Bio-Plex 核酸偶联操作手册

Bio-Plex核酸偶联操作手册

1，原理介绍

Bio-plex液相悬浮芯片系统提供了多达100种的羧基微球，用户可以自己偶联探针或蛋白，用于检测目标核酸或蛋白。本手册介绍的是核酸偶联的操作步骤。

核酸的偶联需要首先合成2种寡聚核苷酸片断，分别是

1，捕获探针：一段带有5’氨基修饰的C6或C12手臂的寡核苷酸。这段序列需要与待检测的序列反向互补。

Note：关于究竟用C12 还是用C6作为手臂，有人认为C12 会提供更好的结果，但是也有人认为两者之间并没有什么差异；但是没有人认为C12 会得到不好的结果，所以用C12做手臂是一种比较安全的选择。

2，验证探针：一段带有5’生物素标记的片断，序列与捕获探针反向互补。这段序列用于验证偶联的效率。

如下图所示，列出了捕获探针和验证片断的例子：

表1，捕获探针和验证探针示意（序列按照5’-3’的方向）

下图是整个偶联过程的示意图：

2.0材料

2.1寡核苷酸，如Biosearch Technologies或者Integrated DNA Technologies；

2.2 微球偶联所需试剂

√试剂供应商/货号数量

1.5ml离心管USA Scientific 1415-2500 多个

EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐）Pierce 77149 2X10mg （一次

偶联所需）

血球计数器VWR 15170-172 1

MES （2-吗啉乙磺酸）Sigma M2933 25g

5N NaOH Fischer SS256-500 500ml

Tween 20 Sigma P9416 50ml

SDS，10% 溶液Sigma L4522 100ml

TE buffer，pH8.0，100X Sigma T9285 100ml

2.3 杂交检测所需试剂

√试剂供应商/货号数量

Sarkosyl（N-月桂酰肌氨酸）Sigma L9150 50g

5M TMAC（四甲基氯化铵）Sigma T3411 500ml

链霉亲和素-藻红素（SA-PE），1mg/ml Prozyme PJ31S 1mg

3.0 微球偶联

以下是微球偶联过程中所需的试剂，按照下表列出的数量，然后加分子生物学级的水至250ml的体积。

0.1M MES pH4.5 （偶联缓冲液），250ml

试剂目录号终浓度每250ml所需量MES Sigma M2933 0.1 M 4.88g 调整pH至4.5，0.22um的膜过滤除菌，4度保存。

0.02% Tween 20 （清洗缓冲液I），250ml

试剂目录号终浓度每250ml所需量Tween 20 Sigma P9416 0.02% 50ul

0.22um的膜过滤除菌，室温保存

0.1% SDS （清洗缓冲液II），250ml

试剂目录号终浓度每250ml所需量SDS，10% Sigma L4522 0.1% 2.5ml

0.22um的膜过滤除菌，室温保存

TE，pH8.0 （样品稀释液），250ml

试剂目录号终浓度每250ml所需量

TE buffer，pH8.0，100X Sigma T9285 1X 2.5ml

0.22um的膜过滤除菌，室温保存

4.0 杂交验证

以下试剂用于验证杂交效率。按照所列出的体积混合所需试剂，在需要水的地方，请使用分子生物学级的水。

20% Sarkosyl，250ml

试剂目录号终浓度每250ml所需量Sarkosyl Sigma L9150 20% 50g

H2O 250ml终体积

0.22um的膜过滤除菌，室温保存

1.5XTMAC杂交缓冲液（稀释微球），500ml

试剂目录号终浓度每500ml所需量

5M TMAC Sigma T3411 4.5 M 450ml

20% Sarkosyl Sigma L9150 0.15% 3.76ml

1M Tris-HCl，pH8.0 Sigma T3038 75mM 37.5ml

0.5M EDTA，pH8.0 Gibco 15575-038 6mM 6ml

H2O 2.74ml

室温保存

1XTMAC杂交缓冲液（杂交液），250ml

用83ml水稀释167 ml 1.5X TMAC

试剂来源每500ml所需量

1.5XTMAC 见上167ml

H2O 83ml

室温保存

5.0 微球偶联步骤

5.1 重要提示

1，不要用TE悬浮氨基偶联的微球。

2，EDC非常易于吸潮，而且一旦与水接触后很快失去活性。所以一定要防止EDC变潮。瓶子刚从冰箱拿出来，没有恢复到室温的时候不要打开。

3，偶联的过程反应迅速，所以每一管加了EDC之后要立刻混匀。

4，微球应该尽可能得避光。在孵育或者每个步骤之间放置的过程中，尽量避光以防止荧光淬灭。可以用锡箔纸。

5，为了防止破坏沉淀，尽量不要用顶端太锐利的枪头，或者用凝胶点样专用枪头。

6，

5.2 准备

1，按照0.1nmol/l的浓度用水稀释探针。

2，确保已经准备好了第二页所列出来的全部材料；

3，确保已经准备好了第三页中所列出的全部试剂；

4，按照下表确定反应体积。

表2，反应体积

微球体积样品数量

100ul ~200

200ul ~400

400ul ~800

1ml ~2，000

5ml ~10，000

10ml ~20，000

2，如果使用的体积不是表中标出的部分，请根据表格中的数据调整体积。

3，在实验开始前，取2份新鲜的EDC粉末，使之恢复到室温。（大概需要30-60分钟）

5.3 微球偶联步骤

1，蜗旋仪上以最高转速悬浮微球，然后在超声清洗仪上超声微球30s；

2，取400ul微球到USA scientific离心管中。

3，1-2分钟最高转速离心；

4，弃上清，用45ul 0.1M，pH4.5 的MES重悬微球，彻底蜗旋，使微球分散。

5，加入2ul探针。

6，制备新鲜的EDC溶液（10mg/ml），加入2.5ul EDC至微球中，彻底混匀。

7，室温黑暗推荐下孵育30min。

8，制备新鲜的EDC溶液（10mg/ml），加入2.5ulEDC至微球中，彻底混匀。

9，室温黑暗条件下孵育30min。

10，加入1ml 0.02% Tween 20，稍微蜗旋混匀。

11，最高转速离心1-2min。

12，弃上清，用0.1%SDS重悬沉淀40s。

13，最高转速离心1-2min。

14，用80ul pH8.0 TE buffer 重悬沉淀。

15，蜗旋仪上最高转速蜗旋30s。

16，4℃ 黑暗条件下储存。

表3，以上步骤所需的体积。根据微球的体积确定每部所需的体积

微球体积pH4.5 0.1M MES 探针（0.1nmol/ul）EDC（10mg/ml）TE

100ul 8.5ul 1ul 0.5ul 20ul

200ul 22ul 2ul 1.25ul 40ul

400ul 45ul 2ul 2.5ul 80ul

1，000ul 37ul 10 ul 2.5ul 200ul

5ml 22ul 25ul 2.5ul 1，000ul

10ml 44ul 40ul 5ul 2，000ul