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细胞表面分子或抗原分析
荧光素标记的单克隆抗体结合于细 胞表面特异的抗原或分子，经过 （或不）溶血后，上机检测相应抗 原的表达率和荧光强度。
细胞内分子或抗原分析
膜渗透剂作用于细胞，细胞膜通透性增强，荧光 素和特异性抗体进入细胞内与特异性抗原或分子 结合，经过流式细胞仪检测胞内抗原的表达率和 荧光强度。
细胞核的特征性改变
1. 细胞核的改变 2. 光散射特性
凋亡检测 Annexin V-PI双标记
坏 死 的 形 态 学 变 化
凋 亡 的 形 态 学 变 化
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早 期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一 是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞 膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带 负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面， 在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的
凋亡早期 细 胞 内 钙 离 子 动 员
激 活
CASPASE
凋亡中期
凋亡晚期
脱水致细胞皱缩
核染色质凝缩
线粒体膜电位丧失
凋 亡
小
细胞膜PS外翻
体
形
核碎片形成
成
DNA被切割成低分子量 片断
细胞内酸化
细胞周期分析---异倍体与凋亡峰
基本原理
主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚 细胞和分子水平上所发生的特征性改变。 这些改变包括细胞核的改变、细胞器的 改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的 改变等，其中细胞核的改变最具特征性。
对于固定标本
根据不同的实验目的选择不同的固定剂。最常用的 是4%的甲醛固定15分钟。适用于各类蛋白质的检测 。
70%冰乙醇，用于细胞周期分析的标本固定 60%的酸性丙酮PH4.2，固定10分钟。适用于血及 骨髓标本磷酸酶和酯酶的检测。
固定完全的标本，可以转运和存放。
对于需要作膜标记而送检又较远的标本
1936 年 Caspersson 等引入显微光度术 1940 年 Coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 1947 年 Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器 1949 年 Wallace Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法的专利 1950 年 Caspersson 用显微分光光度计的方法在UV 和可见光光谱区检测 细胞
（加二抗） 溶血：溶血剂的选择（市售、氯化氨、草酸氨） 检测：
免疫标记（细胞浆内)的样本处理
先将细胞膜“打孔” ----破膜
破膜剂的选择：Triton 皂素 毛地黄毒甙
按前述方法进行标记
细胞周期分析的样本处理 传统方法： 单细胞悬液（如全血，则需分离单个核细胞） 冰乙醇固定过夜 洗涤细胞 加复合染液（Triton，RNA酶、PI） 20--30分钟后上机检测
免疫荧光分析的意义：
流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细 胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受 体进行定量检测，成为临床检验的一项重 要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达 不同抗原位点的细胞群区分开来，而且还 能进一步区分各细胞亚群。对于造血系统 疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、 治疗及预后评估都起了重要作用。
检测信号 光学信号 放大方式 PMT，放大电路
统计 结果
计算机，>5000 多参数，综合分析
自然光、灯光、氙(汞)灯
细胞、生物粒子 载(盖)玻片 形态及染色
目镜X物镜
人工，200 简单，单参数
流式细胞仪组成
Cytometer Workstation Power Supply
流式细胞仪主机 流式细胞仪工作站 电源箱
Single Parameter Histogram
Dual Parameter Histograms
3-D Histograms
免疫荧光分析
细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的 荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合 物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到 细胞群的不同抗原位点表达情况。
800
1000
2N
4N
PI Fluorescence
DNA倍体性Ploidy：细胞内染色体DNA含量
二倍体Diploid：正常体细胞内染色体DNA含量
DNA指数（DI）：测定标本的G0/G1期细胞DNA含 量与同种系正常细胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值， 表示细胞倍体性
S期含量SPF：S期细胞占总周期细胞的比例
统计：计算机
综合三个系统的功能:
液流系统:将细胞依序送到测量区受检。 光学系统:产生并收集荧光、光散射等信 号。 电子系统:
将光学信号转换成电子信号。 分析所输出的电流讯号，以脉冲高度、宽度、
积分面积显示。 量化讯号并传至电脑。
流式细胞仪的分选原理
流式细胞仪主要技术指标
1．流式细胞仪的分析速度 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度 4．流式细胞仪的分辨率 5．流式细胞仪的分选速度
1953 年 Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理成功的设计红细胞光学自动 数器
同年Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置成为流式细胞仪的雏形
1954 年 Beirne 和Hutcheon 发明光电粒子计数器
1959 年 B 型Coulter 计数器
1965 年 Kamemtsky 等提出两个设想一是用分光光度计定量细胞 成分二是结合测量值对细胞分类
FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物 学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平 的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提 供了精密、准确的方法和仪器.
