸水按照1：100的比例稀释微球。

3，彻底混匀。

4，取10ul转移到血球计数器中（图2）。

5，数位于血球计数器4个角落里的微球的数量。

6，微球的浓度（微球/ul）=（4个角落里微球的数量之和）X2.5X100。

图1，血球计数器的示意图
图2，加样到细胞计数器中。

图3，细胞计数器的4个角落示意图。

6.0 检测杂交效率
偶联好了之后就需要检测偶联的效率。

如果偶联反应做的比较好，加入验证探针与否会对MFI值带来很大的变化。

6.1 准备工作微球混合物
A．准备第5页中的缓冲液。

B．按照下面的描述准备工作微球混合物（够30个孔所需）。

选择合适的寡核苷酸偶联的微球。

在蜗旋仪上混匀每种微球（40s，6-7级的转速），然后制备工作微球混合物：
1.加入660ul 1.5XTMAC杂交缓冲液（稀释微球）；
2.加入约150，000个偶联好了的微球到混合物中。

按照以下公式进行：B=微球的浓度；
V=每种微球混合物所需的体积
150，000/B=V
3．加入双蒸水至终体积为990ul。

4. 冰上放置。

（不要使之结冰）。

C. 制备验证探针
在实验当天准备新鲜稀释的验证探针。

最后每个寡核苷酸片断的浓度应该为10fmol/ul。

1，起始液的浓度为1nmol/ul （1mM）。

2，按照表4所列，取4ul寡核苷酸片断加入到pH 8.0 的TE中（即按照1：250稀释）。

这时得到的浓度为4pmol/ul。

3，充分混匀。

4，取2.5ul该溶液到997ul pH8.0 的TE中（1：400稀释）。

这时的浓度为10fmol/ul。

5，彻底蜗旋混匀。

6，放置在冰上。

表4 ：所需TE的体积
6.2 检测杂交效率
1. 在蜗旋仪上混合工作微球30s。

2. 在标准PCR管中，加入33ul微球的混合物。

3. 在每个管中分别加入验证探针和TE到每一行的前3个孔中（按照12页所示的方式做板）。

4.反复吸打每个管，充分混匀。

5.盖上板子，以防止蒸发，95-100度加热5分钟。

用类似于Microseal B粘贴膜。

6.在脱色摇床上孵育杂交液15分钟（第一次用比所计算的退伙温度低5-10度）。

7.准备新鲜制备的用1XTMAC溶解的3ug/ml的SA-PE。

a.3ml 1XTMAC
b.9ul 1mg/ml 的Strep-R-PE
Note：需要事先把滤板预热到退火温度。

8.把样品加入预热了的滤板中。

用真空抽滤装置快速得把杂交缓冲液抽走。

（25-50 mm Hg）
9.加入100ul报告激光混合物到每个孔中。

反复吸打混匀。

10.室温孵育5min。

11.根据Bioplex使用说明书分析荧光值。

（做板以及设定标准品
）
做板以及设定标准品）
主要的软件分析步骤（
7．主要的软件分析步骤
在运行之前按照下列描述做板。

7.1 做板
7.2 设置标准品
按照下图设置标准品的信息
7.3 运行后修改板子的模式和标准品的信息
如果在设置的时候忘记了设定标准品的信息或者板子的设定出现了错误可以在运行之后再做修改。

运行之后修改板子的模式：
运行之后修改标准品的信息
7.4 显示结果
设定标准曲线的目的不是为了产生一个标曲，而是为了分析饱和浓度，评价背景，以及分析样品的浓度。

按照以下描述进行设定
A．回归方式：Point to point （Semi-log）
B．X Y轴的转换：线对线
8. 对结果的解释
仔细分析结果以去认以下几点：
1，空白中的信号要相对很低。

2，在空白对照和含有探针的孔之间的信号区别要非常大。

3，在较低的不同稀释浓度下的信号要有较好的线性。

4，在较高的浓度时会看到饱和。

5，记录下较低标准的浓度，作为以后偶联的基准。

表5 列出了标准杂交反映的试验结果。

需要注意以上提到的几点。

表6是存在不同的几个
问题的试验。

原因在表中已经标出。

表5：标准试验的结果
表6 ：有问题的试验结果
9.0 解决的方法
偶联效果不好
1，检查所用的EDC，用新的EDC重复做偶联。

2，确保EDC未受潮。

3，检查寡核苷酸的质量和浓度。

跑PAGE胶或者用260nm的吸光值进行检测。

4，检查偶联buffer的pH。

应该是4.5。

即使有很小的区别也会造成很大的影响。

高背景
1，检查杂交的温度。

2，确保杂交缓冲液的去除是在杂交温度下进行的（滤板一定要提前的杂交温度下预热）3，加入报告激光的混合物之前用预热好的杂交缓冲液再洗一遍微球。

4，用高严谨度的洗液（0.2XSSC）。

一般除非在很复杂的生物样品的情况下才会用到这种办法。

探针的错配
1，检查捕获和验证探针的序列。

2，检查所有的探针序列之间可能存在的交叉反应。

信号太低
1，SA-PE是热不稳定性的。

如果在过高的温度下加热过长的时间会造成信号的降低。

2，不同供应商之间的SA-PE的质量存在较大的差异。

尽管许多厂家的SA-PE都可以得到满意的结果，表中所推荐的供应商是最佳的。

3，也可能是因为制作生物素标记的探针时出了问题，这种问题尽管出现的概率较低但是也不是说完全没有可能。

10 其他信息
10.1 EDC
EDC一旦与水接触之后会很快得降解。

为了更加经济得使用，可以分装成小份储存。

但是即使分装了之后使用时也应该尽量避免受潮。

每份独立储存在-20度，一旦受潮立即弃掉。

10.2 计数微球
使用数量一致的微球是获得最大的信号，灵敏度和检测结果的首要条件。

虽然一些试验并不需要如此复杂的稀释。

但是在最开始的时候正确的计数微球是长期获得稳定结果的一项值得去做的事情。

如果需要非常精确的控制微球的数量，可以使用流式细胞仪。

10.3 脱色摇床vs温度循环仪
孵育可以在PCR仪上进行，但是在脱色摇床上进行以维持微球的悬浮状态对于提高分析的结果尤其是灵敏度很有帮助。

10.4 交叉反应
交叉反应最好是把每一个验证探针分别加入到任何一种微球中，然后确认不会得到或得到很低的信号。

如果需要放大，请确认每种试剂放大的比例是否正确。

10.5 标准曲线
为了真实得衡量反应的结果，最好是把验证探针按照不同的比例进行稀释，同时样品也进行相应的不同比例的稀释。

如果需要放大，请确认每种试剂放大的比例是否正确。

10.6 优化灵敏度
通过降低终反应体系中微球的数量以及偶联过程中的寡核苷酸的浓度都可以优化灵敏度。

降低微球的浓度可以降低目标分子杂交的表面积。

这样的浓度可以使同样数量的标记物偶联到较少的微球上，但是会增加阅读的时间。

降低偶联过程中寡核苷酸的浓度可以降低与每个微球结合的寡核苷酸的数量。

试验表明尽管总体的信号降低了，但是信噪比得到了提高。

这样可以提高灵敏度，但是会减小动态范围。

11.0工作微球混合物计算表
B V
微球浓度（数量/ul）每种微球需要的体积微球名称（分析物）15，000÷微球数=
如果要用到30种以上的微球，最好计算一下加入到1.5X的TMAC中的微球的体积。

在这个步骤中，微球的体积不是非常的关键。