流式细胞仪的发展史
1930 年 Caspersson 和Thorell 开始致力于细胞的计数 1934 年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光 电仪记录流过一根毛细管的细胞
流式细胞仪的
FLOW CYTOMETER
原理及应用
BECKMEN-Coulter Epics XL 流式细胞分析仪
流式细胞术
流式细胞术是利用流式细胞仪检测 细胞或其它颗粒性物质的物理、化学特 性。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计 数原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗 技术以及计算机技术的发展,大大提高了 检测速度与统计精确性,而且从同一个细 胞中可以同时测得多种参数,为生物医学 与临床检验学发展提供了一个全新的视 角和强有力的手段。
1972 年 Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型能够检测出 经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号
1975 年 Kohler 和Milstein 提出了单克隆抗体技术为细胞研究中大 量的特异的免疫试剂
流式细胞仪与显微镜
FLOW
MICROSCOPE
光源
激光
对象 细胞、生物粒子
承载工具 鞘液及流动室
机械法、酶法
对于要作胞浆内检测的标本，先固定，然后 可长时间的保存。但标本的保存时间要取决于抗原 的种类及染色的方法。
虽然标本可以保存一定时间， 但有条件应立 即送检。因为死亡细胞会增加结果分析的难度。
标本的转运
新鲜血液和骨髓标本 抗凝新鲜血液和骨髓标本在室温条件下（注意不能低 于100C或高于370C），且在储存时限以内，可以不作 任何处理直接转运。但转运途中要注意不能剧烈震荡 ，以免溶血。
作膜标记一般需要保持细胞的活力，故需 要 Ficoll分离单个核细胞。然后加入1640完 培，
并含DMSO，置液氮或 -700C转运。
标本的制备
免疫标记（膜表面)的样本处理 保证单细胞悬液：组织标本采用机械法、酶法。
300目尼龙网过滤
调整细胞浓度：2~5X106/ml， 标记：取100ul样本 + 适量抗体 孵育：室温避光20分（或根据抗体说明）
常用荧光染料介绍
荧光染料 FITC PE(RD1) ECD PE-CY5 PI 7AAD PE-CY7
激发波长 发射波长
488nm
525nm
488nm
575nm
488nm
610nm
488nm
675nm
488nm
620nm
488nm
675nm
488nm
755nm
用途 免疫标记 免疫标记 免疫标记 免疫标记 DNA分析 区分死细胞 免疫标记
细胞DNA 分析的意义：
DNA含量是随细胞增殖分裂周 期各时相的变化而变化的。
DNA含量正常与否以及各阶段细胞 分化情况，可作为了解肿瘤恶化程 度和预后的重要参考。
细胞周期
G0期： DNA合成静止期 G1期： DNA合成前期 S期： DNA合成期 G2期： DNA合成后期 M期： 细胞分裂期
DNA倍体
标本是否合格 凝集、溶血、量太少或骨髓
穿刺液无骨髓小粒均为不合格
标本的处理
标本的抗凝及存放时间 肝素抗凝的外周血和骨髓标本，在室温的条件下 （160C-250C），储存时限为48-72小时。EDTA 抗凝的标本，室温下储存时限只有12-24小时。 ACD抗凝的外周血，室温下储存时限可达72小时 ACD不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝。 组织细胞的处理：
1967 年 Kamentsky 和Melamed 在Moldaven 的方法的基础上提出 细胞分选的方法
1969 年 Van Dilla Fulwyler 及其同事们在Los Alamos NM(即现在 的National Flow
Cytometry Resource Labs)发明第一台荧光检测细胞计
体液中可溶性分子的检测
•细胞微球试验 ：使用一系列荧光微球捕捉样 品中存在的多种可溶性蛋白，通过流式细胞 仪进行快速和灵敏的定量检测 •标本：血清、血浆、培养液、其他体液
标本处理
1，标本的获取 2，标本的处理 3，标本的转运 4，样本的制备
标本获取
常规标本来源 外周血和骨髓穿刺液 培养细胞 组织(实体瘤、脾、肝……)
2N 2N 2N~4N 4N 4N
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
sቤተ መጻሕፍቲ ባይዱG2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
DNA Analysis
300
22 5
15 0
Counts
75
0
0
200
400
600
二、流式细胞仪的应用
细胞生物学 临床免疫学 临床血液学 临床肿瘤学 血栓与止血 骨髓和器官移植
(一) FCM在细胞生物学中的应用
检测细胞的结构组成：大小、粒度、DNA含量、 RNA 含量、蛋白质含量等。 检测细胞功能：细胞表面及胞内抗原、细胞因子 等。
细胞DNA分析原理
利用特殊的荧光染料 (PI、EB、AO等) 与细 胞内DNA碱基结合，被 荧光染料染色的细胞 在激光照射下发射出 荧光，荧光强度与DNA 含量成正比。流式细 胞仪通过测定细胞的 荧光强度推算出细胞 的DNA含量
不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。
Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最 初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋 白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特 性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充 当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。 PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发 生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别 是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞 坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。 因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜 表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验 以检测细胞膜的完整性的检测方法。
增殖指数PI：增殖细胞占总周期细胞的比例
G0/G1期细胞DNA含量变异系数CV
细胞凋亡的FCM检测
Annexin Ⅴ- PI
APO2.7蛋白 DNA含量变化 TUNEL bcl-2 P53 Fas及FasL Caspase
(半胱氨酸蛋白酶)
与细胞凋亡有关的疾病
启动 凋 亡 启 动
BC公司DNA-Prep试剂 溶血（如需要） 固定染色一步完成 20分钟后上机检测
FCM是依据相对荧光量来反映所测定的物质。因此，测定时 相应的对照管是必不可少的。
细胞免疫功能受多种生理病理因素影响很大，下结论时应结合 临床
选择抗体时要遵循以下原则：选择亲和力高的抗体；由于不同 的单克隆抗体针对的抗原表位不同，应该选用合适克隆的抗体； 由于抗原分子的表达程度不同，应选用合适的荧光标记，尤其 是对于表达弱的抗原，应用强的荧光素标记；注意抗原表达在 不同品系的差异，尤其是针对动物抗原。
一、流式细胞仪的基本原理 二、流式细胞仪的应用 三、几种常用的流式检测方法
一、流式细胞仪的基本原理
流式细胞仪构造
流路
流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
光路
光源 滤片 光电倍增管PMT HV
电路
放大电路HV及GAIN 增益
A/D转换：不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的 过程